1.一種檢測鑒別豬臍帶血中豬瘟病毒野毒株與疫苗株的雙重實時熒光RT-PCR試劑盒,其特征在于,該試劑盒包括擴增引物和特異性熒光探針,所述擴增引物和特異性熒光探針的序列如下所示:
上游擴增引物CSFV-F:5’-GCCATGCCCATAGTAGGA-3’,其為SEQ ID NO:1序列;
下游擴增引物CSFV-R:5’-CTACTGACGACTGYCCTGTA-3’,其為SEQ ID NO:2序列,其中Y=C/T;
特異性熒光探針CSFV-LV:VIC-5’-TGGCTAGTCCCTCCGTTTTGC-3’-BHQ1,其為SEQ ID NO:3序列,其中VIC為熒光報告基團,BHQ1為非熒光淬滅基團;
特異性熒光探針CSFV-Wt:FAM-5’-ACGGCTAGTCCCTCCGTTTG-3’-BHQ1,其為SEQ ID NO:4序列,其中FAM為熒光報告基團,BHQ1為非熒光淬滅基團。
2.根據(jù)權利要求1所述的檢測鑒別豬臍帶血中豬瘟病毒野毒株與疫苗株的雙重實時熒光RT-PCR試劑盒,其特征在于,所述上游擴增引物CSFV-F、所述下游擴增引物CSFV-R、所述特異性熒光探針CSFV-LV和所述特異性熒光探針CSFV-Wt的摩爾比為2:2:1:1。
3.根據(jù)權利要求2所述的檢測鑒別豬臍帶血中豬瘟病毒野毒株與疫苗株的雙重實時熒光RT-PCR試劑盒,其特征在于,所述上游擴增引物CSFV-F、所述下游擴增引物CSFV-R、所述特異性熒光探針CSFV-LV和所述特異性熒光探針CSFV-Wt在所述試劑盒中的終濃度均為0.2~0.8μM。
4.根據(jù)權利要求1所述的檢測鑒別豬臍帶血中豬瘟病毒野毒株與疫苗株的雙重實時熒光RT-PCR試劑盒,其特征在于,所述試劑盒還包括陰性對照、陽性對照、2×熒光RT-PCR反應液;所述2×熒光RT-PCR反應液中含有UNG酶系統(tǒng)。
5.根據(jù)權利要求4所述的檢測鑒別豬臍帶血中豬瘟病毒野毒株與疫苗株的雙重實時熒光RT-PCR試劑盒,其特征在于,所述陰性對照為無DNA酶的ddH2O;所述陽性對照為克隆有豬瘟病毒野毒株(Shimen)基因組5’-UTR片段和兔化弱毒疫苗株(HCLV)基因組5’-UTR片段的克隆質(zhì)粒pEASY-5UTR2,克隆質(zhì)粒pEASY-5UTR2的終濃度為1.0×105copies/μl~1.0×107copies/μl。
6.根據(jù)權利要求5所述的檢測鑒別豬臍帶血中豬瘟病毒野毒株與疫苗株的雙重實時熒光RT-PCR試劑盒,其特征在于,所述豬瘟病毒野毒株(Shimen)基因組5’-UTR片段和所述兔化弱毒疫苗株(HCLV)基因組5’-UTR片段的核苷酸序列分別如SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6所示。
7.根據(jù)權利要求6所述的檢測鑒別豬臍帶血中豬瘟病毒野毒株與疫苗株的雙重實時熒光RT-PCR試劑盒,其特征在于,所述克隆質(zhì)粒pEASY-5UTR2采用以下方法制備得到:利用SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示的引物分別擴增豬瘟病毒野毒株(Shimen)基因組5’-UTR片段和兔化弱毒疫苗株(HCLV)基因組5’-UTR片段,通過TA克隆將豬瘟病毒野毒株(Shimen)基因組5’-UTR片段和兔化弱毒疫苗株(HCLV)基因組5’-UTR片段克隆至pEASY-T1載體,篩選陽性克隆,測序正確的克隆質(zhì)粒命名為pEASY-5UTR2。
8.一種如權利要求1-7任一項所述的檢測鑒別豬臍帶血中豬瘟病毒野毒株與疫苗株的雙重實時熒光RT-PCR試劑盒的使用方法,其特征在于,包括以下步驟:
(1)使用權利要求1-7任一項所述的雙重實時熒光RT-PCR試劑盒進行擴增時,反應體系以20μL計為:
10μM SEQ ID NO:1所示的上游擴增引物:0.4~0.8μL;
10μM SEQ ID NO:2所示的下游擴增引物:0.4~0.8μL;
10μM SEQ ID NO:3所示的特異性熒光探針CSFV-LV:0.2~0.4μL;
10μM SEQ ID NO:3所示的特異性熒光探針CSFV-Wt:0.2~0.4μL;
2×熒光RT-PCR反應液:10μL;
RNA模板:2μL;
ddH2O:補足至20μL;
(2)熒光PCR反應條件為:50℃反轉(zhuǎn)錄20min;95℃預變性1min;95℃變性10Sec,60℃退火45Sec并收集熒光,共40個循環(huán);最后25℃冷卻10sec,結(jié)束反應;
(3)結(jié)果分析:
質(zhì)量控制:陰性對照FAM通道檢測無Ct值,VIC通道檢測無Ct值;陽性對照FAM通道檢測Ct值≤30,VIC通道檢測Ct值≤30;上述條件同時滿足,檢測結(jié)果有效;
結(jié)果判定:FAM通道檢測Ct值≤40,VIC通道檢測無Ct值,則判定樣品為豬瘟病毒野毒株感染陽性;FAM通道檢測無Ct值,VIC通道檢測≤40,則判定樣品為豬瘟病毒疫苗株陽性;FAM通道檢測Ct值≤40,VIC通道檢測≤40,則判定樣品同時含有豬瘟病毒野毒株和疫苗株;FAM通道檢測無Ct值,VIC通道檢測無Ct值,則判定樣品為豬瘟病毒感染陰性。
9.根據(jù)權利要求8所述的檢測鑒別豬臍帶血中豬瘟病毒野毒株與疫苗株的雙重實時熒光RT-PCR試劑盒的使用方法,其特征在于,所述RNA模板采用以下方法制備得到:
(1)取100-200μL豬臍帶血置1.5mL EP管中,加入1mL裂解液充分混勻,室溫靜置5min;
所述裂解液的成分及配比如下:①鹽酸胍4-6M;②十二烷基磺酸鈉SDS0.1-0.2%;③吐溫20 1-2%;④乙基苯基聚乙二醇NP40 1-2%;
(2)加入0.6mL異丙醇和10μL磁珠,振蕩15s,靜置2min;
(3)將EP管放入磁力架吸附1-2min,棄掉液體;
(4)加入0.5mL異丙醇,將EP管中液體輕輕混勻,室溫靜置10min;
(5)將EP管放入磁力架吸附1-2min,棄掉液體;
(6)加入1mL質(zhì)量百分比為70%的乙醇溶液,輕輕洗滌沉淀;將EP管放入磁力架吸附1-2min,棄掉液體;
(7)晾干,加入適量的DEPC H2O溶解,56℃促溶10-15min;
(8)快速電泳檢測RNA完整性。
10.權利要求1-7任一項所述的試劑盒在制備檢測鑒別豬臍帶血中豬瘟病毒野毒株與疫苗株的雙重實時熒光RT-PCR試劑中的用途。