本發(fā)明涉及煙草衰老控制領域，尤其涉及一種煙草NtNAC096基因控制煙草衰老的應用。

背景技術：

葉片衰老是葉片發(fā)育的最后一個階段。在葉片衰老過程中，葉綠素和生物大分子物質如蛋白質、脂類、核酸等被降解，葉片光合能力降低，衰老組織中的營養(yǎng)物質降解轉化后被運輸到幼嫩組織和生殖器官中供進一步生長發(fā)育或儲存。因此，葉片的衰老影響作物生長、營養(yǎng)積累和產量的形成。煙草是一種葉用經濟作物，葉面積大小和衰老成熟度直接影響到生產產量和質量。

目前，對植物衰老的控制主要集中在對植物激素的調節(jié)方面，生長素、細胞分裂素等可抑制葉片衰老，乙烯、脫落酸可促進葉片衰老；人為減緩葉片衰老進程，一方面可以通過減少衰老促進激素的合成或代謝，另一方面也可增加衰老抑制激素的合成或代謝。但是激素調節(jié)外源作用往往存在效果上的缺陷。鑒于此，利用基因控制衰老的方法開始研究，目前只有少數的煙草衰老基因被鑒定，仍有大量的植物衰老相關的基因有待研究和利用。

技術實現要素：

本發(fā)明的目的在于提供煙草NtNAC096基因控制煙草衰老的應用，能夠通過NtNAC096基因控制煙草的衰老，通過基因編輯延緩煙草的衰老，從而高效控制煙草的衰老進程。

為了達到上述目的，本發(fā)明的技術方案是:

煙草NtNAC096基因控制煙草衰老的應用，煙草NtNAC096基因的基因組DNA序列全長1203bp，其核苷酸序列如下：

其中，序列中雙下劃線標示的atg為起始密碼子，雙下劃線標示的tga為終止密碼子，單下劃線標示的部分為內含子,煙草NtNAC096基因由3個外顯子和2個內含子組成。

進一步的，煙草NtNAC096基因控制煙草衰老的應用,包括對煙草NtNAC096基因進行基因功能分析,敲除NtNAC096基因，獲得延緩衰老的煙草植株。

進一步的，煙草NtNAC096基因控制煙草衰老的應用，包括如下步驟：(1)煙草NtNAC096基因克隆，序列分析；(2)對NtNAC096基因進行表達分析；

(3)通過構建煙草NtNAC096基因過表達載體，進行煙草NtNAC096基因功能分析；(4)利用CRISPR/Cas9基因編輯技術對煙草NtNAC096基因靶位點進行設計，構建NtNAC096基因敲除載體；對煙草品種進行遺傳轉化，獲得延緩衰老的煙草植株。

進一步的，步驟(2)對NtNAC096基因進行表達分析是用qRT-PCR方法檢測NtNAC096基因在煙草不同組織和不同葉片生育時期的表達模式。

進一步的，步驟(3)構建煙草NtNAC096基因過表達載體的方法為利用clontech infusion同源重組方法將NtNAC096構建進入過表達載體pRI101-AN，構建煙草NtNAC096基因過表達載體pRI101-NtNAC096。

進一步的，步驟(3)構建煙草NtNAC096基因過表達載體后，利用農桿菌介導的浸花法侵染擬南芥得到轉基因擬南芥，進行煙草NtNAC096基因功能分析。

進一步的，步驟(4)對煙草NtNAC096基因設計兩個靶位點，人工合成加接頭序列，靶位點連接到載體pORE-Cas9上，獲得pORE-Cas9/NtNAC096載體。

進一步的，步驟(4)對煙草品種進行遺傳轉化的具體操作為：pORE-Cas9/NtNAC096載體轉化農桿菌感受態(tài)LBA4404，利用農桿菌介導的煙草葉盤轉化法對煙草進行遺傳轉化，獲得延緩衰老的煙草植株。

