本發(fā)明涉及檢測特定基因組位置的DNA甲基化的方法。

背景技術(shù)：

在真核生物的DNA中，部分胞嘧啶會發(fā)生甲基化，從而產(chǎn)生甲基化的DNA。研究表明，DNA的甲基化可能對DNA的功能有重大影響，特別是DNA甲基化可能引起染色質(zhì)結(jié)構(gòu)、DNA構(gòu)象、DNA穩(wěn)定性及DNA與蛋白質(zhì)相互作用方式的改變，從而控制基因表達(dá)。例如，基因啟動子序列的甲基化一般會抑制該基因的表達(dá)。在一些研究中發(fā)現(xiàn)，DNA甲基化對生物的正常發(fā)育是必需的。在另一些研究中發(fā)現(xiàn)，DNA甲基化同基因印記，X染色體失活，以及重復(fù)元件的抑制有關(guān)。特別的，一些研究中發(fā)現(xiàn)，DNA甲基化和腫瘤產(chǎn)生相關(guān)。

基因的啟動子區(qū)或末端通常會存在一些富含“CG”核苷酸對(其中G緊隨C后，兩個核苷酸之間通過磷酸酯鍵相連，因此稱為“CpG”)的區(qū)域。在哺乳動物的DNA中，60％～90％的CpG序列被甲基化(Ehrlich等，1982，Amount and distribution of 5-methyl-cytosine in human DNA from different types of tissues or cells,Nucleic Acids Research 10(8):2709-21)。當(dāng)基因的表達(dá)調(diào)控區(qū)中某些區(qū)段富含CpG(CpG序列出現(xiàn)頻率遠(yuǎn)高于平均)時，將該區(qū)段稱為CpG島。研究表明，腫瘤細(xì)胞的DNA中發(fā)現(xiàn)部分基因的表達(dá)調(diào)控區(qū)發(fā)生了在正常情況下非甲基化或低甲基化的CpG島甲基化程度明顯增高的情況，抑制了一些基因(例如，抑癌基因)的表達(dá)。而另一方面，腫瘤細(xì)胞的DNA中還發(fā)現(xiàn)有部分基因的表達(dá)調(diào)控區(qū)發(fā)生CpG島的甲基化程度降低的情況，使這些基因(例如，致癌基因)表達(dá)異常。因此，通過研究DNA片段特定基因組位置的甲基化情況可以獲取關(guān)于腫瘤的重要信息。

腫瘤細(xì)胞在人體內(nèi)會因?yàn)榧?xì)胞凋亡、免疫反應(yīng)等原因釋放其基因組DNA至血液中。正常組織也會將正常的基因組DNA釋放至血液中。這些血漿中存在的DNA統(tǒng)稱為細(xì)胞外游離DNA(Cell-free DNA,cfDNA)，而其中的來自腫瘤細(xì)胞的部分則被稱為循環(huán)腫瘤DNA(Circulating Tumor DNA,ctDNA)。檢測ctDNA中的甲基化DNA對腫瘤的早期診斷很有幫助。但是，由于ctDNA在cfDNA中的豐度極低，這要求檢測ctDNA中甲基化DNA的方法有極高的靈敏度。因此，需要一種具有高靈敏度和準(zhǔn)確性的檢測DNA片段的特定基因組位置的甲基化的方法。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的一個方面提供了一種檢測包含DNA的樣品中DNA片段的特定基因組位置的甲基化的方法。在一些實(shí)施方式中，該方法包括以下步驟：用亞硫酸氫鈉處理包含特定基因組位置的DNA片段，所述亞硫酸氫鈉處理能夠使得DNA片段中未甲基化的胞嘧啶轉(zhuǎn)化為尿嘧啶；將經(jīng)亞硫酸氫鈉處理過的所述DNA片段變性為單鏈DNA片段；環(huán)化所述單鏈DNA片段；將所述環(huán)化的單鏈DNA片段制備為包含所述特定基因組位置的DNA測序文庫；對所述DNA測序文庫進(jìn)行測序以鑒定所述單鏈DNA片段的序列。

在一些實(shí)施方式中，在變性處理前在所述DNA片段一端或兩端加上接頭。在一些實(shí)施方式中，在經(jīng)亞硫酸氫鈉處理前在所述DNA片段一端或兩端加上接頭。在一些實(shí)施方式中，所述接頭可耐受亞硫酸氫鹽。在一些實(shí)施方式中，所述接頭包括DNA分子標(biāo)簽。在一些實(shí)施方式中，其中所述接頭包括第二類限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)。在一些實(shí)施方式中，所述第二類限制性內(nèi)切酶選自下組：HpaII/MspI、SmaI/XmaI、BamHI、HpaII。

在一些實(shí)施方式中，使用高效環(huán)化試劑環(huán)化所述單鏈DNA片段。在一些實(shí)施方式中，所述高效環(huán)化試劑為單鏈DNA連接酶。在一些實(shí)施方式中，所述單鏈DNA連接酶是CircLigase。

在一些實(shí)施方式中，在將所述單鏈DNA片段環(huán)化前，對所述DNA片段的5’末端進(jìn)行磷酸化處理和對3’末端進(jìn)行去磷酸化處理。

在一些實(shí)施方式中，在亞硫酸氫鈉處理前對所述DNA片段進(jìn)行切割處理，使得切割得到的DNA片段大小為0.1-5kb、0.1-1kb、1-2kb、2-3kb、3-4kb、4-5kb、0.2-0.4kb、0.5-1kb或0.1-0.5kb，并且所述切割得到的DNA片段包含所述特定基因組位置。

