本發(fā)明屬生命科學(xué)和生物
技術(shù)領(lǐng)域：
，是一種檢測(cè)MLH1基因啟動(dòng)子甲基化狀態(tài)的引物和檢測(cè)方法。
背景技術(shù)：
：MLH1基因是DNA錯(cuò)配修復(fù)的主要基因。hMLH1是細(xì)菌錯(cuò)配修復(fù)基因mutl的同源物，是和大腸桿菌muts同源的hMSH2的MMR家族中又一個(gè)錯(cuò)配基因。hMLH1蛋白由756個(gè)氨基酸殘基組成，和酵母錯(cuò)配修復(fù)基因hMLH1相比較有41％的同源性，hMLH1在結(jié)直腸癌中被認(rèn)為起著一種看家基因的作用.在執(zhí)行錯(cuò)配修復(fù)的功能時(shí)，MLH1蛋白分別和PMS2及PMS1蛋白構(gòu)成了異源二聚體hMutlα和hMutlβ，hMutlα可以和DNA上的hMuts相結(jié)合，形成一種暫時(shí)性復(fù)合物，從而啟動(dòng)錯(cuò)配修復(fù)。由于MLH1基因啟動(dòng)子的突變?cè)斐慑e(cuò)配修復(fù)功能低下，導(dǎo)致微衛(wèi)星不穩(wěn)定，使癌基因和抑癌基因的突變，最終導(dǎo)致腫瘤發(fā)生。hMLH1基因的突變主要為錯(cuò)義突變和堿基的缺失或插入，從而造成的移碼突變及雜合性缺失，導(dǎo)致hMLH1蛋白的改變而使腫瘤發(fā)生。子宮頸癌確卻的發(fā)病機(jī)制目前尚未明確，一般認(rèn)為有兩中途徑，其一為經(jīng)典的腫瘤抑制基因雜合性缺失途徑；其二為錯(cuò)配修復(fù)微衛(wèi)星不穩(wěn)定途徑。大量研究證實(shí)了子宮頸癌的發(fā)生和MMR中的MLH1，Msh2基因密切相關(guān)，且多與高頻MSI呈負(fù)相關(guān)。研究表明了，子宮頸癌組織中，MLH1基因呈過(guò)度甲基化。研究者通過(guò)對(duì)65例胃癌標(biāo)本的研究中發(fā)現(xiàn)MSI、啟動(dòng)子甲基化和MLH1基因的沉默這三者之間的密切關(guān)系性。結(jié)直腸癌的發(fā)生同樣和MLH1基因啟動(dòng)子甲基化息息相關(guān)。MLH1基因啟動(dòng)子超甲基化導(dǎo)致基因表達(dá)沉默，同樣可引起結(jié)直腸癌的發(fā)生，發(fā)病率約占全部大腸癌的15％。該機(jī)制認(rèn)為是由于hMLH1基因啟動(dòng)子甲基化導(dǎo)致了hMLH1基因沉默，錯(cuò)配修復(fù)基因失活與微衛(wèi)星不穩(wěn)定性,表明在結(jié)直腸癌的發(fā)生過(guò)程中hMLH1基因的突變占有重要的地位。研究者認(rèn)為甲基化導(dǎo)致了hMLH1基因失活及最終導(dǎo)致錯(cuò)配修復(fù)基因的失活和微衛(wèi)星不穩(wěn)定可能在散發(fā)性結(jié)直腸癌的發(fā)生及發(fā)展過(guò)程中，扮演了一個(gè)重要角色。同時(shí)，MLH1基因啟動(dòng)子甲基化是提示預(yù)后的良好的分子標(biāo)志物，研究者發(fā)現(xiàn)MLH1基因表達(dá)與腫瘤分級(jí)和分期負(fù)相關(guān)，而MLH1基因的表達(dá)對(duì)于腫瘤抑制至關(guān)重要，研究表明，MLH1基因啟動(dòng)子甲基化提示較差的預(yù)后。目前對(duì)于MLH1啟動(dòng)子甲基化檢測(cè)的常規(guī)方法有：甲基化特異性PCR(MSP)、亞硫酸氫鹽焦磷酸測(cè)序、甲基化敏感性高分辨率熔解曲線(xiàn)分析(MS-HRM)，甲基化特異性PCR(MS-PCR)等。