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甲基化DNA檢測(cè)方法與流程

文檔序號(hào):12412667閱讀:來(lái)源:國(guó)知局

技術(shù)特征:

1.一種用于檢測(cè)包含DNA的樣品中DNA片段的特定基因組位置的甲基化的方法,其包括以下步驟:

用亞硫酸氫鈉處理包含特定基因組位置的DNA片段,所述亞硫酸氫鈉處理能夠使得DNA片段中未甲基化的胞嘧啶轉(zhuǎn)化為尿嘧啶;

將經(jīng)亞硫酸氫鈉處理過(guò)的所述DNA片段變性為單鏈DNA片段;

環(huán)化所述單鏈DNA片段;

將所述環(huán)化的單鏈DNA片段制備為包含所述特定基因組位置的DNA測(cè)序文庫(kù);

對(duì)所述DNA測(cè)序文庫(kù)進(jìn)行測(cè)序以鑒定所述單鏈DNA片段的序列。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法,其中在變性處理前在所述DNA片段一端或兩端加上接頭。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法,其中在經(jīng)亞硫酸氫鈉處理前在所述DNA片段一端或兩端加上接頭。

4.根據(jù)權(quán)利要求2或3所述的方法,其中所述接頭可耐受亞硫酸氫鹽處理。

5.根據(jù)權(quán)利要求2或3所述的方法,其中所述接頭包括DNA分子標(biāo)簽。

6.根據(jù)權(quán)利要求2或3所述的方法,其中所述接頭包括第二類(lèi)限制性?xún)?nèi)切酶位點(diǎn)。

7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法,其中所述第二類(lèi)限制性?xún)?nèi)切酶選自下組:HpaII/MspI、SmaI/XmaI、BamHI、HpaII。

8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法,其中使用高效環(huán)化試劑環(huán)化所述單鏈DNA片段。

9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法,其中所述高效環(huán)化試劑為單鏈DNA連接酶。

10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的方法,其中在將所述單鏈DNA片段環(huán)化前,對(duì)所述DNA片段的5’末端進(jìn)行磷酸化處理和對(duì)3’末端進(jìn)行去磷酸化處理。

11.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法,其中在亞硫酸氫鈉處理前對(duì)所述DNA片段進(jìn)行切割處理,使得切割得到的DNA片段大小為0.1-5kb、0.1-1kb、1-2kb、2-3kb、3-4kb、4-5kb、0.2-0.4kb、0.5-1kb或0.1-0.5kb,并且所述切割得到的DNA片段包含所述特定基因組位置。

12.根據(jù)權(quán)利要求1-3中任一所述的方法,其中所述將環(huán)化的單鏈DNA片段制備為DNA測(cè)序文庫(kù)的步驟包括:在所述環(huán)化步驟后擴(kuò)增環(huán)化的所述單鏈DNA片段,并且獲得由包含所述特定基因組位置的DNA擴(kuò)增產(chǎn)物組成的所述DNA測(cè)序文庫(kù)。

13.根據(jù)權(quán)利要求12所述的方法,其中所述擴(kuò)增的步驟使用反向PCR擴(kuò)增。

14.根據(jù)權(quán)利要求12所述的方法,其中所述擴(kuò)增的步驟使用滾環(huán)擴(kuò)增。

15.根據(jù)權(quán)利要求12所述的方法,其中所述接頭包含與擴(kuò)增步驟使用的引物部分或全部互補(bǔ)的序列。

16.根據(jù)權(quán)利要求12所述的方法,其中所述測(cè)序步驟使用高通量DNA測(cè)序技術(shù)測(cè)定所述DNA測(cè)序文庫(kù)的DNA序列。

17.根據(jù)權(quán)利要求12所述的方法,其中所述將環(huán)化的單鏈DNA片段制備為DNA測(cè)序文庫(kù)的步驟進(jìn)一步包括:在擴(kuò)增步驟后使用寡核苷酸探針富集所述擴(kuò)增產(chǎn)物。

18.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法,其中所述樣品中的DNA包含細(xì)胞外的游離DNA,優(yōu)選地,所述細(xì)胞外游離DNA也包括循環(huán)腫瘤DNA。

19.一種用于檢測(cè)包含DNA的樣品中DNA片段的特定基因組位置的甲基化的試劑盒,包括:

亞硫酸氫鈉,所述亞硫酸氫鈉以使得DNA片段中未甲基化的胞嘧啶轉(zhuǎn)化為尿嘧啶;

環(huán)化試劑,所述環(huán)化試劑能夠?qū)捂淒NA片段環(huán)化;

測(cè)序試劑。

20.根據(jù)權(quán)利要求19所述的試劑盒,其中進(jìn)一步包括切割試劑,其可用于在亞硫酸氫鈉處理前對(duì)所述DNA片段進(jìn)行切割處理,使得切割得到的DNA片段大小為0.1-5kb、0.1-1kb、1-2kb、2-3kb、3-4kb、4-5kb、0.2-0.4kb、0.5-1kb或0.1-0.5kb。

21.根據(jù)權(quán)利要求19所述的試劑盒,其中進(jìn)一步包括擴(kuò)增試劑,其可用于擴(kuò)增包含所述特定基因組位置的單鏈環(huán)狀DNA。

22.根據(jù)權(quán)利要求21所述的試劑盒,其中所述擴(kuò)增試劑包括DNA聚合酶、反應(yīng)溶液和dNTPs。

23.根據(jù)權(quán)利要求21所述的試劑盒,其中所述擴(kuò)增試劑包括用于反向PCR擴(kuò)增的試劑。

24.根據(jù)權(quán)利要求21所述的試劑盒,其中所述擴(kuò)增試劑包括用于滾環(huán)擴(kuò)增的試劑。

25.根據(jù)權(quán)利要求19所述的試劑盒,其中進(jìn)一步包括接頭連接試劑,其可用于在變性處理前、或者在經(jīng)亞硫酸氫鈉處理前在所述DNA片段一端或兩端加上接頭序列。

26.根據(jù)權(quán)利要求25所述的試劑盒,其中所述接頭連接試劑包括接頭序列DNA片段、連接酶、反應(yīng)溶液。

27.根據(jù)權(quán)利要求19所述的試劑盒,其中所述環(huán)化試劑為高效環(huán)化試劑。

28.根據(jù)權(quán)利要求27所述的試劑盒,其中所述高效環(huán)化試劑為單鏈DNA連接酶。

29.根據(jù)權(quán)利要求19所述的試劑盒,其中所述環(huán)化試劑進(jìn)一步包括T4PNK,其可用于對(duì)DNA片段進(jìn)行5’末端進(jìn)行磷酸化處理和3’末端進(jìn)行去磷酸化處理。

30.一種環(huán)化試劑在制備檢測(cè)包含DNA的樣品中DNA片段的特定基因組位置的甲基化的試劑盒中的用途,其中所述檢測(cè)包括以下步驟:

用亞硫酸氫鈉處理包含特定基因組位置的所述DNA片段,所述亞硫酸氫鈉處理能夠使得DNA片段中未甲基化的胞嘧啶轉(zhuǎn)化為尿嘧啶;

將經(jīng)亞硫酸氫鈉處理過(guò)的所述DNA片段變性為單鏈DNA片段;

環(huán)化所述單鏈DNA片段;

DNA測(cè)序。

31.根據(jù)權(quán)利要求30所述的用途,其中所述檢測(cè)進(jìn)一步包括在所述環(huán)化步驟后擴(kuò)增環(huán)化的所述單鏈DNA片段,并且所述測(cè)序步驟為測(cè)定擴(kuò)增產(chǎn)物的序列。

32.根據(jù)權(quán)利要求30所述的用途,其中所述檢測(cè)進(jìn)一步包括在變性處理前在所述DNA片段一端或兩端加上的接頭序列。

33.根據(jù)權(quán)利要求30所述的用途,其中所述檢測(cè)進(jìn)一步包括在經(jīng)亞硫酸氫鈉處理前在所述DNA片段一端或兩端加上的接頭序列。

34.根據(jù)權(quán)利要求30或31所述的用途,其中所述檢測(cè)進(jìn)一步包括在將所述單鏈DNA片段環(huán)化前,對(duì)所述DNA片段的5’末端進(jìn)行磷酸化處理和對(duì)3’末端進(jìn)行去磷酸化處理。

35.根據(jù)權(quán)利要求30所述的用途,其中所述檢測(cè)進(jìn)一步包括在測(cè)序步驟前使用寡核苷酸探針富集包含特定基因組位置的DNA片段的擴(kuò)增產(chǎn)物。

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