在一些實(shí)施方式中，所述的方法中的將環(huán)化的單鏈DNA片段制備為DNA測序文庫的步驟包括：在所述環(huán)化步驟后擴(kuò)增環(huán)化的所述單鏈DNA片段，并且獲得由包含所述特定基因組位置的DNA的擴(kuò)增產(chǎn)物組成的所述DNA測序文庫。在一些實(shí)施方式中，所述擴(kuò)增的步驟使用反向PCR擴(kuò)增。在一些實(shí)施方式中，所述擴(kuò)增的步驟使用滾環(huán)擴(kuò)增。在一些實(shí)施方式中，所述接頭包含與擴(kuò)增步驟使用的引物部分或全部互補(bǔ)的序列。在一些實(shí)施方式中，所述測序步驟使用高通量DNA測序技術(shù)測定所述DNA測序文庫的序列。

在一些實(shí)施方式中，所述的方法中的將環(huán)化的單鏈DNA片段制備為DNA測序文庫的步驟進(jìn)一步包括：在擴(kuò)增步驟后使用寡核苷酸探針富集所述擴(kuò)增產(chǎn)物。

在一些實(shí)施方式中，包含在所述樣品中的DNA為細(xì)胞外的游離DNA。在一些實(shí)施方式中，在所述細(xì)胞外的游離DNA中包含循環(huán)腫瘤DNA。

本發(fā)明的另一個方面提供了一種檢測包含DNA的樣品中DNA片段的特定基因組位置的甲基化的試劑盒。在一些實(shí)施方式中，該試劑盒包括：亞硫酸氫鈉，所述亞硫酸氫鈉以使得DNA片段中未甲基化的胞嘧啶轉(zhuǎn)化為尿嘧啶；環(huán)化試劑，所述環(huán)化試劑能夠?qū)捂淒NA片段環(huán)化；測序試劑。在一些實(shí)施方式中，該試劑盒進(jìn)一步包括切割試劑，其可用于在亞硫酸氫鈉處理前對所述DNA片段進(jìn)行切割處理，使得切割得到的DNA片段大小為0.1-5kb、0.1-1kb、1-2kb、2-3kb、3-4kb、4-5kb、0.2-0.4kb、0.5-1kb或0.1-0.5kb。

在另一些實(shí)施方式中，該試劑盒進(jìn)一步包括擴(kuò)增試劑，其可用于擴(kuò)增包含特定基因組位置的單鏈環(huán)狀DNA。在一些實(shí)施方式中，所述擴(kuò)增試劑包括DNA聚合酶、反應(yīng)溶液和dNTPs。

在一些實(shí)施方式中，該試劑盒進(jìn)一步包括接頭連接試劑，其可用于在變性處理前、或者在經(jīng)亞硫酸氫鈉處理前在所述DNA片段一端或兩端加上接頭序列。在一些實(shí)施方式中，所述接頭連接試劑包括接頭序列DNA片段、連接酶、反應(yīng)溶液。

在一些實(shí)施方式中，所述環(huán)化試劑為高效環(huán)化試劑。在一些實(shí)施方式中，所述高效環(huán)化試劑為單鏈DNA連接酶。在一些實(shí)施方式中，所述單鏈DNA連接酶是CircLigase。在一些實(shí)施方式中，所述環(huán)化試劑進(jìn)一步包括T4PNK，其可用于對DNA片段進(jìn)行5’末端進(jìn)行磷酸化處理和3’末端進(jìn)行去磷酸化處理。

本發(fā)明的再一個方面提供了一種環(huán)化試劑在制備檢測包含DNA的樣品中DNA片段的特定基因組位置的甲基化的試劑盒中的用途，其中所述檢測包括以下步驟：用亞硫酸氫鈉處理包含特定基因組位置的所述DNA片段，所述亞硫酸氫鈉處理能夠使得DNA片段中未甲基化的胞嘧啶轉(zhuǎn)化為尿嘧啶；將經(jīng)亞硫酸氫鈉處理過的所述DNA片段變性為單鏈DNA片段；環(huán)化所述單鏈DNA片段；DNA測序。

在一些實(shí)施方式中，所述檢測進(jìn)一步包括在所述環(huán)化步驟后擴(kuò)增環(huán)化的所述單鏈DNA片段，并且所述測序步驟為測定擴(kuò)增產(chǎn)物的序列。

在一些實(shí)施方式中，所述檢測進(jìn)一步包括在變性處理前在所述DNA片段一端或兩端加上的DNA接頭序列。在一些實(shí)施方式中，所述檢測進(jìn)一步包括在經(jīng)亞硫酸氫鈉處理前在所述DNA片段一端或兩端加上的接頭序列。

在一些實(shí)施方式中，所述檢測進(jìn)一步包括在將所述單鏈DNA片段環(huán)化前，對所述DNA片段的5’末端進(jìn)行磷酸化處理和對3’末端進(jìn)行去磷酸化處理。

在一些實(shí)施方式中，所述檢測進(jìn)一步包括在測序步驟前使用寡核苷酸探針富集包含DNA片段的特定基因組位置的擴(kuò)增產(chǎn)物。

附圖說明

通過下面說明書和所附的權(quán)利要求書并與附圖結(jié)合，將會更加充分地描述本申請內(nèi)容的上述和其他特征?？梢岳斫?，這些附圖僅描繪了本申請內(nèi)容的若干實(shí)施方式，因此不應(yīng)認(rèn)為是對本申請內(nèi)容范圍的限定。通過采用附圖，本申請內(nèi)容將會得到更加明確和詳細(xì)的說明。

圖1：亞硫酸氫鈉處理原理示意圖；

圖2：單鏈DNA環(huán)化處理示意圖；

圖3：反向PCR擴(kuò)增包含甲基化位點(diǎn)的序列的示意圖；

圖4：滾環(huán)擴(kuò)增包含甲基化位點(diǎn)的序列的示意圖。

具體實(shí)施方式

本發(fā)明的一個方面提供了一種檢測包含DNA的樣品中DNA片段的特定基因組位置的甲基化的方法。

本發(fā)明中使用的術(shù)語“DNA”即脫氧核糖核酸，是組成遺傳指令的長鏈聚合物生物大分子。DNA的組成單位是核苷酸，DNA中的每個核苷酸由含氮堿基、五碳糖(2-脫氧核糖)和磷酸基團(tuán)組成。相鄰的核苷酸通過脫氧核糖和磷酸形成酯鍵相連從而組成長鏈骨架組成。DNA的核苷酸中的含氮堿基一般有四種，分別為腺嘌呤(A)、鳥嘌呤(G)和胞嘧啶(C)、胸腺嘧啶(T)。兩條DNA長鏈上的堿基通過氫鍵配對，其中腺嘌呤(A)和胸腺嘧啶(T)配對，鳥嘌呤(G)和胞嘧啶(C)配對。