其中MSP法是使用PCR擴(kuò)增檢測(cè)來(lái)判斷樣本是否存在甲基化，該法實(shí)用且普遍，但假陽(yáng)性較高，穩(wěn)定性較差；亞硫酸氫鹽焦磷酸測(cè)序因其操作繁瑣，因此不適合大批量檢測(cè)；MS-HRM是通過(guò)將單堿基序列的差異轉(zhuǎn)變成熔解曲線(xiàn)的差異，從而判斷是否存在甲基化，這種方法對(duì)儀器的要求頗高，需要帶HRM模塊的熒光定量PCR儀，同時(shí)該法只能分析檢測(cè)片段整體甲基化狀態(tài)，而不能明確每個(gè)CG位點(diǎn)的甲基化狀態(tài)；MS-PCR是基于PCR開(kāi)發(fā)的技術(shù)，主要是在檢測(cè)中加入了TaqMan探針，從而保證了較高的靈敏度和準(zhǔn)確度，但其對(duì)于多個(gè)甲基化位點(diǎn)的檢測(cè)，也只能做到整體化分析，同時(shí)探針成本較高，因此該法較適用于少數(shù)位點(diǎn)大量樣本檢測(cè)。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：為解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明采用的一個(gè)技術(shù)方案是：設(shè)計(jì)用于檢測(cè)MLH1基因啟動(dòng)子甲基化的引物，包括一對(duì)特異性擴(kuò)增兼并引物SEQNO1和SEQNO2，其序列為：SEQNO1：5’-AAGGGTGGGGTTGGATGGY-3’；SEQNO2：5’-RCRATACGATTCACCACTATCTCR-3’。R堿基代表A或G，Y堿基代表C或T，所述SEQNO1和SEQNO2同時(shí)也為雙向測(cè)序引物。本發(fā)明提供的另一個(gè)技術(shù)方案是：用于檢測(cè)MLH1基因啟動(dòng)子甲基化的方法，包括：(1)提取樣本中的DNA；(2)將步驟(1)中提取的DNA進(jìn)行亞硫酸氫鹽處理；(3)以步驟(2)中的DNA作為模板，使用SEQNO1和SEQNO2擴(kuò)增MLH1基因片段，獲得PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；(4)對(duì)步驟(3)中獲得的產(chǎn)物測(cè)序；(5)根據(jù)步驟(4)的測(cè)序結(jié)果，得到序列CG位點(diǎn)的甲基化結(jié)果；其中，PCR擴(kuò)增反應(yīng)條件為：第一階段，92-97℃預(yù)變性5-15min；第二階段，變性溫度92-97℃30sec，退火溫度62-66℃90sec，延伸溫度72℃30sec，循環(huán)12-18次，每循環(huán)一次，所述退火溫度降低0.5℃；第三階段，變性溫度92-97℃30sec，退火溫度53-57℃30sec，延伸溫度72℃30sec，循環(huán)24-34次；第四階段，72℃10min；第五階段，擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)束，擴(kuò)增產(chǎn)物在4℃下保存。所述的測(cè)序?yàn)镾anger測(cè)序，測(cè)序引物為：SEQNO1：5’-AAGGGTGGGGTTGGATGGY-3’；SEQNO2：5’-RCRATACGATTCACCACTATCTCR-3’。該方法檢測(cè)的樣本為石蠟切片樣本、全血樣本、新鮮組織樣本或細(xì)胞系樣本。