本發(fā)明屬于生物工程技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一株高產(chǎn)過氧化氫酶的黑曲霉菌株及利用其生產(chǎn)過氧化氫的方法。

背景技術(shù)：
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過氧化氫酶幾乎存在于所有好氧生物的體內(nèi)，能夠催化過氧化氫分解為水和氧氣的反應(yīng)，具有清除自由基、保護(hù)細(xì)胞免受氧氣損害等保護(hù)生物機(jī)體的功能。過氧化氫是一種強(qiáng)氧化劑，廣泛應(yīng)用于紡織、食品和醫(yī)療領(lǐng)域的漂白和消毒，但是其殘留物對(duì)生產(chǎn)工藝和身體健康有很大影響。利用過氧化氫酶特異性的去除過氧化氫是一種高效環(huán)保的方法。

目前過氧化氫酶的生產(chǎn)主要是通過微生物發(fā)酵的方法獲得，因在紡織、食品和醫(yī)療領(lǐng)域的廣泛應(yīng)用，就要求過氧化氫酶不但具有耐酸耐堿和耐熱等的性能，還要發(fā)酵酶活水平高，成本低。目前，一些文獻(xiàn)及專利報(bào)道的過氧化氫酶產(chǎn)酶菌株，發(fā)酵酶活水平低，只注重在紡織工業(yè)中強(qiáng)堿高溫環(huán)境中的應(yīng)用，未考慮其它行業(yè)中的使用環(huán)境，且多數(shù)的產(chǎn)酶菌株為桿菌類。

如中國(guó)專利CN103555620A公布了一株節(jié)桿菌用于堿性過氧化氫酶的生產(chǎn)，搖瓶液體深層發(fā)酵的過氧化氫酶活水平能達(dá)到49706U/mL；中國(guó)專利CN105483061A公布了一株解脲芽孢桿菌，其搖瓶發(fā)酵的酶活水平能達(dá)到41426U/mL。

盡管這些研究也已經(jīng)達(dá)到了較高的水平，但沒有提出一個(gè)有效的工業(yè)生產(chǎn)方法，對(duì)于用黑曲霉進(jìn)行工業(yè)化發(fā)酵生產(chǎn)過氧化氫酶的方法未見報(bào)道。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
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為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明提供一株高產(chǎn)過氧化氫酶的黑曲霉菌株及其工業(yè)發(fā)酵方法。

本發(fā)明提供的技術(shù)方案之一，是一株高產(chǎn)過氧化氫酶的黑曲霉菌株，所述菌株是從含有紡織廠及食品廠的工業(yè)園區(qū)的土壤中分離獲得的黑曲霉LDG1，經(jīng)鑒定其屬于黑曲霉(Aspergillus niger)，該菌株已于2016年10月26日保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，地址：北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)，中國(guó)科學(xué)院微生物研究所，郵編100101，保藏編號(hào)為CGMCC No.13167。

本發(fā)明所提供的技術(shù)方案之二，是所述黑曲霉菌株CGMCC No.13167酵發(fā)過氧化氫酶的方法，主要包括如下步驟：

a.種子罐培養(yǎng)：將菌種接至種子培養(yǎng)基中，33℃，180-300rpm，發(fā)酵50h；

b.發(fā)酵罐培養(yǎng)：在無菌條件下，按照7％的接種量，將種子液壓入發(fā)酵罐，進(jìn)行發(fā)酵罐培養(yǎng)，33℃，300-800rpm，發(fā)酵至40h-110h，通過補(bǔ)料控制DE值在55-60之間；當(dāng)發(fā)酵至110h-170h時(shí)，通過補(bǔ)料將DE值控制在35-40之間；當(dāng)發(fā)酵至170h-185h菌體自溶嚴(yán)重，酶活無明顯提高時(shí)停止補(bǔ)料；當(dāng)發(fā)酵至185h-195hDE值降低至20時(shí)放罐；

c.提取與精制：發(fā)酵液中加入200ppm聚丙烯酰胺和2.5％珍珠巖進(jìn)行絮凝和板框壓濾，然后進(jìn)行超濾濃縮6-8倍，最后加入防腐劑(添加與超濾濃縮液質(zhì)量體積比為0.1％-0.3％的亞硝酸鈉、0.6％-0.8％的苯甲酸鈉和0.3％-0.4％的山梨酸鉀)和保護(hù)劑(添加與超濾濃縮液質(zhì)量體積比為7％-9％葡萄糖和10％-15％甘油)配兌并用硅藻土過濾除菌，得到過氧化氫酶成品酶制劑；

培養(yǎng)基質(zhì)量體積百分百組成如下：

種子培養(yǎng)基：蔗糖4％-4.8％，葡萄糖1％-2％，硫酸鎂0.1％-0.2％，氯化鉀0.05％-0.08％，硝酸鈉0.3％-0.4％，磷酸二氫鉀0.2％-0.4％，其余為水，pH 7.0；