本發(fā)明中使用的術(shù)語“包含DNA的樣品”是指任何包含DNA片段的樣品，其中包括但不限于細(xì)胞、組織、體液等。在一些實(shí)施方式中，所述包含DNA的樣品為細(xì)胞，例如細(xì)菌(包含病毒)或動植物細(xì)胞等。在另一些實(shí)施方式中，所述包含DNA的樣品為體液，例如血液、血漿、血清、唾液、羊水穿刺液、胸腔積液、腹腔積液等。在一些特定的實(shí)施方式中，所述包含DNA的樣品為血液、血清或血漿。在一些特定的實(shí)施方式中，包含在所述樣品中的DNA為細(xì)胞外的游離DNA(cfDNA)。在一些優(yōu)選的實(shí)施方式中，包含在所述樣品中的DNA為循環(huán)腫瘤DNA(ctDNA)。

“細(xì)胞外的游離DNA”是指在循環(huán)系統(tǒng)(例如，血液)中發(fā)現(xiàn)的游離于細(xì)胞外的DNA。其來源一般認(rèn)為是由于細(xì)胞凋亡過程中釋放的基因組DNA。研究發(fā)現(xiàn)，人體內(nèi)絕大部分的細(xì)胞外的游離DNA的大小在160bp左右(參見Fan et al.,(2010)Analysis of the Size Distributions of Fetal and Maternal Cell-Free DNA by Paired-End Sequencing,Clin Chem 56:8 1279-86)。

“循環(huán)腫瘤DNA”是指來源于腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞外游離DNA。腫瘤細(xì)胞在人體內(nèi)會因?yàn)榧?xì)胞凋亡、免疫反應(yīng)等原因釋放其基因組DNA到血液中。由于正常細(xì)胞也同樣會將其基因組DNA釋放到血液中，因此，一般情況下，循環(huán)腫瘤DNA只占細(xì)胞外游離DNA的很小一部分。

本發(fā)明中使用的術(shù)語“DNA甲基化”是指一種表觀遺傳的修飾方式。在真核生物中，DNA的甲基化僅發(fā)生于胞嘧啶，具體是指在DNA甲基轉(zhuǎn)移酶(DNMTs)的催化下，將甲基基團(tuán)轉(zhuǎn)移到胞嘧啶的上，使得胞嘧啶轉(zhuǎn)變?yōu)?-甲基胞嘧啶(mC)的一種修飾。研究表明，DNA的甲基化對DNA的功能有重大影響，特別是DNA甲基化可能引起染色質(zhì)結(jié)構(gòu)、DNA構(gòu)象、DNA穩(wěn)定性及DNA與蛋白質(zhì)相互作用方式的改變，從而控制基因表達(dá)。例如，基因啟動子序列的甲基化一般會抑制該基因的表達(dá)。在一些研究中發(fā)現(xiàn)，DNA甲基化對生物的正常發(fā)育是必需的。在另一些研究中發(fā)現(xiàn)，DNA甲基化同基因印記，X染色體失活，以及重復(fù)元件的抑制有關(guān)。特別的，一些研究中發(fā)現(xiàn)，DNA甲基化和腫瘤產(chǎn)生相關(guān)。

本發(fā)明中所述的“DNA片段的特定基因組位置”泛指一切目標(biāo)檢測位置。在一些優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述DNA片段的特定基因組位置是指CpG富集的區(qū)域，特別是CpG島區(qū)域。在另一些優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述DNA片段的特定基因組位置是指其甲基化程度與疾病(例如腫瘤、炎癥、出生缺陷等)有關(guān)的CpG島區(qū)域。

在一些實(shí)施方式中，所述檢測包含DNA的樣品中DNA片段的特定基因組位置的甲基化的方法包括以下步驟：用亞硫酸氫鈉處理包含特定基因組位置的DNA片段，所述亞硫酸氫鈉處理能夠使得DNA片段中未甲基化的胞嘧啶轉(zhuǎn)化為尿嘧啶；將經(jīng)亞硫酸氫鈉處理過的所述DNA片段變性為單鏈DNA片段；環(huán)化所述單鏈DNA片段；將所述環(huán)化的單鏈DNA片段制備為包含所述特定基因組位置的DNA測序文庫；對所述DNA測序文庫進(jìn)行測序以鑒定所述單鏈DNA片段的序列。

本發(fā)明中所述的“亞硫酸氫鈉處理”是指利用亞硫酸氫鈉處理目標(biāo)DNA片段，使得目標(biāo)DNA片段中未甲基化的胞嘧啶(C)轉(zhuǎn)化為尿嘧啶(U)，而甲基化的胞嘧啶保持不變。具體地，在一定的溫度和pH條件下，利用亞硫酸氫鈉將變性DNA(單鏈DNA)中的胞嘧啶轉(zhuǎn)化為胞嘧啶-亞硫酸氫鹽衍生物，對胞嘧啶-亞硫酸氫鹽衍生物進(jìn)行水解脫氨基，得到尿嘧啶-亞硫酸氫鹽衍生物，最后，在一定條件下將尿嘧啶-亞硫酸氫鹽衍生物脫磺酸基得到尿嘧啶；在此反應(yīng)中只有未甲基化的胞嘧啶在亞硫酸氫鹽處理下才會發(fā)生堿基變化，甲基化的胞嘧啶仍然保持不變。