更進(jìn)一步地，本發(fā)明提供一種用于檢測(cè)MLH1基因啟動(dòng)子甲基化的試劑盒的技術(shù)方案，包括亞硫酸鹽修飾、PCR擴(kuò)增試劑以及Sanger測(cè)序試劑、陽(yáng)性對(duì)照品、陰性對(duì)照品，其中：(1)亞硫酸鹽處理試劑包括：BisulfiteMix、RNasefreewater、DNAProtectBuffer；(2)PCR擴(kuò)增試劑：10*PCRBuffer、2mMdNTP、5*QSolutionBuffer、5U/ulTaq酶、10uM擴(kuò)增引物(SEQNO1、SEQNO2)以及滅菌水；(3)酶純化試劑：EXOI、CIP；(4)測(cè)序試劑：BigdyeTerminatorV3.1、無(wú)水乙醇、EDTA、及測(cè)序引物(SEQNO1、SEQNO2)。其中，陽(yáng)性對(duì)照品為經(jīng)過(guò)所有胞嘧啶甲基化修飾的全甲基化正常人群血液基因組DNA，陰性對(duì)照品為正常人群血液基因組DNA。本發(fā)明采用Touch-downPCR擴(kuò)增和Sanger測(cè)序法MLH1啟動(dòng)子甲基化檢測(cè)，針對(duì)石蠟切片DNA片段化嚴(yán)重，在造成亞硫酸氫鹽處理飽和的情況下，仍出現(xiàn)的有效模板濃度很低的情況，Touch-downPCR擴(kuò)增可確保正、反向擴(kuò)增引物與樣本DNA模板的結(jié)合發(fā)生在最互補(bǔ)的序列之間，當(dāng)退火溫度降低到非特異性擴(kuò)增發(fā)生的水平時(shí)，特異性擴(kuò)增產(chǎn)物在此時(shí)已經(jīng)有一個(gè)幾何數(shù)的起始優(yōu)勢(shì)，豐度較高，在剩余的擴(kuò)增反應(yīng)中，特異性擴(kuò)增產(chǎn)物與非特異擴(kuò)增產(chǎn)物產(chǎn)生競(jìng)爭(zhēng)，但是因非特異性擴(kuò)增產(chǎn)物豐度較低，特異性擴(kuò)增產(chǎn)物始終優(yōu)先擴(kuò)增，從而產(chǎn)生單一的占主導(dǎo)地位的特異性擴(kuò)增產(chǎn)物。而Sanger測(cè)序法是檢測(cè)基因甲基化的金標(biāo)準(zhǔn)，檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確性高，并且很大程度上地節(jié)省了檢測(cè)成本。由于DNA序列在經(jīng)亞硫酸鹽處理后，其部分C堿基會(huì)轉(zhuǎn)變?yōu)門(mén)，導(dǎo)致序列區(qū)域內(nèi)CG含量和TM值發(fā)生較大程度的變異，進(jìn)而影響常規(guī)引物設(shè)計(jì)軟件在其序列上獲得理想的引物序列。因此，本發(fā)明中PCR采用的擴(kuò)增引物以及測(cè)序引物均為自行設(shè)計(jì)，其中測(cè)序引物使用兼并堿基，從而使得陰性、陽(yáng)性都可在同一體系擴(kuò)增。同時(shí)，擴(kuò)增引物的使用比例經(jīng)過(guò)多次優(yōu)化實(shí)驗(yàn)，相對(duì)于其它文獻(xiàn)和軟件設(shè)計(jì)的引物具備了更加理想的擴(kuò)增效率。因此，本發(fā)明的檢測(cè)方法具備了檢測(cè)出率高，檢測(cè)穩(wěn)定性好，準(zhǔn)確度高以及低污染風(fēng)險(xiǎn)等優(yōu)勢(shì)。檢測(cè)結(jié)果將有助于預(yù)見(jiàn)相關(guān)腫瘤疾病的早期，同時(shí)具有潛在的指導(dǎo)臨床醫(yī)生個(gè)體化治療的作用。