發(fā)酵培養(yǎng)基：玉米淀粉9％-11％，玉米粉5％-8％，豆餅粉2.5％-3％，氯化鈣0.03-0.04％，硫酸銨1％-1.5％，磷酸二氫鉀0.5％-0.8％，磷酸二氫鈉0.4％-0.7％，檸檬酸鈉0.2％-0.4％，玉米漿1％-3％，其余為水，pH 7.0；

補(bǔ)料培養(yǎng)基：玉米淀粉25％，玉米漿2.3％，硫酸銨0.5％，磷酸二氫鉀0.2％-0.5％，pH 7.0。

利用上述黑曲霉菌株CGMCC No.13167及方法進(jìn)行發(fā)酵，所產(chǎn)過氧化氫酶的發(fā)酵酶活水平可達(dá)到152000U/mL以上；

所產(chǎn)過氧化氫酶的酶學(xué)特性如下：

1、最適反應(yīng)溫度：55℃；

2、最適反應(yīng)pH：9.0；

3、熱穩(wěn)定性：在80℃條件下保溫1h仍能保持90％以上的活性；

4、pH穩(wěn)定性：在pH7.0-12的條件下24h后，相對(duì)酶活力仍然保持在85％以上。

有益效果：

1、本發(fā)明首先提供了一株高產(chǎn)過氧化氫酶的黑曲霉菌株，利用該菌株進(jìn)行工業(yè)化發(fā)酵生產(chǎn)的發(fā)酵酶活水平可達(dá)到152000U/mL以上，大大降低了生產(chǎn)成本，有利于過氧化氫酶的大規(guī)模應(yīng)用，節(jié)能減排。

2、本菌株所產(chǎn)的過氧化氫酶最適反應(yīng)溫度為55℃，在80℃條件下保溫1h仍能保持90％以上的活性；最適反應(yīng)pH為9.0，在pH7.0-12的條件下24h后，相對(duì)酶活力仍然保持在85％以上；以上這些耐堿耐高溫的特性，使應(yīng)用該菌株及配套工藝制備的過氧化氫酶可以廣泛的適用于食品和紡織等工業(yè)，因此本發(fā)明提供的菌株及工藝具有廣泛的應(yīng)用前景和顯著的經(jīng)濟(jì)效益。

附圖說明：

圖1不同溫度下過氧化氫酶酶活力曲線；

圖2過氧化氫酶耐熱性曲線；

圖3不同pH下過氧化氫酶酶活力曲線；

圖4過氧化氫酶耐酸堿性曲線。

具體實(shí)施方式：

以下通過具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做更詳細(xì)的說明，具體實(shí)施案例僅為舉例說明，不作為對(duì)本發(fā)明實(shí)施范圍的限定。

實(shí)施例1過氧化氫酶酶活測(cè)定方法

一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)酶活單位(1U)定義為：在37℃條件下，1min分解1umolH₂O₂(消光系數(shù)為39.4L/mol/cm)所需的酶量。

H₂O₂的分解速率用紫外可見光分光光度計(jì)S53在240nm，30℃條件下進(jìn)行測(cè)定。反應(yīng)總體積為3mL,含0.1mL酶液和2.9mL含有120mmol/L H₂O₂和50mmol/L的磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀緩沖液(pH7.0)。

實(shí)施例2產(chǎn)酶菌株的篩選

從含有紡織廠和食品廠的工業(yè)園區(qū)土壤中篩選并經(jīng)平板培養(yǎng)，滴加H₂O₂產(chǎn)氣泡情況再篩選，并比較過氧化氫活性大小而得到。

土壤經(jīng)過兩次察氏液體培養(yǎng)基增值培養(yǎng)，涂布察氏培養(yǎng)基平板，培養(yǎng)后滴加0.2mL 8％過氧化氫于大小均一的菌落上，選擇產(chǎn)氣泡迅速且持續(xù)時(shí)間久的菌落進(jìn)行試管發(fā)酵培養(yǎng)，通過比較分解過氧化氫的能力大小，最終篩選得到菌株CGMCC No.13167。經(jīng)鑒定該菌株屬于黑曲霉(Aspergillus niger)。