在一些實(shí)施方式中，若起始的DNA片段>5kb，則所述檢測包含DNA的樣品中DNA片段的特定基因組位置的甲基化的方法進(jìn)一步包括在亞硫酸氫鹽處理前對所述DNA片段進(jìn)行切割處理(包括但不限于機(jī)械打斷、使用特定的限制性內(nèi)切酶進(jìn)行酶切等)，使得切割得到的DNA片段大小適合后續(xù)處理，所述適合后續(xù)處理的DNA片段大小為0.1-5kb、0.1-1kb、1-2kb、2-3kb、3-4kb、4-5kb、0.2-0.4kb、0.5-1kb或0.1-0.5kb，并且使得所述切割得到的DNA片段包含所述特定基因組位置(目標(biāo)檢測位置)。在一些實(shí)施方式中，若起始的DNA片段>0.5kb，則需要在亞硫酸氫鹽處理前對所述DNA片段進(jìn)行切割處理，切割得到的DNA片段大小為0.1-0.2kb、0.1-0.3kb、0.1-0.4kb、0.2-0.3kb、0.2-0.4kb、0.2-0.5kb、0.3-0.4kb、0.3-0.5kb、0.4-0.5kb或0.1-0.5kb。

本發(fā)明中所述的“將DNA片段變性為單鏈DNA的方法”是指本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的任何方法，包括但不限于熱變性(例如高于90℃)、堿(例如NaOH)處理等。

在一些實(shí)施方式中，在亞硫酸氫鈉處理前對所述DNA片段進(jìn)行切割處理，使得切割得到的DNA片段大小為0.1-5kb、0.1-1kb、1-2kb、2-3kb、3-4kb、4-5kb、0.2-0.4kb、0.5-1kb或0.1-0.5kb，并且所述切割得到的DNA片段包含所述特定基因組位置。

在一些實(shí)施方式中，包含在所述樣品中的DNA為細(xì)胞外的游離DNA。在一些實(shí)施方式中，包含在所述細(xì)胞外的游離DNA優(yōu)選地為循環(huán)腫瘤DNA。

在一些實(shí)施方式中，在變性處理前在所述DNA片段一端或兩端加上DNA接頭。在另一些實(shí)施方式中，在經(jīng)亞硫酸氫鈉處理前在所述DNA片段一端或兩端加上接頭。在一些實(shí)施方式中，所述接頭可耐受亞硫酸氫鹽處理。

本發(fā)明中所述的“接頭”是指根據(jù)需要在DNA片段(單鏈或雙鏈)的一端或兩端附加的特異性DNA序列，其通常在5-50bp長度范圍內(nèi)。在一些實(shí)施方式中，在DNA片段為雙鏈的情況下，可以通過設(shè)計在單鏈接頭中包含與DNA片段的末端連接的序列或部分(例如雜交互補(bǔ)區(qū)、或者隨機(jī)雜交短序列，例如poly-T)，之后通過將所述接頭與目標(biāo)DNA片段的互補(bǔ)鏈進(jìn)行分子雜交，并且在雜交后通過加入聚合酶(如逆轉(zhuǎn)錄酶)來延伸接頭將所述接頭連接至目標(biāo)DNA片段的末端。在另一些實(shí)施方式中，在DNA片段為雙鏈并且DNA片段末端為粘性末端的情況下，可以設(shè)計接頭序列并利用與接頭互補(bǔ)的序列與其退火互補(bǔ)形成具有粘性末端的結(jié)構(gòu)，之后通過連接酶將該互補(bǔ)短序列連接至目標(biāo)DNA雙鏈上，在后續(xù)過程中使DNA變性形成單鏈，從而達(dá)到在DNA片段末端加上接頭的目的。在又一些實(shí)施方式中，在DNA片段為單鏈的情況下，可以對DNA片段及接頭序列進(jìn)行磷酸化、去磷酸化處理，后利用單鏈連接酶將接頭序列連接至DNA片段的末端。

本發(fā)明中所述的“可耐受亞硫酸氫鹽”是指所述接頭中不含胞嘧啶或者不含未甲基化的胞嘧啶，從而在DNA片段經(jīng)亞硫酸氫鈉處理時，所述接頭的序列不發(fā)生改變。

在一些實(shí)施方式中，所述在DNA片段一端或兩端加上的接頭包含第二類限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)。本發(fā)明中所述“第二類限制性內(nèi)切酶”是指能識別和切割特定的4～8個堿基對序列的內(nèi)切酶，其中大多數(shù)被識別的序列具有回文結(jié)構(gòu)；第二類限制性內(nèi)切酶的切割方式有三種：1)切割產(chǎn)生5'突出的粘性末端(sticky ends)，2)切割產(chǎn)生3'突出的粘性末端，3)切割產(chǎn)生平頭末端(blunt ends)。本發(fā)明中所述“第二類限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)”包括本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的任何第二類限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)，包括但不限于：ApaI、BamHI、BglII、EcoRI、HindIII、HpaII、KpnI、MspI、NcoI、NdeI、NheI、NotI、SacI、SalI、SmaI、SphI、XbaI、XhoI、XmaI。在一些實(shí)施方式中，所述第二類限制性內(nèi)切酶選自下組：HpaII、MspI、SmaI、XmaI、BamHI。在一些實(shí)施方式中，在所述DNA片段兩端均加上接頭，并且兩端加上的限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)接頭是相同的。例如，在一些實(shí)施方式中在所述DNA片段兩端均加上選自下組中的任意一種限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)接頭：HpaII、MspI、SmaI、XmaI、BamHI。在另一些實(shí)施方式中，在所述DNA片段兩端均加上接頭，并且兩端加上的限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)接頭是不同的。例如，在一些實(shí)施方式中在所述DNA片段兩端加上選自HpaII、MspI、SmaI、XmaI、BamHI中的任意兩種限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)接頭的組合，例如：HpaII/MspI、SmaI/XmaI的組合等。