相對于現有的煙草衰老控制，本發(fā)明的有益效果在于:1、首次發(fā)現煙草NtNAC096基因用于控制煙草衰老；2、利用基因編輯技術能夠精確快速的利用煙草NtNAC096基因控制煙草衰老進程，通過突變該基因核苷酸序列篩選得到延緩衰老的煙草植株，在農業(yè)生產上具有十分重要的應用，對煙葉的采摘、品質控制、篩選煙草品種和提高產量都有十分顯著的影響。

附圖說明

圖1為本發(fā)明一實施例的煙草NtNAC096基因DNA序列擴增結果電泳圖；

圖2為本發(fā)明一實施例的煙草NtNAC096基因cDNA序列擴增結果電泳圖；

圖3為本發(fā)明一實施例的煙草NtNAC096基因組織表達分析；

圖4為本發(fā)明一實施例的煙草NtNAC096基因煙草葉片不同發(fā)育時期表達分析；

圖5為植物過表達載體pRI101-NtNAC096構建和驗證電泳圖；

圖6為pRI101-NtNAC096轉基因擬南芥植株鑒定和表型圖；

圖7為煙草CRISPR/Cas9轉基因陽性植株NtNAC096基因包含靶位點序列目的片段電泳圖；

圖8為轉基因煙株內源NtNAC096基因靶序列分析結果圖；

圖9為煙草NtNAC096敲除突變體表型圖。

具體實施方式

下面將對本發(fā)明實施例中的技術方案進行清楚、完整地描述，顯然，所描述的實施例僅僅是本發(fā)明一部分實施例，而不是全部的實施例?；诒景l(fā)明中的實施例，本領域普通技術人員在沒有做出創(chuàng)造性勞動前提下所獲得的所有其他實施例，都屬于本發(fā)明保護的范圍。

本發(fā)明實施例提供了一種煙草NtNAC096基因控制煙草衰老的應用，煙草NtNAC096基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，通過分析，煙草NtNAC096基因由3個外顯子和2個內含子組成。對煙草NtNAC096基因進行基因功能分析后敲除NtNAC096基因，獲得延緩衰老的煙草植株。

本發(fā)明實施例還提供了煙草NtNAC096基因控制煙草衰老的應用方法，具體包括如下步驟：

S1煙草NtNAC096基因克隆，序列分析。

本步驟以煙草基因組DNA和cDNA為模板，設計引物，擴增得到煙草NtNAC096基因的基因組DNA和cDNA，分析基因組DNA的內含子和外顯子序列。

S2對NtNAC096基因進行表達分析。

本步驟通過對煙草NtNAC096基因的表達進行分析可以獲得該基因的作用部位和作用時期。

S3通過構建煙草NtNAC096基因過表達載體，進行煙草NtNAC096基因功能分析。

本步驟中通過過表達載體的構建，利用農桿菌介導制備轉基因的擬南芥植株，在擬南芥上對該基因進行功能分析可以對煙草NtNAC096基因進行功能上的驗證，為其應用做理論準備。

S4利用CRISPR/Cas9基因編輯技術對煙草NtNAC096基因靶位點進行設計，構建NtNAC096基因敲除載體；對煙草品種進行遺傳轉化，獲得延緩衰老的煙草。

本步驟中運用基因編輯技術可以隨機的編輯煙草NtNAC096基因，再通過轉基因技術可以調控煙草的衰老，改變煙草的衰老進程，培育晚衰的煙草品種，從整體上控制煙草的衰老。

作為本發(fā)明的優(yōu)選實施例，步驟S2對NtNAC096基因進行表達分析，可以用qRT-PCR方法檢測NtNAC096基因在煙草不同組織和不同葉片生育時期的表達模式。qRT-PCR的方法高效直觀，但是可以理解的是，本領域其他的檢測基因表達的方法，例如RT-PCR、northern雜交等也可以用于上述NtNAC096基因的表達分析。

作為本發(fā)明的優(yōu)選實施例，構建煙草NtNAC096基因過表達載體的方法為利用clontech infusion同源重組方法將NtNAC096構建進入過表達載體pRI101-AN，構建煙草NtNAC096基因過表達載體pRI101-NtNAC096?？梢岳斫獾氖?，過表達載體pRI101-AN是經過篩選的針對煙草NtNAC096基因適宜的載體，其他的基因過表達載體也可以用于上述過表達載體的構建。