實(shí)施例3液體發(fā)酵生產(chǎn)過氧化氫酶及其提取

(1)種子罐培養(yǎng)：將菌種接至種子培養(yǎng)基中，33℃，180rpm，發(fā)酵50h；

(2)發(fā)酵罐培養(yǎng)：在無菌條件下，按照7％的接種量，將種子液壓入發(fā)酵罐，進(jìn)行發(fā)酵罐培養(yǎng)，33℃，300rpm，發(fā)酵至40h-110h，通過補(bǔ)料控制DE值在55-60之間；當(dāng)發(fā)酵至110h-170h時(shí)，通過補(bǔ)料將DE值控制在35-40之間；當(dāng)發(fā)酵至170h菌體自溶嚴(yán)重，酶活無明顯提高時(shí)停止補(bǔ)料；當(dāng)發(fā)酵至185h DE值降低至20時(shí)放罐；

(3)提取與精制：發(fā)酵液中加入200ppm聚丙烯酰胺和2.5％珍珠巖進(jìn)行絮凝和板框壓濾，然后進(jìn)行超濾濃縮6倍，最后加入防腐劑(添加與超濾濃縮液質(zhì)量體積比為0.1％亞硝酸鈉、0.6％苯甲酸鈉和0.3％山梨酸鉀)和保護(hù)劑(添加與超濾濃縮液質(zhì)量體積比為7％葡萄糖和10％甘油)配兌并用硅藻土過濾除菌，得到過氧化氫酶成品酶制劑；

(4)培養(yǎng)基質(zhì)量體積百分百組成如下：

種子培養(yǎng)基：蔗糖4％，葡萄糖1％，硫酸鎂0.1％，氯化鉀0.05％，硝酸鈉0.3％，磷酸二氫鉀0.2％，pH 7.0；

發(fā)酵培養(yǎng)基：玉米淀粉9％，玉米粉5％，豆餅粉2.5％，氯化鈣0.03％，硫酸銨1％，磷酸二氫鉀0.5％，磷酸二氫鈉0.4％，檸檬酸鈉0.2％，玉米漿1％，pH 7.0；

補(bǔ)料培養(yǎng)基：玉米淀粉25％，玉米漿2.3％，硫酸銨0.5％，磷酸二氫鉀0.2％，pH 7.0；

應(yīng)用上述方法，發(fā)酵周期為185小時(shí)時(shí)，過氧化氫酶發(fā)酵液酶活力為：152884U/mL。

實(shí)施例4液體發(fā)酵生產(chǎn)過氧化氫酶及其提取

(1)種子罐培養(yǎng)：將菌種接至種子培養(yǎng)基中，33℃，300rpm，發(fā)酵50h；

(2)發(fā)酵罐培養(yǎng)：在無菌條件下，按照7％的接種量，將種子酵液壓入發(fā)酵罐，進(jìn)行發(fā)酵罐培養(yǎng)，33℃，800rpm，發(fā)酵至40h-110h，通過補(bǔ)料控制DE值在55-60之間；當(dāng)發(fā)酵至110h-170h時(shí)，通過補(bǔ)料將DE值控制在35-40之間；當(dāng)發(fā)酵至185h菌體自溶嚴(yán)重，酶活無明顯提高時(shí)停止補(bǔ)料；當(dāng)發(fā)酵至195h DE值降低至20時(shí)放罐；

(3)提取與精制：發(fā)酵液中加入200ppm聚丙烯酰胺和2.5％珍珠巖進(jìn)行絮凝和板框壓濾，然后進(jìn)行超濾濃縮8倍，最后加入防腐劑(添加與超濾濃縮液質(zhì)量體積比為0.3％亞硝酸鈉、0.8％苯甲酸鈉和0.4％山梨酸鉀)和保護(hù)劑(添加與超濾濃縮液質(zhì)量體積比為9％葡萄糖和15％甘油)配兌并用硅藻土過濾除菌，得到過氧化氫酶成品酶制劑；

(4)培養(yǎng)基質(zhì)量體積百分百組成如下：

種子培養(yǎng)基：蔗糖8％，葡萄糖2％，硫酸鎂0.2％，氯化鉀0.08％，硝酸鈉0.4％，磷酸二氫鉀0.4％，pH 7.0；

發(fā)酵培養(yǎng)基：玉米淀粉11％，玉米粉8％，豆餅粉3％，氯化鈣0.04％，硫酸銨1.5％，磷酸二氫鉀0.8％，磷酸二氫鈉0.7％，檸檬酸鈉0.4％，玉米漿3％，pH 7.0；