在一些實(shí)施方式中，所述在DNA片段一端或兩端加上的接頭包含DNA分子標(biāo)簽。本發(fā)明中使用的術(shù)語“分子標(biāo)簽”是指一段用于作為標(biāo)簽的序列，其可被連接至所述DNA片段的5’端或者3’端。在DNA測序中，特別是在高通量測序技術(shù)中，分子標(biāo)簽被用以標(biāo)記特定的序列，在經(jīng)過擴(kuò)增、測序后可以根據(jù)標(biāo)簽序列的計數(shù)來確定被標(biāo)記基因的表達(dá)量。

本發(fā)明中所述的“環(huán)化單鏈DNA片段的方法”是指本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的任何方法，包括但不限于使用高效環(huán)化試劑環(huán)化單鏈DNA。在一些實(shí)施方式中，所述高效環(huán)化試劑環(huán)化是DNA連接酶。在一些實(shí)施方式中，所述DNA連接酶是單鏈DNA連接酶(例如但不限于CircLigase^TM ssDNA Ligase，Epicentre科技公司)，其是一種熱穩(wěn)定的、APT依賴的連接酶，其能夠催化單鏈DNA的5'-磷酸和3'-羥基基團(tuán)的連接，從而使單鏈DNA環(huán)化。CircLigase^TMssDNA Ligase與T4DNA Ligase和DNA Ligase不同，T4DNA Ligase和DNA Ligase僅能夠連接彼此相鄰的互補(bǔ)的DNA序列的末端，而CircLigase^TMssDNA Ligase可以在沒有互補(bǔ)序列存在的情況下連接單鏈DNA末端，大于15個堿基的線性單鏈DNA，包括cDNA，均可被CircLigase環(huán)化。因此，該酶在將線性單鏈DNA連接成環(huán)狀單鏈DNA中具有重要作用。環(huán)狀的單鏈DNA分子可被用作滾環(huán)復(fù)制或滾環(huán)轉(zhuǎn)錄研究的底物。

在一些實(shí)施方式中，在將所述單鏈DNA片段環(huán)化前，對所述DNA片段的5’末端進(jìn)行磷酸化處理和對3’末端進(jìn)行去磷酸化處理。所述5’末端的磷酸化和3’末端的去磷酸化可以通過本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的任何方法進(jìn)行，包括但不限于利用T4多聚核苷酸激酶(T4PNK)催化。T4PNK是一種多聚核苷酸5'羥基激酶，可以催化ATP的γ位磷酸基團(tuán)向單鏈或雙鏈DNA、RNA、寡核苷酸或帶有3'磷酸基團(tuán)的單核苷酸的5'羥基轉(zhuǎn)移。其他NTP也可產(chǎn)生相同的反應(yīng)：5'-OH+NTP→5'-P+NDP。T4PNK同時具有3'磷酸酯酶活性，可催化3'磷酸化的多聚核苷酸的去磷酸化：3'-P→3'-OH+Pi(最適pH為5.9左右)。T4PNK的激酶活性在C-末端附近，而磷酸酯酶活性在N-末端附近，因此可用于使寡核苷酸、DNA或RNA的5'端磷酸化和/或去除3'端磷酸基團(tuán)，以確保后續(xù)連接反應(yīng)順利進(jìn)行。

本發(fā)明中所述的“DNA測序文庫”是指豐度達(dá)到可測序的程度的DNA片段集合，其中所述DNA片段集合中每條片段的一端或兩端包含與測序用引物部分或全部互補(bǔ)的特定序列，從而可以直接用于后續(xù)的測序上機(jī)。

在一些實(shí)施方式中，將環(huán)化的單鏈DNA片段制備為DNA測序文庫的步驟包括：在所述環(huán)化步驟后擴(kuò)增環(huán)化的所述單鏈DNA片段，并且獲得由包含所述特定基因組位置的DNA的擴(kuò)增產(chǎn)物組成的所述DNA測序文庫。在一些實(shí)施方式中，所述擴(kuò)增的步驟使用反向PCR擴(kuò)增。在一些實(shí)施方式中，所述擴(kuò)增的步驟使用滾環(huán)擴(kuò)增。在一些實(shí)施方式中，將環(huán)化的單鏈DNA片段制備為DNA測序文庫的步驟包括在擴(kuò)增產(chǎn)物的一端或兩端加上可用于測序的接頭序列。在一些實(shí)施方式中，在變性處理前、或者在經(jīng)亞硫酸氫鈉處理前在所述DNA片段一端或兩端加上接頭。在一些實(shí)施方式中，所述在DNA片段一端或兩端加上的接頭包含與擴(kuò)增步驟使用的引物部分或全部互補(bǔ)的序列。

本發(fā)明所述的“反向PCR”是指在已知一段序列的情況下，通過基于該已知序列設(shè)計引物，并且在引物外側(cè)合成DNA從而達(dá)到擴(kuò)增已知序列旁側(cè)的DNA的目的。在本發(fā)明的一些實(shí)施方式中，反向PCR中的已知序列為所述DNA片段的特定基因組位置中的一段已知序列。在本發(fā)明的另一些實(shí)施方式中，反向PCR中的已知序列可以為前述的在DNA片段兩端加上的接頭的部分或全部。

本發(fā)明所述的“滾環(huán)擴(kuò)增”是指一條引物結(jié)合到環(huán)狀DNA上后，在DNA聚合酶作用下被延伸，產(chǎn)物是具有大量重復(fù)序列(與環(huán)狀DNA完全互補(bǔ))的線狀DNA單鏈。同樣的，在本發(fā)明的一些實(shí)施方式中，滾環(huán)擴(kuò)增中的引物可以是針對所述DNA片段的特定基因組位置中的一段已知序列的?；蛘撸诒景l(fā)明的另一些實(shí)施方式中，滾環(huán)擴(kuò)增中的引物可以包括與前述的在DNA片段兩端加上的接頭的部分或全部互補(bǔ)的序列。