作為本發(fā)明的優(yōu)選實施例，利用農桿菌介導的浸花法侵染擬南芥得到T0代種子，培養(yǎng)基篩選獲得T1代陽性苗，將陽性苗自交1代并繼續(xù)篩選，最終獲得轉基因純合株系，對轉基因純合株系進行衰老表型分析和衰老指標測定。可以理解的是，其他過表達載體導入擬南芥獲得轉基因擬南芥的方法也可以用來進行上述煙草NtNAC096基因的功能驗證。

作為本發(fā)明的優(yōu)選實施例，利用CRISPR/Cas9基因編輯技術對煙草NtNAC096基因靶位點進行設計，構建NtNAC096基因敲除載體方法為，對NtNAC096基因設計兩個靶位點，人工合成加接頭序列，靶位點連接到載體上，獲得pORE-Cas9/NtNAC096載體。可以理解的是，對NtNAC096基因設計的靶位點不限于兩個，可以為多個,可以根據需要確定靶位點的數量。

作為本發(fā)明的優(yōu)選實施例，pORE-Cas9/NtNAC096載體載體轉化農桿菌感受態(tài)LBA4404，利用農桿菌介導的煙草葉盤轉化法對煙草進行遺傳轉化，獲得抗卡那霉素的T0代陽性轉化苗，收取T0代轉基因陽性種子，卡那霉素抗性平板篩選T1代，抗性苗再經PCR擴增測序篩選得到T1代純合突變體，測序，獲得延緩衰老的煙草?？梢岳斫獾氖?，其他載體導入煙草得轉基因煙草的方法也可以用來進行上述操作。

為了更清楚詳細地介紹本發(fā)明實施例所提供的煙草NtNAC096基因控制煙草衰老的應用，以下將結合具體實施例進行說明。

(一)煙草基因組DNA的提取

(1)取100mg左右的新鮮葉片放入離心管中，液氮速凍，研磨器中磨碎，加入650μL的2×CTAB提取緩沖液(提前預熱至65℃)，并且迅速混勻；(2)65℃水浴1h，期間每隔15min輕搖一次；(3)混合物冷至室溫后加入等體積的酚氯仿異戊醇(25:24:1),輕柔混勻,室溫靜置15min，4℃，12000rpm離心15min；(4)將上清轉移到新離心管中；(5)加入等體積的氯仿異戊醇(24:1)，顛倒混勻，4℃,12000rpm離心15min，將上清小心轉移到新離心管中；(6)取上清，加入等體積異丙醇，混勻，室溫放置10min，12000rpm離心15min沉淀DNA；(7)倒掉異丙醇，75％乙醇漂洗2次，最后一次漂洗后將剩余的液體盡量吸凈，真空濃縮儀干燥之后加入適量無菌水溶解DNA備用。

2×CTAB提取液配方：100mM(PH8.0)Tris.Cl，20mM(PH8.0)EDTA，1.4M NaCl,2％(w/v)CTAB，40mM巰基乙醇。

(二)煙草RNA提取:采用RNAiso Reagent(TaKaRa)常規(guī)提取。

(三)反轉錄合成cDNA：采用PrimeScript RT eagent Kit with gDNA Eraser(Perfect Real Time)(Takara，RR047A)進行。

(四)煙草NtNAC096基因克隆

設計煙草NtNAC096基因引物

Primer NtNAC096-F:TATTTCTCCCTTCTATTTATTTCCT(5’UTR區(qū))

Primer NtNAC096-R:TCACTGGTATTGAAAGGCTGG(終止密碼子位置)

PCR反應體系：

10×PCR Buffer for KOD-Plus-Neo 5μL

2mM dNTPs 5μL

25mM MgSO₄ 3μL

Primer NtNAC096-F 1.25μL

Primer NtNAC096-R 1.25μL

DNA(or cDNA)1μL

KOD-Plus-Neo 1μL

ddH₂O to 50μL

PCR反應程序：

Step1 94℃2min

Step2 98℃10s

Step3 56℃30s

Step4 68℃1min20s Step2-4 35cycle

Step5 68℃8min

以煙草紅花大金元的基因組DNA和cDNA為模板擴增，獲得1203bp大小片段，電泳結果參見圖1，cDNA電泳結果,獲得1079bp大小片段,參見圖2，右側為DL5000marker分子量標記。對基因組進行分析，該基因由3個外顯子和2個內含子組成。

