本發(fā)明屬于微生物菌株技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種降解煙草梗絲果膠和木聚糖的真菌，并進(jìn)一步公開(kāi)其在煙草領(lǐng)域中的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

煙草是茄科煙草屬植物，煙梗即是煙葉之粗硬葉脈，約占葉重25％-30％。煙梗經(jīng)切絲工序后制定的一定寬度的細(xì)絲，用于卷煙的加工之用。

眾所周知，梗絲在卷煙配方中起著重要的作用，是減害降焦的主要手段之一：一方面，梗絲能降低卷煙焦油、煙堿和CO等有害成分的含量，從而降低卷煙的危害；另一方面，梗絲能提高煙絲的填充值，降低卷煙的單箱耗絲量，從而降低生產(chǎn)成本。但是，由于梗絲中的細(xì)胞壁物質(zhì)(果膠、纖維素、半纖維素和木質(zhì)素等)含量較多而香味物質(zhì)含量很少，使得感官品質(zhì)存在刺激性大、雜氣重、香氣質(zhì)量較差的缺點(diǎn)，而在形態(tài)及色澤方面與葉絲也存在著較大差異。研究表明，煙草梗絲細(xì)胞壁的主要成分為果膠和半纖維素，果膠能使梗絲在燃燒過(guò)程中產(chǎn)生木質(zhì)氣，嚴(yán)重影響梗絲的質(zhì)量；而木聚糖是植物細(xì)胞中半纖維素的主要成分，占植物細(xì)胞干重的35％，是自然界中除纖維素之外含量最豐富的多糖，木聚糖使得梗絲在燃燒過(guò)程中產(chǎn)生木質(zhì)氣，嚴(yán)重影響梗絲的質(zhì)量。因此，梗絲更多的是使用在低檔卷煙中，在高檔卷煙中不使用或用量很少，在卷煙中的摻配比例也比較低，導(dǎo)致每年都有大量煙梗廢棄。

煙梗作為煙草原料的一種，是煙草工業(yè)的副產(chǎn)物，是目前卷煙生產(chǎn)企業(yè)無(wú)法完全消化的低質(zhì)原料，目前多作棄置處理。作為煙草生產(chǎn)大國(guó)，我國(guó)更是每年約有數(shù)十萬(wàn)噸煙梗廢棄物被棄置浪費(fèi)，既造成環(huán)境污染，同時(shí) 也是對(duì)自然資源的浪費(fèi)。但同時(shí)，煙梗又是一種富含多種化學(xué)成分包括多種有效天然成分的自然資源，已有研究表明，煙梗中含有的成分種類(lèi)與煙葉成分基本一致，更有研究從煙梗中可以提取煙堿、茄呢醇、煙酸、果膠、植物蛋白等有效成分并加以利用，也成為了煙梗綜合利用的重要途徑。

在我國(guó)，煙梗目前主要用于制備成梗絲以及煙草薄片，然后再將梗絲和薄片攙兌到葉組中，用于卷煙的生產(chǎn)。但是隨著減害降焦工作的不斷推進(jìn)，對(duì)煙草梗絲質(zhì)量的要求越來(lái)越高，因此，對(duì)于梗絲的利用而言，如何改善梗絲的質(zhì)量具有重要的意義。

近年來(lái)，為了提高梗絲的質(zhì)量，許多科技人員從工藝技術(shù)、化學(xué)方法以及生物方法等不同角度對(duì)梗絲進(jìn)行了研究。其中，生物方法由于反應(yīng)條件溫和、反應(yīng)專(zhuān)一以及成本低等特點(diǎn)而備受關(guān)注，成為提高梗絲質(zhì)量研究的重要研究方向。從自然界篩選能有效降解煙梗細(xì)胞壁物質(zhì)的微生物，利用微生物產(chǎn)生的酶處理煙梗，降解其中的大分子物質(zhì)，能在一定程度上提高煙?？诟校哂袕V闊應(yīng)用前景。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

為此，本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題在于提供一種冠突散囊菌菌株，以解決現(xiàn)有技術(shù)中煙草梗絲質(zhì)量較差的問(wèn)題。

