本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，特別是涉及一種可用作酶活保護(hù)劑的蛋白(Dehydrin-S)。

背景技術(shù)：

狗牙根(Cynodon dactylon)是非常重要的暖季型草坪草，為禾本科多年生草本植物，具有發(fā)達(dá)的根莖和匍匐莖，生長(zhǎng)速度快、再生能力強(qiáng)、成坪快、耐熱、耐踐踏、質(zhì)地纖細(xì)、色澤好等優(yōu)點(diǎn)，在國(guó)內(nèi)外廣泛用于運(yùn)動(dòng)場(chǎng)、游憩場(chǎng)、公園及固土護(hù)坡草坪等。因此是暖季型草坪草中坪用價(jià)值最高、應(yīng)用最廣的草種之一，享有暖季型草坪草“當(dāng)家草種”之稱，極具社會(huì)、經(jīng)濟(jì)和生態(tài)價(jià)值。狗牙根的抗旱能力十分強(qiáng)，年蒸散量低于400mm，僅是玉米、小麥等農(nóng)作物年需水量的四分之一左右，有些抗旱的狗牙根品種(如‘Tifway’)在年降雨量250mm以下仍能良好生長(zhǎng)，因此是建植節(jié)水草坪的優(yōu)良材料。

脫水素(dehydrin)屬于LEA-Ⅱ家族，是植物體內(nèi)的一種具有高度熱穩(wěn)定性、親水性的LEA蛋白(late embryogensis abundant proteins)，能夠在植物胚胎發(fā)育后期以及逆境下大量表達(dá)，廣泛存在于植物界。它能在植物處于干旱等逆境條件下表達(dá)，其在逆境下表達(dá)的強(qiáng)弱與植物抗逆能力有密切聯(lián)系，在抗性植株中的表達(dá)量要高于對(duì)逆境敏感的植株。由此顯示，它與植物的抗旱有著密切的關(guān)系。

狗牙根‘Tifway’是狗牙根中最為耐旱的品種之一。通過(guò)蛋白免疫印跡和基因表達(dá)分析,確定脫水素與‘Tifway’耐旱密切相關(guān)。但目前，脫水素蛋白的抗旱機(jī)制尚不清楚。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

鑒于以上所述現(xiàn)有技術(shù)的缺點(diǎn)，本發(fā)明的目的在于提供一種可用作酶活保護(hù)劑的蛋白，用于解決現(xiàn)有技術(shù)中的問(wèn)題。

為實(shí)現(xiàn)上述目的及其他相關(guān)目的，本發(fā)明提供一種分離的蛋白，所述蛋白包括：

a)氨基酸序列如SEQ ID No.1所示的多肽；

b)氨基酸序列與SEQ ID No.1具有80％以上同源性、且具有a)限定的多肽的功能的多肽；

具體的，所述b)中的多肽具體指：氨基酸序列如SEQ ID No.1所示的多肽經(jīng)過(guò)取代、缺失或者添加一個(gè)或多個(gè)(具體可以是1-50個(gè)，也可以是1-30個(gè)，也可以是1-20個(gè)，也可以是1-10個(gè)，也可以是1-5個(gè)，也可以是1-3個(gè))氨基酸而得到的，或者在N-末端和/或C-末端添加一個(gè)或多個(gè)(具體可以是1-50個(gè)，也可以是1-30個(gè)，也可以是1-20個(gè)，也可以是1-10個(gè)，也可以是1-5個(gè)，也可以是1-3個(gè))氨基酸而得到的，且具有氨基酸序列如SEQ ID No.1所示的多肽功能的多肽。所述b)中的多肽的氨基酸序列可與SEQ ID NO.1具有80％以上同源性，更具體可具有85％以上同源性，更具體可具有90％以上同源性，更具體可具有93％以上同源性，更具體可具有95％以上同源性，更具體可具有97％以上同源性，進(jìn)一步具體可具有99％以上同源性。

具體的，所述多肽中，一個(gè)或多個(gè)(具體可以是1-10個(gè)，也可以是1-5個(gè)，也可以是1-3個(gè))氨基酸被保守性替換。所述保守性替換通常是指性質(zhì)相似的另一個(gè)氨基酸取代指定的氨基酸，例如，可以被認(rèn)為是保守型替換(性質(zhì)相似)的例子包括但不限于：a)丙氨酸、絲氨酸和蘇氨酸；b)谷氨酸和天冬氨酸；c)天冬酰胺和谷氨酰胺；d)精氨酸和賴氨酸；e)異亮氨酸、亮氨酸、蛋氨酸和；f)苯丙氨酸，酪氨酸和色氨酸。

具體的，所述蛋白為分離的蛋白，更具體為分離的生物活性蛋白。

本發(fā)明提供了具有干旱脅迫保護(hù)功能的蛋白，所述蛋白中包括狗牙根‘Tifway’脫水素Dehydrin-S基因，并在終止子前多加了13個(gè)氨基酸殘基的肽段。所述蛋白是由如SEQ ID No.1所示的氨基酸序列組成，該蛋白具有保護(hù)其他蛋白和酶活的功能。