(五)利用熒光定量qRT-PCR方法檢測NtNAC096基因在煙草不同組織(根、莖、幼葉、花、成熟衰老葉片等)和不同葉片生育時期(S1-S4)表達模式。

采用FastStart UniversalSYBR Green Master(ROX)Realtime試劑盒(Roche)。選用相對定量的方法，以煙草18S基因作為內參基因，模板為上述不同組織或者發(fā)育時期下得到的cDNA。每個樣品設置3個重復，同時設置陰性對照和陽性對照。

反應體系(20μL)

2×SYBR Green Master MIX 10μL

qRT-F primer(10μM)0.5μL

qRT-R primer(10μM)0.5μL

cDNA稀釋模板1μL

ddH₂O 8μL

反應體系充分混勻后放入ABI7500熒光定量PCR系統(tǒng)進行PCR反應，采用的三步法的PCR反應程序,利用2^-ΔΔCt方法確定目標基因的相對表達量。

qRT-PCR引物序列：

NtNAC096-qRT-F:TTCACGACTATTTGATGACAATGCTAAC

NtNAC096-qRT-R:TATTGGTCATTGTGTTTTGGTTGTT

18S-qRT-F:GGTCCAGACATAGTAAGGATTGACAGA

18S-qRT-R:AGACAAATCGCTCCACCAACTAAG

參見圖3、圖4，結果表明，NtNAC096基因在衰老葉片中表達量最高，其次是根組織。并且在S2期，NtNAC096基因明顯上調約1300多倍，S3期上調37.7倍。

(六)利用clontech infusion同源重組方法將NtNAC096構建進入過表達載體pRI101-AN，參見圖5。

所用植物過表達載體pRI101-AN(Takara),選用NdeI和EcoRI對pRI101-AN進行雙酶切，高保真酶擴增帶有接頭的NtNAC096基因，分別回收載體大片段和目的基因片段，利用infusion HD(clontech)無縫連接技術將目的片段連入pRI101-AN。

酶切體系：

pRI101-AN 2μg

10×Cutsmart buffer 4μL

NdeI 2μL

EcoRI-HF 2μL

ddH₂O to 40μL

于37℃恒溫水浴鍋酶切3小時以上。

擴增體系同上述PCR方法,引物序列：

NtNAC096-35s-F:CACTGTTGATACATATGGTTGGGAAAAATAACTCCGAG

NtNAC096-35s-R:TGTTGATTCAGAATTCTCACTGGTATTGAAAGGCTGG

酶切質粒和目的基因擴增通過瓊脂糖凝膠電泳檢測，常規(guī)回收。

Infusion連接體系(5μL)：

線性化載體3μL

目的片段1μL

In-fusion HD 1μL

50℃15min

圖5表明，Marker左側為DNA分子量標記DL15000，右側為DL2000，NtNAC096片段高保真酶擴增，左圖左側為目的片段，pRI101-AN雙酶切NdeI和EcoRI，左圖右側酶切的線性pRI101-AN質粒條帶，右側電泳圖為pRI101-NtNAC096表達載體菌落PCR驗證NtNAC096條帶。

利用農桿菌介導的浸花法侵染擬南芥，得到T0代種子，在帶有卡那霉素抗性的1/2MS培養(yǎng)基中進行篩選，獲得T1代陽性苗，將陽性苗自交1代，并繼續(xù)篩選，最終獲得OE1/OE2兩個轉基因純合株系。

(七)對OE1/OE2進行衰老表型分析，并進行相關衰老指標測定:

葉綠素含量的測定

種子萌發(fā)后生長45d的擬南芥材料(轉基因OE和Col-0野生型植株)，各選取30株，每株剪取第6片蓮座葉(從下往上數)，進行葉綠素含量的測定，

實驗操作步驟如下：每3株植株為一組，每組葉片放入一個15mL離心管中，稱量葉片鮮重；每管中加入10mL無水乙醇，使乙醇完全浸過葉片；避光放置過夜，使葉片完全脫色；用分光光度計分別測量脫色液在665nm和649nm處的吸光值(以無水乙醇作為參比)，分別記為A665和A649；按照如下公式計算每組葉片的葉綠素含量：Ca＝13.95A665–6.88A649Cb＝24.96A649–7.32A665

總葉綠素含量(mg/g)＝(Ca+Cb)×V/W。其中，V為提取液體積，10mL；W為葉片鮮重。

葉綠素熒光(Fv/Fm)的測定

使用OPTI-SCIENCES公司的OS5p+型脈沖式葉綠素熒光計，對葉片進行Fv/Fm的測定，操作步驟如下：種子萌發(fā)后生長45d的擬南芥植株材料，各選取5株，在黑暗環(huán)境中放置20min；選取第六片蓮座葉進行測量；連接好儀器各部件，打開儀器開關，在主界面找到Fv/Fm測量程序并進入；用葉片夾夾住葉片，將測量探頭插入葉片夾中，調整參數Ft，使其數值處于150-250范圍內；點擊界面上的測量標志或按下探頭上的測量按鈕，測量數值便被自動記錄并顯示；每測完一組數據后，將數據保存到機身的SD卡中；測量全部完成后，拆卸整理好儀器部件，將SD卡中的數據拷出以作分析。

測定結果參見圖6，圖6A中WT為野生型Col-0；OE1/OE2為轉入pRI101-NtNAC096基因的兩個株系。表型圖為45天擬南芥生長時期表型圖片，可以看出OE株系表現為早衰表型。圖6B為轉基因擬南芥株系葉綠素和光合速率分析。圖6C為轉基因擬南芥株系中NtNAC096和衰老相關marker基因SAG12mRNA水平分析。在OE1/OE2兩個株系中，NtNAC096表達量明顯上調，在播種45天后表現出明顯的早衰表型，通過生理指標測定，OE1/OE2葉綠素含量和光化學速率明顯低于VC，衰老相關marker基因SAG12表達量明顯高于VC。

(八)利用CRISPR/Cas9基因編輯技術對煙草NtNAC096基因靶位點進行設計，構建NtNAC096基因敲除載體；對煙草品種進行遺傳轉化，獲得延緩衰老的煙草植株。

設計靶位點2個：

Target1：GCTATAAAGGAAAGCCCCCTA

Target2：TATAAAGGAAAGCCCCCTAA

人工合成加接頭序列

Target1-F：GATTGCTATAAAGGAAAGCCCCCTA

Target1-R：AAACTAGGGGGCTTTCCTTTATAGC

Target2-F：GATTGTATAAAGGAAAGCCCCCTAA

Target1-R：AAACTTAGGGGGCTTTCCTTTATAC

敲除載體構建

①單鏈oligo DNA退火形成雙鏈DNA

將合成的2條單鏈的引物稀釋成50μM，然后退火。

退火反應體系：

將反應體系PCR儀中95℃孵育3min，孵育后自然冷卻至室溫。

②表達載體的酶切

表達載體：pORE-Cas9/gRNA

用BsaI酶切表達載體

載體 1μg

10×CutSmart Buffer 5μL

酶 1μL

Add ddH₂O to 50μL

37℃酶切1小時，回收酶切產物。

③靶位點連接到表達載體上，連接體系：線性化表達載體5μL，退火的雙鏈DNA 2μL，T4連接酶Buffer 2μL，T4連接酶1μL，Add ddH₂O to 20μL，25℃連接10分鐘。

④連接產物轉化感受態(tài)細胞，經PCR驗證獲得陽性克隆。

將構建好的pORE-Cas9/NtNAC096載體轉化農桿菌感受態(tài)LBA4404，利用農桿菌介導的煙草葉盤轉化法對栽培煙草品種K326進行了遺傳轉化，獲得了具有抗卡那霉素的T0代陽性轉化苗。