在一些實(shí)施方式中，所述測序步驟使用高通量DNA測序技術(shù)測定所述擴(kuò)增產(chǎn)物的序列。

經(jīng)亞硫酸氫鈉處理后的DNA在測序時，或者上述經(jīng)亞硫酸氫鈉處理后的DNA在經(jīng)擴(kuò)增后(例如經(jīng)反向PCR擴(kuò)增或者滾環(huán)擴(kuò)增后)，由未甲基化的胞嘧啶(C)轉(zhuǎn)化的尿嘧啶(U)將轉(zhuǎn)變?yōu)樾叵汆奏?T)。通過對經(jīng)亞硫酸氫鹽處理的DNA片段進(jìn)行測序并將測序結(jié)構(gòu)與未被亞硫酸氫鹽處理的DNA片段的序列(已知序列或者通過對未被亞硫酸氫鹽處理的DNA片段進(jìn)行測序得到的測序結(jié)果)進(jìn)行比較，可以確定DNA片段中的特定基因組位置的甲基化情況，具體地可以通過在序列比對結(jié)果發(fā)現(xiàn)具有由C到T的轉(zhuǎn)變的位置即為未被甲基化的位置。

在一些實(shí)施方式中，所述的方法中的將環(huán)化的單鏈DNA片段制備為DNA測序文庫的步驟進(jìn)一步包括：在擴(kuò)增步驟后使用寡核苷酸探針富集所述擴(kuò)增產(chǎn)物。本發(fā)明中所述的“使用寡核苷酸探針富集包含所述特定基因組位置的DNA的擴(kuò)增產(chǎn)物”的步驟可以通過本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的任何方法完成，例如但不限于磁珠富集、標(biāo)簽pull-down等。

本發(fā)明的另一個方面提供了一種檢測包含DNA的樣品中DNA片段的特定基因組位置的甲基化的試劑盒。在一些實(shí)施方式中，該試劑盒包括：亞硫酸氫鈉，所述亞硫酸氫鈉以使得DNA片段中未甲基化的胞嘧啶轉(zhuǎn)化為尿嘧啶；環(huán)化試劑，所述環(huán)化試劑可以將單鏈DNA片段環(huán)化；測序試劑。

在一些實(shí)施方式中，該試劑盒進(jìn)一步包括切割試劑，其可用于在亞硫酸氫鈉處理前對所述DNA片段進(jìn)行切割處理，使得切割得到的DNA片段大小適合后續(xù)處理，所述適合后續(xù)處理的DNA片段大小為0.1-5kb、0.1-1kb、1-2kb、2-3kb、3-4kb、4-5kb、0.1-0.5kb、0.5-1kb或0.2-0.4kb，并且使得所述切割得到的DNA片段包含所述特定基因組位置(目標(biāo)檢測位置)。在一些實(shí)施方式中，所述切割試劑為鹽溶液。在一些實(shí)施方式中，所述切割試劑為TE溶液(需要配合使用不包含在試劑盒內(nèi)的DNA機(jī)械打斷儀器)。在另一些實(shí)施方式中，所述切割試劑為內(nèi)切酶(或內(nèi)切酶及其反應(yīng)溶液)。

在一些實(shí)施方式中，該試劑盒進(jìn)一步包括擴(kuò)增試劑，其可用于擴(kuò)增包含特定基因組位置的單鏈環(huán)狀DNA。在一些實(shí)施方式中，所述擴(kuò)增試劑包括DNA聚合酶、反應(yīng)溶液和dNTPs。在一些實(shí)施方式中，所述擴(kuò)增試劑為反向PCR擴(kuò)增試劑。在另一些實(shí)施方式中，所述擴(kuò)增試劑為滾環(huán)擴(kuò)增試劑。

在一些實(shí)施方式中，該試劑盒進(jìn)一步包括接頭連接試劑，其可用于在變性處理前、或者在經(jīng)亞硫酸氫鈉處理前在所述DNA片段一端或兩端加上接頭序列。在一些實(shí)施方式中，所述接頭連接試劑包括接頭序列DNA片段、連接酶、反應(yīng)溶液。在一些實(shí)施方式中，所述接頭序列DNA片段包括選自下組的一種或幾種：限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)序列、分子標(biāo)簽序列、與擴(kuò)增步驟使用的引物部分或全部互補(bǔ)的序列。

在一些實(shí)施方式中，所述環(huán)化試劑為高效環(huán)化試劑。在一些實(shí)施方式中，所述高效環(huán)化試劑為CircLigase。在一些實(shí)施方式中，所述環(huán)化試劑進(jìn)一步包括T4PNK，其可用于對DNA片段進(jìn)行5’末端進(jìn)行磷酸化處理和3’末端進(jìn)行去磷酸化處理。

本發(fā)明的再一個方面提供了一種環(huán)化試劑在制備檢測包含DNA的樣品中DNA片段的特定基因組位置的甲基化的試劑盒中的用途，其中所述檢測包括以下步驟：用亞硫酸氫鈉處理包含特定基因組位置的所述DNA片段，所述亞硫酸氫鈉處理可以使得DNA片段中未甲基化的胞嘧啶轉(zhuǎn)化為尿嘧啶；將經(jīng)亞硫酸氫鈉處理過的所述DNA片段變性為單鏈DNA片段；環(huán)化所述單鏈DNA片段；DNA測序。

在一些實(shí)施方式中，所述檢測進(jìn)一步包括在所述環(huán)化步驟后擴(kuò)增環(huán)化的所述單鏈DNA片段，并且所述測序步驟為測定擴(kuò)增產(chǎn)物的序列。

在一些實(shí)施方式中，所述檢測進(jìn)一步包括在變性處理前、或者在經(jīng)亞硫酸氫鈉處理前在所述DNA片段一端或兩端加上的接頭序列。

在一些實(shí)施方式中，所述檢測進(jìn)一步包括在將所述單鏈DNA片段環(huán)化前，對所述DNA片段的5’末端進(jìn)行磷酸化處理和對3’末端進(jìn)行去磷酸化處理。