附圖說(shuō)明圖1和圖2是本發(fā)明的檢測(cè)基因甲基化的方法檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)序列，圖1為陰性標(biāo)準(zhǔn)序列，圖2為陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)序列。圖3是本發(fā)明的檢測(cè)基因甲基化的實(shí)施例中陰性檢測(cè)的結(jié)果圖，圖4是本發(fā)明的檢測(cè)基因甲基化的實(shí)施例中陽(yáng)性結(jié)果的圖。具體實(shí)施方式下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)當(dāng)注意的是，實(shí)施例中未說(shuō)明的常規(guī)條件和方法，通常按照所屬領(lǐng)域?qū)嶒?yàn)人員常規(guī)采用方法：譬如，奧斯柏和金斯頓主編的《精編分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)指南》第四版，或者按照制造廠(chǎng)商所建議的步驟和條件。實(shí)施例1MLH1基因啟動(dòng)子區(qū)CG島甲基化檢測(cè)試劑盒包括一對(duì)特異性兼并引物SEQNO1和SEQNO2，同時(shí)，此引物為測(cè)序引物，其堿基序列如下所示：SEQNO1：5’-AAGGGTGGGGTTGGATGGY-3’；SEQNO2：5’-RCRATACGATTCACCACTATCTCR-3’；MLH1基因啟動(dòng)子區(qū)CG島甲基化檢測(cè)試劑盒還包括如下試劑：(1)亞硫酸鹽處理試劑：BisulfiteMix、RNasefreewater、DNAProtectBuffer；(2)PCR擴(kuò)增試劑：10*PCRBuffer、2mMdNTP、5*QSolutionBuffer、5U/ulTaq酶、10uM擴(kuò)增引物(SEQNO1、SEQNO2)以及滅菌水；(3)酶純化試劑：EXOI，CIP；(4)測(cè)序試劑：BigdyeTerminatorV3.1，無(wú)水乙醇，EDTA，及測(cè)序引物(SEQNO1，SEQNO2)。(5)陽(yáng)性質(zhì)控品：已確定的MLH1基因啟動(dòng)子區(qū)CG島甲基化的DNA。陰性質(zhì)控品：已確定的MLH1基因啟動(dòng)子區(qū)CG島無(wú)甲基化的DNA。空白對(duì)照品：滅菌水。實(shí)施例2DNA提取試劑和方式。取石蠟切片(5-10μm厚，1×1cm2大小)5-8張，將石蠟包埋組織收集到1.5mL離心管內(nèi)，短暫離心；加入1mL組織透明液，充分振蕩，13200rpm離心1min，移除上清液；加入0.5mL組織透明液，充分振蕩，13200rpm離心1min，移除上清液；加入1mL乙醇(96-100％)，劇烈振蕩，13200rpm室溫離心2min，移除上清液；打開(kāi)蓋子，室溫(15-25℃)或金屬浴37℃孵育直到剩余乙醇完全揮發(fā)；取180μLBufferATL對(duì)管內(nèi)組織進(jìn)行吹吸重懸，然后加入20μL蛋白酶K，再次振蕩；將含有混合液的離心管置于56℃的金屬浴上，孵育1h，期間顛倒混勻3次，直至樣品完全溶解；將離心管轉(zhuǎn)移至90℃的金屬浴上，再次孵育1h；短暫離心，將管蓋上的溶液甩至管底；向管內(nèi)加入200μLBufferAL，充分振蕩混勻。然后加入200μL乙醇(96-100％)，再次振蕩混勻；短暫離心，將管蓋上的溶液甩至管底；小心將混合液用移液器轉(zhuǎn)移至含有QIAampMinElutecolumn吸附柱的2mL收集管內(nèi)，8000rpm離心1min，棄收集管，將吸附柱置于一個(gè)新的收集管上；向吸附柱內(nèi)加入500μLBufferAW1，務(wù)必不要打濕吸附柱管口邊緣。