補(bǔ)料培養(yǎng)基：玉米淀粉25％，玉米漿2.3％，硫酸銨0.5％，磷酸二氫鉀0.5％，pH 7.0。

應(yīng)用上述方法，發(fā)酵周期為195小時(shí)時(shí)，過氧化氫酶發(fā)酵液酶活力為：152965U/mL。

實(shí)施例5液體發(fā)酵生產(chǎn)過氧化氫酶及其提取

(1)種子罐培養(yǎng)：將菌種接至種子培養(yǎng)基中，33℃，240rpm，發(fā)酵50h；

(2)發(fā)酵罐培養(yǎng)：在無菌條件下，按照7％的接種量，將種子液壓入發(fā)酵罐，進(jìn)行發(fā)酵罐培養(yǎng)，33℃，500rpm，發(fā)酵至40h-110h，通過補(bǔ)料控制DE值在55-60之間；當(dāng)發(fā)酵至110h-170h時(shí)，通過補(bǔ)料將DE值控制在35-40之間；當(dāng)發(fā)酵至180h菌體自溶嚴(yán)重，酶活無明顯提高時(shí)停止補(bǔ)料；當(dāng)發(fā)酵至190h DE值降低至20時(shí)放罐；

(3)提取與精制：發(fā)酵液中加入200ppm聚丙烯酰胺和2.5％珍珠巖進(jìn)行絮凝和板框壓濾，然后進(jìn)行超濾濃縮7倍，最后加入防腐劑(添加與超濾濃縮液質(zhì)量體積比為0.2％亞硝酸鈉、0.7％苯甲酸鈉和0.35％山梨酸鉀)和保護(hù)劑(添加與超濾濃縮液質(zhì)量體積比為8％葡萄糖和13％甘油)配兌并用硅藻土過濾除菌，得到過氧化氫酶成品酶制劑；

(4)培養(yǎng)基質(zhì)量體積百分百組成如下：

種子培養(yǎng)基：蔗糖4.5％，葡萄糖1.5％，硫酸鎂0.15％，氯化鉀0.06％，硝酸鈉0.35％，磷酸二氫鉀0.3％，pH 7.0；

發(fā)酵培養(yǎng)基：玉米淀粉10％，玉米粉6％，豆餅粉3％，氯化鈣0.04％，硫酸銨1.5％，磷酸二氫鉀0.6％，磷酸二氫鈉0.5％，檸檬酸鈉0.3％，玉米漿2％，pH 7.0；

補(bǔ)料培養(yǎng)基：玉米淀粉25％，玉米漿2.3％，硫酸銨0.5％，磷酸二氫鉀0.4％，pH 7.0；

應(yīng)用上述方法，發(fā)酵周期為190小時(shí)時(shí)，過氧化氫酶發(fā)酵液酶活力為：153780U/mL。

實(shí)施例6最適反應(yīng)溫度

取實(shí)例5得到的過氧化氫酶成品酶制劑，以正常條件pH7.0，溫度55℃測(cè)定的酶活力為100％，pH7.0，不同溫度下測(cè)定酶活力，計(jì)算相對(duì)酶活力。結(jié)果如圖1所示，最適反應(yīng)溫度為55℃。

實(shí)施例7耐熱性

取實(shí)例5得到的過氧化氫酶成品酶制劑，以55℃，pH7.0條件下保溫1h條件下測(cè)定的酶活力為100％，計(jì)算相對(duì)酶活力。將盛有9mL pH7.0緩沖液的試管分別置于30℃、35℃、40℃、45℃、50℃、55℃、60℃、65℃、70℃、75℃、80℃、85℃、90℃的水浴鍋中預(yù)熱10min,分別加入1mL過氧化氫酶，迅速搖勻并準(zhǔn)確計(jì)時(shí)1h,迅速取出于冰水浴中冷卻，冷卻后用pH7.0緩沖液繼續(xù)稀釋至相應(yīng)倍數(shù)，測(cè)定酶活力。測(cè)定結(jié)果如圖2所示，在80℃條件下保溫1h仍能保持90％以上的活性。

實(shí)施例8最適反應(yīng)pH

取實(shí)例5得到的過氧化氫酶成品酶制劑，在55℃，不同pH值3、3.5、4、4.5、5、5.5、6、6.5、7、7.5、8、8.5、9、9.5、10、10.5、11條件下，測(cè)定同一液態(tài)酶制劑樣品的酶活力。選取在55℃，pH9.0條件下測(cè)定的酶活為100％，計(jì)算相對(duì)酶活。結(jié)果如圖3所示，最適pH為9.0。

實(shí)施例9耐酸堿性

取實(shí)例5得到的過氧化氫酶成品酶制劑，以pH9.0，55℃條件下測(cè)定的酶活力為100％，計(jì)算相對(duì)酶活力。分別取9ml不同pH的緩沖液(分別配制0.2mol/L的磷酸氫二鈉和磷酸二氫鈉，取相應(yīng)的體積調(diào)節(jié)至所需pH)于21支試管中，加入1ml過氧化氫酶搖勻，室溫下放置24h后，搖勻繼續(xù)用pH7.0緩沖液稀釋至相應(yīng)倍數(shù)，測(cè)定酶活力。測(cè)定結(jié)果如圖4所示，在pH7.0-12的條件下24h后，相對(duì)酶活力仍然保持在85％以上。