在一些實(shí)施方式中，所述檢測進(jìn)一步包括在測序步驟前使用寡核苷酸探針富集包含特定基因組位置DNA片段的的擴(kuò)增產(chǎn)物。

實(shí)施例

以下將通過一些非限制性實(shí)施例進(jìn)一步描述本發(fā)明。需要說明的是這些實(shí)施例僅用于進(jìn)一步說明本發(fā)明的技術(shù)特征，并非旨在也不能夠被解釋為對本發(fā)明的限制。所述實(shí)驗(yàn)例不包含本領(lǐng)域一般技術(shù)人員所公知的傳統(tǒng)方法(不同種類樣本中DNA的提取、純化等)的詳細(xì)描述。

亞硫酸氫鈉處理

首先，通過DNA提取試劑盒或者通過DNA富集工具(DNA吸附柱、磁珠等)等提取或富集樣品中包含的DNA，利用Nanodrop測量DNA濃度，并進(jìn)行記錄。

取2μg DNA，用雙蒸水稀釋至200μl，根據(jù)實(shí)際需求選擇使用DNaseI酶或者限制性內(nèi)切酶進(jìn)行消化、超聲打斷、反復(fù)凍融等方法使上述DNA斷裂為約200-800bp的片段(可選步驟)。通常采用超聲打斷，使用參數(shù)為振幅40、功率50w、時間15sec、間隔5sec、次數(shù)15，0-4℃低溫下進(jìn)行(超聲參數(shù)可以根據(jù)實(shí)際情況進(jìn)行摸索調(diào)整)。利用凝膠電泳確認(rèn)經(jīng)處理后的DNA片段大小在所需范圍內(nèi)。

取0.5μg的上述DNA于1.5ml EP管中，并加入5.5μl新鮮配置的3M的NaOH溶液，將EP管置于42℃水浴中孵育30min(在此過程中發(fā)生DNA變性得到單鏈DNA)。水浴期間,配制10mM氫醌和3.6mM亞硫酸氫鈉溶液。其中3.6M的亞硫酸氫鈉溶液配置步驟如下：使用雙蒸水溶解1.88g亞硫酸氫鈉，并以3M的NaOH滴定溶液至pH為5.0，定容為5ml。在42℃水浴孵育30min結(jié)束后，取30μl上述10mM氫醌至EP管中(溶液變成淡黃色)，之后再取520μl上述3.6M的亞硫酸氫鈉溶液加入EP管中。在EP管外包上鋁箔紙，輕柔顛倒混勻溶液，之后在EP管中加入200μl石蠟油封液，以防止水分蒸發(fā)。將上述EP管進(jìn)一步置于50℃水浴中避光孵育16hr(完成胞嘧啶-亞硫酸氫鹽衍生物至尿嘧啶-亞硫酸氫鹽衍生物的轉(zhuǎn)化)。之后利用市售的DNA純化柱等方式將包含尿嘧啶-亞硫酸氫鹽衍生物的DNA吸附于純化柱上，經(jīng)純化洗脫后得到50μl的DNA洗脫液。加入5.5μl新鮮配制的3M NaOH，室溫放置15min；之后加入33μl 10M的乙酸銨以中和NaOH，使溶液pH于7.0左右，并加入4μl 10mg/ml的糖原作為沉淀指示劑(因?yàn)槠渑c乙醇混合后可產(chǎn)生沉淀，便于在用乙醇沉淀離心后識別回收物)；最后在溶液中加入270μl的冰(0-4℃)無水乙醇，將EP管置于-20℃環(huán)境中2-6hr(或過夜)以沉淀DNA(對應(yīng)脫磺酸基步驟)。經(jīng)沉淀的DNA可經(jīng)多次70％的乙醇洗滌后干燥，再用雙蒸水復(fù)溶獲得經(jīng)亞硫酸氫鈉處理修飾后的DNA溶液。

在此反應(yīng)中只有未甲基化的胞嘧啶在亞硫酸氫鹽處理下才會發(fā)生堿基變化，甲基化的胞嘧啶仍然保持不變(參見圖1)。

應(yīng)當(dāng)理解，上述亞硫酸氫鈉處理的實(shí)驗(yàn)操作僅為示例性的，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以采用任何市售的亞硫酸氫鈉處理試劑盒完成該步驟，其中在該步驟中使用的試劑、反應(yīng)條件、反應(yīng)時間等各不相同但基本原理基本一致。

DNA環(huán)化

可選地，可以對上述經(jīng)亞硫酸氫鹽處理的DNA片段進(jìn)行5’末端的磷酸化和3’末端的去磷酸化處理(參見附圖2中虛線框中內(nèi)容)。具體地，可以使用T4PNK并依照相應(yīng)的說明書配置反應(yīng)液并進(jìn)行DNA片段的處理。例如，在50μl反應(yīng)體系中加入5-50pmol單鏈DNA模板、5μl的10x T4PNK反應(yīng)溶液、1μl的1mM ATP和10U的T4PNK酶，定容至50μl后將反應(yīng)體系置于37℃孵育30分鐘，最后經(jīng)80℃孵育10min以使得T4PNK失活。

將經(jīng)亞硫酸氫鹽處理的DNA片段(經(jīng)5’末端的磷酸化和3’末端的去磷酸化處理或未經(jīng)該處理)置于95℃孵育2min使得上述DNA片段變性為單鏈DNA片段。接著根據(jù)如下配方配置反應(yīng)液：10pmol單鏈DNA模板、2μl CircLigase10x的反應(yīng)溶液、1μl 1mM的ATP、1μl 50mM的MnCl₂、1μl CircLigase^TM ssDNA Ligase(100U)，定容至20μl。并將上述配置的反應(yīng)液置于60℃孵育1個小時。最后將反應(yīng)溶液置于80℃孵育10min以使得CircLigase^TM ssDNA Ligase失活。(參見附圖2中實(shí)線框中內(nèi)容)