8000rpm離心1min，棄收集管，將吸附柱置于一個(gè)新的收集管上；向吸附柱內(nèi)加入500μLBufferAW2，務(wù)必不要打濕吸附柱管口邊緣。8000rpm離心1min，棄收集管，將吸附柱置于一個(gè)新的收集管上；13200rpm室溫離心3min，以徹底甩掉吸附膜上殘留的溶液；將吸附柱將吸附柱置于一個(gè)干凈的1.5mL離心管上(自備)，小心向膜中央滴加50μLBufferATE；13200rpm室溫離心1min，取收集到的DNA溶液1.5μL用NanoDrop檢測(cè)所得DNA的濃度和純度；將剩余的DNA溶液于-20℃保存。實(shí)施例3亞硫酸鹽處理試劑和方法如下。操作步驟：將實(shí)施例2提取的基因組DNA與1.5mlEP管中使用雙蒸水稀釋至50ul加5.5ul新鮮配制的3MNaOH溶液，42℃水浴30min；水浴期間配制以下溶液：10mM氫醌溶液(Hydryquinone)：取55mg氫醌于50ml水中溶解；3.6mol/LNaHSO3：取18.8gNaHSO3加入40ml水中，并以3MNaOH溶液調(diào)節(jié)溶液PH至5.0，最終定容至50ml。加30ul10mM氫醌溶液和520ul3.6mol/LNaHSO3至上述水浴后溶液中，EP管外包裹以鋁箔紙避光，輕柔顛倒混勻溶液，管內(nèi)加100ul石蠟油，短暫離心使石蠟油蓋住液面，防止水浴過(guò)程中水分的蒸發(fā)并限制氧化50℃避光水浴16h；水浴完后將移液器槍頭伸入石蠟油層下，先輕輕加壓使其中一小段石蠟油排出，然后小心吸取約580ulDNA溶液至潔凈的1.5mlEP管中，使用PCR產(chǎn)物回收試劑盒回收DNA，所得到的DNA溶于50ul去離子水，加5.5ul新鮮配制的3MNaOH，室溫放置15min，然后加33ul10M乙酸銨中和NaOH，使溶液PH＝7，也加入4ul10mg/ml葡萄糖作為沉淀位置指示劑，加入270ul冰無(wú)水乙醇，至于-20℃，過(guò)夜沉淀后，4℃，12000rpm離心，30min，倒掉上清液，收集沉淀，加入500ul70％乙醇，洗劑沉淀，4℃12000rpm，5min離心兩次；倒掉上清，室溫干燥至沉淀由不透明變?yōu)榘胪该骰蛲该鲿r(shí)，依DNA沉淀多少加入30-50ul雙蒸水溶解沉淀。利用本發(fā)明所述的DNA亞硫酸氫鈉處理試劑和方法，可以獲得更高的DNA回收率，高轉(zhuǎn)化率，同時(shí)可以降低DNA降解率和片段化率，從而提高了PCR擴(kuò)增和后續(xù)分析技術(shù)的靈敏度。實(shí)施例4PCR檢測(cè)方法如下。PCR引物為：所有引物純度達(dá)到PAGE級(jí)或HPLC級(jí)，不含雜帶。提供合成結(jié)構(gòu)出具的合成產(chǎn)物的質(zhì)檢證明，如PAGE電泳結(jié)果或HPLC分析圖譜，證明使用引物達(dá)到檢測(cè)要求。MLH1的引物序列如下：F：5’-AAGGGTGGGGTTGGATGGY-3’；R：5’-RCRATACGATTCACCACTATCTCR-3’；PCR檢測(cè)反應(yīng)體系為：8-10×PCR緩沖液、0.8-1.2mMdNTPs、0.8-1.2uM擴(kuò)增引物(SEQNO1和SEQNO2)、0.5-2ng模板DNA，0.05-0.1U/ulDNA聚合酶。所述dNTPs包括：10mMdATP、10mMdCTP、10mMdTTP、10mMdGTP。所述PCR緩沖液包括：TRIS.CL、氯化鉀、硫酸鎂和氯化鎂。