為解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明所述的降解煙草梗絲果膠和木聚糖的真菌，其分類(lèi)命名為冠突散囊菌Eurotium cristatum 502，已保藏于武漢大學(xué)中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號(hào)為CCTCC M2016204。

本發(fā)明還公開(kāi)了一種培養(yǎng)所述真菌的方法，其包括將所述冠突散囊菌在適宜于產(chǎn)生子囊孢子的條件下進(jìn)行菌株種子培養(yǎng)，及在適宜于果膠酶和木聚糖酶表達(dá)的培養(yǎng)條件下進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)的步驟。

所述適宜于果膠酶和木聚糖酶表達(dá)的培養(yǎng)條件包括：在含有40-60g/L梗絲的培養(yǎng)基中，并控制溫度28-32℃進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)。

本發(fā)明還公開(kāi)了由所述降解煙草梗絲果膠和木聚糖的真菌編碼的酶，所述酶包括果膠酶和木聚糖酶。

本發(fā)明還公開(kāi)了一種制備所述酶的方法，包括按照所述方法培養(yǎng)所述冠突散囊菌的步驟，并將所得發(fā)酵液濾除菌體后，所得濾液即為粗酶液。

本發(fā)明還公開(kāi)了所述的酶用于提高煙草梗絲質(zhì)量的用途。

本發(fā)明還公開(kāi)了所述的降解煙草梗絲果膠和木聚糖的真菌用于提高煙草梗絲質(zhì)量的用途。

本發(fā)明還公開(kāi)了一種提高煙草梗絲質(zhì)量的方法，包括如下步驟：

(1)按照所述方法將所述的冠突散囊菌Eurotium cristatum 502進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，并獲得粗酶液；

(2)取占煙草梗絲重量0.01-0.5wt％的所述粗酶液，稀釋后均勻噴灑到所述煙草梗絲中，控制所述梗絲的含水量達(dá)到30-50％，并于30-40℃溫度下進(jìn)行發(fā)酵，即可。

所述步驟(2)中，所述粗酶液的稀釋步驟為采用無(wú)菌蒸餾水或0.1-0.2mol/L、pH5.0-5.5的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液進(jìn)行稀釋。

本發(fā)明還公開(kāi)了一種卷煙加工方法，包括按照所述方法提高所述煙草梗絲質(zhì)量的步驟。

本發(fā)明所述方案從廣西梧州產(chǎn)的六堡茶中篩選出一株優(yōu)勢(shì)冠突散囊菌菌株，該菌株能分泌木聚糖酶、果膠酶和淀粉酶等多種生物酶，可以降解梗絲中的木聚糖以及果膠等物質(zhì)，使木聚糖等轉(zhuǎn)化為單糖，從而減少梗絲的木質(zhì)氣。

采用本發(fā)明所篩選的優(yōu)勢(shì)菌株來(lái)改善煙草梗絲原料的品質(zhì)，所述工藝過(guò)程簡(jiǎn)單，反應(yīng)條件溫和；經(jīng)過(guò)處理后，梗絲發(fā)酵后果膠的含量減少了8.2-50.3％，梗絲中木聚糖的含量減少了2.2-11.5％，刺激性明顯減少，煙氣變醇和，煙香增加，顯著提高了梗絲的感官質(zhì)量和可用性，進(jìn)一步提高了梗絲的可用性。同時(shí)，該方法具有簡(jiǎn)單實(shí)用，成本低廉等特點(diǎn)，可望在工 業(yè)上推廣應(yīng)用。

具體實(shí)施方式

實(shí)施例1菌株篩選

本發(fā)明所述能夠產(chǎn)果膠酶和木聚糖酶的冠突散囊菌菌株，是從廣西梧州產(chǎn)的六堡茶中分離得到，具體包括如下步驟：

(1)利用富集培養(yǎng)基從六堡茶中分離微生物菌株，將六堡茶粉碎后加入富集培養(yǎng)基培養(yǎng)篩選，所述富集培養(yǎng)基為：1g K₂HPO₄·3H₂O，0.5g MgSO₄·7H₂O，3g NH₄NO₃，32g NaCl，20g蔗糖，水1000mL，pH值6.0；