環(huán)化DNA的擴(kuò)增

上述環(huán)化的DNA可以直接用于后續(xù)測序，或者當(dāng)該環(huán)化的DNA豐度較低時，可以先對其進(jìn)行擴(kuò)增再將擴(kuò)增產(chǎn)物應(yīng)用于后續(xù)的測序步驟中去。

對環(huán)化DNA的擴(kuò)增可以采取本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的任何方法，較為常見的包括反向擴(kuò)增和滾環(huán)擴(kuò)增。

反向PCR擴(kuò)增

反向PCR擴(kuò)增可用于研究與已知DNA區(qū)段相連接的未知區(qū)段的序列，也可用于擴(kuò)增環(huán)狀的DNA片段，其中使用的引物對雖然與已知DNA區(qū)段內(nèi)的兩段相鄰序列互補(bǔ)，但兩引物3’端是相互反向的(參見附圖3中的引物對：引物1和引物2、引物3和引物4；即每對引物對中兩個引物的5’端相鄰)。通過反向PCR擴(kuò)增引物向上下游進(jìn)行延伸，從而環(huán)狀DNA的線性擴(kuò)增產(chǎn)物(具體參見附圖3)。

在反向PCR擴(kuò)增中使用的反應(yīng)條件與經(jīng)典的聚合酶鏈反應(yīng)所用條件的相似，例如使用Taq聚合酶，先對DNA進(jìn)行94℃的30秒變性，之后重復(fù)58℃引物退火30秒合70℃延伸3分鐘的步驟30個循環(huán)。

滾環(huán)擴(kuò)增

可使用針對環(huán)化DNA已知的部分序列設(shè)計的引物或以針對環(huán)化DNA在環(huán)化前一端或兩端接入的接頭部分序列的引物來擴(kuò)增環(huán)化的DNA，以產(chǎn)生多拷貝的線性連接的環(huán)化DNA的互補(bǔ)序列(參見附圖4)。在滾環(huán)擴(kuò)增中使用的反應(yīng)條件也與經(jīng)典的聚合酶鏈反應(yīng)所用條件的相似，在此不做贅述。

DNA片段的接頭

在環(huán)化前，或者在亞硫酸氫鹽處理前，可以根據(jù)需要將特異性序列結(jié)合到DNA片段(單鏈或雙鏈)的一端或兩端，被加到DNA片段兩端的特異性序列分別稱為第一接頭和/或第二接頭。

在一個實(shí)施方案中，第一接頭含有能使其與DNA片段的末端連接的序列或部分(例如雜交互補(bǔ)區(qū)、或者隨機(jī)雜交短序列，例如poly-T)，則可通過與目標(biāo)DNA片段的互補(bǔ)鏈進(jìn)行分子雜交，并且在雜交后通過加入聚合酶(如逆轉(zhuǎn)錄酶)來延伸該第一接頭將所述第一接頭連接至目標(biāo)DNA片段的末端(在此情況下，目標(biāo)DNA片段處于雙鏈狀態(tài)下)。

在另一個實(shí)施方案中，第一接頭可選擇地可以包含能用于后續(xù)環(huán)化、擴(kuò)增的其它特定的序列。不限于上述概念，這種特定的序列可能包含有限制性內(nèi)切核酸酶位點(diǎn)、聚合酶結(jié)合位點(diǎn)、聚合酶終止位點(diǎn)、發(fā)夾環(huán)結(jié)構(gòu)等。例如，該接頭可含有限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)，借此可在DNA的一端或兩端產(chǎn)生粘性末端。如果DNA片段兩端均連接了能夠產(chǎn)生粘性末端的接頭，并且這兩個粘性末端是互補(bǔ)的，則所得到的具有接頭的DNA片段可以被環(huán)化。將第一接頭連接于DNA片段。又例如，該接頭可能含有與后續(xù)擴(kuò)增使用的引物的部分或全部區(qū)域互補(bǔ)的序列。

在又一個實(shí)施方案中，第一接頭可選擇的可在其3’端或其5’端包含分子標(biāo)簽或包含特定序列。在后續(xù)的擴(kuò)增中可以利用上述分子標(biāo)簽或特定序列對目標(biāo)DNA進(jìn)行特異性的擴(kuò)增?；蛘咴诤罄m(xù)的測序中可以利用上述分子標(biāo)簽或特定序列對于包含該特定序列的分子進(jìn)行特異性的富集。

在一些特殊的實(shí)施方案中，接頭可選擇的可包含上述的一種或多種。

DNA測序

使用高通量DNA測序的方法對DNA文庫進(jìn)行測序。測序前可以通過利用寡核苷酸探針對目標(biāo)測序DNA進(jìn)行富集。

對于DNA甲基化的測序可以基本通過對經(jīng)亞硫酸氫鹽處理的DNA片段、或者經(jīng)擴(kuò)增的經(jīng)亞硫酸氫鹽處理的DNA片段進(jìn)行測序并將測序結(jié)構(gòu)與未被亞硫酸氫鹽處理的DNA片段的序列(已知序列或者通過對未被亞硫酸氫鹽處理的DNA片段進(jìn)行測序得到的測序結(jié)果)進(jìn)行比較，之后通過在序列比對結(jié)果發(fā)現(xiàn)具有由C到T的轉(zhuǎn)變的位置即可能為被甲基化的位置。根據(jù)每個可能被甲基化的位置在多個拷貝中出現(xiàn)的頻率評估該位置是否確實(shí)存在甲基化。

應(yīng)當(dāng)理解，盡管在上文的實(shí)施例中詳細(xì)地描述了本發(fā)明公開的方法的一些具體步驟的操作方法，但是這種描述僅僅是示例性的而并非是對本發(fā)明的限制。實(shí)際上，根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，本技術(shù)領(lǐng)域的一般技術(shù)人員可以通過研究說明書、公開的內(nèi)容及附圖和所附的權(quán)利要求書，理解和實(shí)施對披露的實(shí)施方式的其他改變。在權(quán)利要求中，措詞“包括”不排除其他的元素和步驟，并且措辭“一”、“一個”不排除復(fù)數(shù)。