PCR檢測(cè)的反應(yīng)條件為：第一階段，92-97℃預(yù)變性5-15min；第二階段，變性溫度92-97℃30sec，退火溫度62-66℃90sec，延伸溫度72℃30sec，循環(huán)12-18次，每循環(huán)一次，所述退火溫度降低0.5℃；第三階段，變性溫度92-97℃30sec，退火溫度53-57℃30sec，延伸溫度72℃30sec，循環(huán)24-34次；第四階段，72℃10min；第五階段，擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)束，擴(kuò)增產(chǎn)物在4℃下保存。電泳檢測(cè)后將所得PCR產(chǎn)物進(jìn)行酶純化，測(cè)序反應(yīng)，上機(jī)測(cè)序；所述酶純化的反應(yīng)條件為：37℃50min，95℃5min。所述測(cè)序反應(yīng)的反應(yīng)條件為：95℃4min，95℃15S；50℃20S；60℃2min，25個(gè)循環(huán)。依據(jù)相關(guān)軟件獲得樣本的MLH1啟動(dòng)子甲基化狀態(tài)。以亞硫酸鹽處理后的MLH1啟動(dòng)子序列為標(biāo)準(zhǔn)序列，通過(guò)軟件分析獲得樣本的MLH1啟動(dòng)子甲基化狀態(tài)。針對(duì)石蠟切片DNA片段化嚴(yán)重，而亞硫酸氫鹽修飾飽和狀態(tài)下仍呈現(xiàn)有效模板濃度低的問(wèn)題，將Touch-downPCR擴(kuò)增和Sanger測(cè)序相結(jié)合，可顯著提高檢測(cè)靈敏度。實(shí)施例5子宮頸癌樣本檢測(cè)：選擇石蠟切片樣本10例，3例為已確診子宮頸癌樣本，3例為正常人樣本，其余4例為未知樣本。利用本發(fā)明的試劑盒按照實(shí)施例3中的方法進(jìn)行樣本DNA提取、亞硫酸處理、純化回收、PCR擴(kuò)增、測(cè)序及結(jié)果分析。(1)材料：待測(cè)樣本、陽(yáng)性質(zhì)控品、陰性質(zhì)控品、空白對(duì)照。(2)儀器：移液器、高速離心機(jī)、NANODROP1000、渦旋震蕩以、冰箱、電泳儀、凝膠拍照系統(tǒng)，ABI3500XLGeneticAnalyzer，PCR儀。(3)試劑：DNA聚合酶(凱杰)，DNA純化試劑(凱杰)，dNTPs(TaTaRa)、純化水，亞硫酸鹽處理試劑(凱杰)，EXOI(NEB)，CIP(NEB)，BigdyeTerminator(NEB).(4)引物：所有引物純度達(dá)到PAGE級(jí)或HPLC級(jí)，不含雜帶。提供合成結(jié)構(gòu)出具的合成產(chǎn)物的質(zhì)檢證明，如PAGE電泳結(jié)果或HPLC分析圖譜，證明使用引物達(dá)到檢測(cè)要求。MLH1的引物序列如下：F：5’-AAGGGTGGGGTTGGATGGY-3’；R：5’-RCRATACGATTCACCACTATCTCR-3’；(5)PCR檢測(cè)，反應(yīng)體系為：8-10XPCR緩沖液、0.8-1.2mMdNTPs、0.8-1.2uM如權(quán)利要求3所述的擴(kuò)增引物、0.5-2ng模板DNA，0.05-0.1U/ulDNA聚合酶。(6)所述dNTPs中包括10mMdATP、10mMdCTP、10mMdTTP、10mMdGTP，所述PCR緩沖液包含TRIS.CL、氯化鉀、硫酸鎂和氯化鎂。(7)所述PCR檢測(cè)的反應(yīng)條件為：第一階段，92-97℃預(yù)變性5-15min；第二階段，變性溫度92-97℃30sec，退火溫度62-66℃90sec，延伸溫度72℃30sec，循環(huán)12-18次，每循環(huán)一次，所述退火溫度降低0.5℃；第三階段，變性溫度92-97℃30sec，退火溫度53-57℃30sec，延伸溫度72℃30sec，循環(huán)24-34次；第四階段，72℃10min；第五階段，擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)束，擴(kuò)增產(chǎn)物在4℃下保存。