(2)所得獲得的微生物菌液經(jīng)平涂布法在平板分離培養(yǎng)基進(jìn)行篩選，恒溫培養(yǎng)后，挑選形態(tài)差異較大的菌落分別劃線(xiàn)純化，直至出現(xiàn)單菌落，獲得菌株，保持，備用；所述平板分離培養(yǎng)基為：1g K₂HPO₄·3H₂O，0.5g MgSO₄·7H₂O，3g NH₄NO₃，32g NaCl，20g蔗糖，15g瓊脂粉，水1000mL，pH值6.0；

(3)將劃線(xiàn)得到的菌株用復(fù)篩培養(yǎng)基篩選能夠產(chǎn)生果膠酶和木聚糖酶的菌株，所述復(fù)篩培養(yǎng)基為：50g梗絲，1000mL水，pH值6.0，篩選得到一株性能較優(yōu)的菌株，記為冠突散囊菌Eurotium cristatum 502，已于2016年4月18日保藏在中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，其簡(jiǎn)稱(chēng)為CCTCC，保藏編號(hào)為CCTCC NO：M2016204。保藏地址：湖北省武漢市武昌珞珈山，郵政編碼430072。

將上述得到的冠突散囊菌Eurotium cristatum 502進(jìn)行遺傳穩(wěn)定性考察：將每個(gè)菌株連續(xù)轉(zhuǎn)接10代，每代均接入所述發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)發(fā)酵(50g/L梗絲)，三角瓶用八層紗布包裹，培養(yǎng)條件為發(fā)酵溫度28℃，攪拌轉(zhuǎn)速150rpm，于旋轉(zhuǎn)式搖床恒溫?fù)u瓶發(fā)酵48小時(shí)，菌株顯示了穩(wěn)定的發(fā)酵性能?？梢?jiàn)，該菌株的遺傳性能較佳。

實(shí)施例2菌株的培養(yǎng)

本實(shí)施例所述冠突散囊菌Eurotium cristatum 502菌株的培養(yǎng)步驟為：

(1)種子培養(yǎng)：取1g K₂HPO₄·3H₂O，0.5g MgSO₄·7H₂O，3g NH₄NO₃，32g NaCl，20g蔗糖，15g瓊脂粉，加水1000mL配制培養(yǎng)基，pH值6.0，在無(wú)菌環(huán)境將冷凍保藏的菌種接種到培養(yǎng)基上，在28℃培養(yǎng)7天；

(2)搖瓶培養(yǎng)：取5g梗絲，加蒸餾水100mL配制發(fā)酵培養(yǎng)基，pH值6.0，高壓蒸汽滅菌；搖瓶裝液量為10-30v/v％，搖床轉(zhuǎn)速為150rpm，在無(wú)菌環(huán)境用接種環(huán)從種子培養(yǎng)平板取一環(huán)孢子，接入發(fā)酵培養(yǎng)基中，在28℃培養(yǎng)48h，即可。

實(shí)施例3粗酶液制備

取實(shí)施例2中制得的發(fā)酵液，用8層無(wú)菌紗布過(guò)濾濾除菌株，得到濾液即為粗酶液。所得粗酶液氣味芳香，經(jīng)DNS(3,5-二硝基水楊酸)法檢測(cè)，果膠酶活力達(dá)到460U/mL，木聚糖酶活力達(dá)到328U/mL。

實(shí)施例4

稱(chēng)取15g梗絲，另取實(shí)施例3制備的粗酶液1.5μg，用3.9mL蒸餾水稀釋?zhuān)b入微量噴霧器噴均勻噴灑到梗絲上，使梗絲的含水量達(dá)到30％，然后將梗絲放入30℃培養(yǎng)箱發(fā)酵24h。

發(fā)酵后經(jīng)檢測(cè)，梗絲中果膠的含量減少了6.2％，梗絲中木聚糖的含量減少了3.6％。梗絲的木質(zhì)氣減少，刺激性降低，煙氣變醇和，煙香增加，感官質(zhì)量明顯改善。