提取陽性煙苗葉片基因組DNA，在兩個gRNA序列的兩側設計引物，以基因組DNA為模板，對目的片段進行PCR擴增，對PCR產物進行純化回收，連接克隆載體進行測序，用以檢測靶位點片段突變形式。

收取靶位點被編輯的T0代轉基因陽性植株種子，卡那霉素抗性平板篩選T1代，抗性苗再經PCR擴增測序篩選到T1代純合突變體，電泳圖參見圖7。提取葉片基因組DNA，對目的片段進行PCR擴增并進行產物測序。測序結果參見圖8，圖8表明，煙草植株ntnac096-1和ntnac096-2中NtNAC096基因均已被成功編輯，ntnac096-1植株中檢測到NtNAC096靶區(qū)區(qū)段有一個堿基“C”插入，ntnac096-2植株中檢測到NtNAC096靶區(qū)區(qū)段有一個堿基“T”插入，引起蛋白編碼框發(fā)生改變，導致蛋白質功能喪失，從而獲得延緩煙草衰老的植株。

采用上述擬南芥的葉綠素含量和葉綠素熒光測定方法，葉位計算從頂部開始，依次對第1-6片發(fā)育完整葉片隨機取三點進行測定。測定結果參見圖9，如圖9A，突變體在團棵期開始就表現出明顯的延緩衰老表型。從頂部開始計算葉位，依次對第1-6片發(fā)育完整葉片進行葉綠素含量和光合速率測定，葉綠素含量隨著葉位數增加呈明顯的下降，且突變體葉綠素含量明顯高于對照K326，參見圖9B；同樣，光合速率在第1-4葉位差異不明顯，在5-6葉位突變體光合速率遠遠高于對照K326，參見圖9C。通過表型分析和相關生理指標測定，煙草NtNAC096基因敲除后植株衰老過程明顯被延緩，說明采用本發(fā)明的方法利用煙草NtNAC096基因成功獲得煙草晚衰植株。

<110> 中國農業(yè)科學院煙草研究所

<120> 煙草NtNAC096基因控制煙草衰老的應用

<160> 1

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 1203

<212> DNA

<213> 煙草NtNAC096基因

<400> 1

atggttggga aaaataactc cgagcagctt cctcctggat ttaggttcca tcctactgat 60

gaagaattaa tcatgtatta tcttcgaaat caagctacct cgaggccttg tcctgtttca 120

atcatccccg aagttgatgt ctataagttt gatccctggg aattgcctgg ttagtatact 180

cgttaaatcg cgtttaattc aaagaattaa tttgtagttg atttttaagt cttgaattaa 240

ttttttctta tgaaattctt gtagagaaag ctgaatttgg ggaaagggaa tggtactttt 300

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ttaagaaggc tcttgttttc tataaaggaa agccccctaa gggtattaag actgattgga 480

tcatgcatga atatcgatta agtgaatcca ggtctcaacc aatcaggcca aatggctcca 540

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ttagcataga cgtttttact ctatcagatc attttaaaag gtaattacat gcaataatct 660

atattattga aaatatggca agtaactttc tagaatatgt taagtcgtac tcgtgtaaaa 720

atttcactat aatacatggc agtgttctac catatattat aagagttttt gtcatgacta 780

aaagtacaat tttttcgcca tttttttcag ttggatgatt gggtgctttg tagaatttat 840

aagaagaaga atttgggaaa agctatggag atgatgaaag ttgaagaaga gacacaacag 900

cctgaaatat tgagtactaa tcctgttgaa attattgcta ctactggacc acaaacattg 960

aaattgccaa ggacttgttc actgtctcat ctattggaaa tagattattt tgggtcaatt 1020

tcacgactat ttgatgacaa tgctaacaac caaaacacaa tgaccaatat taatattgga 1080

aatatgcatc atcctgccct ggaaaaattt cagctagggg aattgtcaca ccagtacatg 1140

actagtacca acgttaatgg aaatacgcca atttttgtga atccagcctt tcaataccag 1200

tga 1203