(8)電泳檢測(cè)后將所得PCR產(chǎn)物進(jìn)行酶純化，測(cè)序反應(yīng)，上機(jī)測(cè)序；(9)所述酶純化的反應(yīng)條件為：37℃50min，95℃5min。所述測(cè)序反應(yīng)的反應(yīng)條件為：95℃4min，95℃15S；50℃20S；60℃2min，25個(gè)循環(huán)。(10)依據(jù)相關(guān)軟件獲得樣本的MLH1啟動(dòng)子甲基化狀態(tài)。以亞硫酸鹽處理后的MLH1啟動(dòng)子序列為標(biāo)準(zhǔn)序列，通過(guò)軟件分析獲得樣本的MLH1啟動(dòng)子甲基化狀態(tài)。10例樣本的MLH1基因啟動(dòng)子甲基化狀態(tài)結(jié)果如下表所示：樣本編號(hào)檢測(cè)到甲基化的CG數(shù)檢測(cè)結(jié)果S1(子宮頸癌)0個(gè)陰性S2(子宮頸癌)9個(gè)陽(yáng)性S3(子宮頸癌)0個(gè)陰性S4(正常人)0個(gè)陰性S5(正常人)0個(gè)陰性S6(正常人)0個(gè)陰性S7(子宮頸癌未確診)0個(gè)陰性S8(子宮頸癌未確診)0個(gè)陰性S9(子宮頸癌未確診)0個(gè)陰性S10(子宮頸癌未確診)9個(gè)陽(yáng)性檢測(cè)樣本的MLH1基因啟動(dòng)子甲基化狀態(tài)結(jié)果如圖3和圖4所示，圖3為S1樣本檢測(cè)結(jié)果，結(jié)果為陰性(箭頭指CG位點(diǎn))。圖4為S2樣本檢測(cè)結(jié)果，結(jié)果為陽(yáng)性(箭頭指CG位點(diǎn))。SEQUENCELISTING<110>濟(jì)南艾迪康醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)中心有限公司<120>MLH1基因啟動(dòng)子甲基化檢測(cè)的引物和檢測(cè)方法<130><160>4<170>PatentInversion3.5<210>1<211>19<212>DNA<213>人工序列<400>1aagggtggggttggatggy19<210>2<211>24<212>DNA<213>人工序列<400>2rcratacgattcaccactatctcr24<210>3<211>184<212>DNA<213>人工序列<400>3aagggtggggttggatggtgtaagttatagttgaaggaagaatgtgagtatgaggtattg60aggtgattggttgaaggtatttttgttgagtatttagatgtttttttggtttttttggtg120ttaaaatgttgtttgtggtaggggttatttggtggttggatgagatagtggtgaattgta180ttgt184<210>4<211>184<212>DNA<213>人工序列<400>4aagggtggggttggatggcgtaagttatagttgaaggaagaacgtgagtacgaggtattg60aggtgattggttgaaggtattttcgttgagtatttagacgtttttttggtttttttggcg120ttaaaatgtcgttcgtggtaggggttattcggcggttggacgagatagtggtgaatcgta180tcgc184當(dāng)前第1頁(yè)1 2 3