實(shí)施例5

稱(chēng)取15g梗絲，另取實(shí)施例3制備的粗酶液7.5μg，用7mL蒸餾水稀釋?zhuān)b入微量噴霧器噴均勻噴灑到梗絲上，使梗絲的含水量達(dá)到40％，然后將梗絲放入30℃培養(yǎng)箱發(fā)酵36h。

發(fā)酵后經(jīng)過(guò)檢測(cè)，梗絲中果膠的含量減少了12.3％，梗絲中木聚糖的含量減少了5.4％。梗絲的木質(zhì)氣減少，刺激性降低，煙氣變醇和，煙香增加，感官質(zhì)量明顯改善。

實(shí)施例6

稱(chēng)取15g梗絲，另取實(shí)施例3制備的粗酶液7.5μg，用0.1mol/L pH5.2的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液7mL稀釋?zhuān)构＝z的含水量達(dá)到40％，裝入微量噴霧器噴均勻噴灑到梗絲上，然后將梗絲放入35℃培養(yǎng)箱發(fā)酵24h。

發(fā)酵后經(jīng)檢測(cè)，梗絲中果膠的含量減少了16.9％，梗絲中木聚糖的含量減少了7.2％。梗絲的木質(zhì)氣減少，刺激性降低，煙氣變醇和，煙香增加，感官質(zhì)量明顯改善。

實(shí)施例7

稱(chēng)取15g梗絲，另取實(shí)施例3制備的粗酶液15μg，用0.2mol/L pH5.2的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液11.4mL稀釋?zhuān)构＝z的含水量達(dá)到50％，裝入微量噴霧器噴均勻噴灑到梗絲上，然后將梗絲放入35℃培養(yǎng)箱發(fā)酵48h。

發(fā)酵后經(jīng)檢測(cè)，梗絲中果膠的含量減少了28.3％，梗絲中木聚糖的含量減少了10.3％。梗絲的木質(zhì)氣減少，刺激性降低，煙氣變醇和，煙香增加，感官質(zhì)量明顯改善。

實(shí)施例8

稱(chēng)取15g梗絲，另取實(shí)施例3制備的粗酶液4.5μg，用0.1mol/L pH5.2的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液11.4mL稀釋?zhuān)b入微量噴霧器噴均勻噴灑到梗絲上，使梗絲的含水量達(dá)到50％，然后將梗絲放入40℃培養(yǎng)箱發(fā)酵12h。

發(fā)酵后經(jīng)檢測(cè)，梗絲中果膠的含量減少了10.3％，梗絲中木聚糖的含量減少了3.9％。梗絲的木質(zhì)氣減少，刺激性降低，煙氣變醇和，煙香增加，感官質(zhì)量明顯改善。

實(shí)施例9

稱(chēng)取15g梗絲，另取實(shí)施例3制備的粗酶液75μg，用0.2mol/L pH5.2的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液11.4mL稀釋?zhuān)b入微量噴霧器噴均勻噴灑到梗絲上，使梗絲的含水量達(dá)到50％，然后將梗絲放入35℃培養(yǎng)箱發(fā)酵48h。

發(fā)酵后經(jīng)檢測(cè)，梗絲中果膠的含量減少了38.5％，梗絲中木聚糖的含量減少了12.8％。梗絲的木質(zhì)氣減少，刺激性降低，煙氣變醇和，煙香增加，感官質(zhì)量明顯改善。

顯然，上述實(shí)施例僅僅是為清楚地說(shuō)明所作的舉例，而并非對(duì)實(shí)施方式的限定。對(duì)于所屬領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來(lái)說(shuō)，在上述說(shuō)明的基礎(chǔ)上還可以做出其它不同形式的變化或變動(dòng)。這里無(wú)需也無(wú)法對(duì)所有的實(shí)施方式予以窮舉。而由此所引伸出的顯而易見(jiàn)的變化或變動(dòng)仍處于本發(fā)明創(chuàng)造的保護(hù)范圍之中。