MEHQGQYGHGTTGRVDEYGNPVAGHGTGTGEMGMGTHGTTGTGGMGMGTHGTGTGAGMGGQFQPTREEHKTGGILHRSGSSSSSSSEDDGMGGRRKKGIKDKIKEKLPGGHKDDQQQMGTGTYGQQGHTGMTGSTGTGTGTYGHETGEKKGIMDKIKERLPGQHKLAAALEHHHHHH(SEQ ID No.1)

本發(fā)明第二方面提供一種分離的DNA分子，編碼所述蛋白。

具體的，所述分離的DNA分子序列如SEQ ID No.2所示。

ATGGAGCACCAGGGACAGTACGGCCACGGCACCACGGGCCGCGTCGACGAGTACGGTAACCCGGTTGCCGGACACGGCACCGGAACAGGAGAAATGGGCATGGGAACCCACGGCACCACCGGTACCGGCGGCATGGGCATGGGAACGCACGGCACCGGTACCGGCGCCGGCATGGGCGGGCAGTTCCAGCCCACCAGGGAGGAGCACAAGACCGGAGGCATCCTGCACCGCTCCGGCAGCTCCAGCTCCAGCTCGTCTGAGGATGATGGCATGGGTGGCCGGAGGAAGAAGGGAATCAAGGACAAGATCAAGGAAAAGCTACCCGGCGGCCACAAGGACGACCAGCAGCAGATGGGTACCGGCACCTACGGTCAGCAAGGACACACCGGCATGACCGGCTCCACCGGAACTGGCACCGGCACCTACGGCCACGAGACCGGCGAGAAGAAGGGCATCATGGACAAGATCAAGGAGAGGCTCCCCGGCCAGCACAAGCTTGCGGCCGCACTCGAGCACCACCACCACCACCACTGA(SEQ ID No.2)

本發(fā)明第三方面提供一種構(gòu)建體，含有所述分離的DNA分子。

具體的，所述構(gòu)建體由所述分離的DNA分子插入到表達(dá)載體的多克隆位點(diǎn)構(gòu)建而成。

優(yōu)選的，所述表達(dá)載體選自pET系統(tǒng)載體、pETBlue TM系列載體、pGEX系列載體、pBAD系列載體、pMAL-2c載體、pQE-9等中的一種或多種的組合。

本發(fā)明第四方面提供一種宿主細(xì)胞，所述細(xì)胞包括所述構(gòu)建體或基因組中整合有外源的所述DNA分子。

具體的，所述宿主細(xì)胞為原核細(xì)胞。

更具體的，所述宿主細(xì)胞為大腸桿菌。

更具體的，所述大腸桿菌為Rosetta系列、BL21系列、Origami系列等菌株。

本發(fā)明第五方面提供所述蛋白的制備方法，包括如下步驟：在適合表達(dá)所述蛋白的條件下，培養(yǎng)所述的宿主細(xì)胞，從而表達(dá)出所述蛋白，純化分離出所述蛋白。

本發(fā)明第六方面提供所述蛋白在酶活性保護(hù)中的用途，或在酶保護(hù)劑制備中的用途。

具體的，所述酶選自乳酸脫氫酶、蘋果酸脫氫酶、乙醇脫氫酶、檸檬酸合成酶、細(xì)胞壁溶解酶、熒光素酶等中的一種或多種的組合。

具體的，所述保護(hù)為耐熱和/或耐寒保護(hù)。

所述耐熱保護(hù)具體指能夠有效保護(hù)蛋白或酶在高于其最適溫度或更高溫度的條件下的活性。

所述耐寒保護(hù)具體指能夠有效保護(hù)蛋白或酶在低于其最適溫度或更低溫度的條件下的活性。

一種酶保護(hù)劑，包括所述分離的蛋白。

如上所述，本發(fā)明所提供的蛋白是一種從狗牙根Tifway中克隆的脫水素蛋白Dehydrin-S基因在原核細(xì)菌中表達(dá)的蛋白。這種通過(guò)基因工程表達(dá)出來(lái)的蛋白可作為保護(hù)其他蛋白和酶的保護(hù)劑使用，所述蛋白能夠有效保護(hù)蛋白和酶的高溫和/或低溫下的活性，具有良好的產(chǎn)業(yè)化前景。

附圖說(shuō)明

圖1為狗牙根Tifway中克隆的Dehydrin-S基因序列和編碼的蛋白氨基酸序列全長(zhǎng)(其中Y、S、K1、K2為Dehydrin-S蛋白的保守序列區(qū))；

圖2為原核表達(dá)載體pET-21a的結(jié)構(gòu)圖；

圖3為改造后的原核表達(dá)載體pET-21aDSPCR鑒定電泳圖；

圖4為重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)大腸桿菌Rosetta(DE3)后，IPTG誘導(dǎo)表達(dá)蛋白的SDS-PEG電泳圖；

圖5為Rosetta(DE3)粗提蛋白經(jīng)鎳柱純化后得到的Dehydrin-S基因蛋白的SDS-PEG電泳圖,以鎳柱純化后得到的Dehydrin-L基因蛋白為對(duì)照；

圖6為Dehydrin-S蛋白保護(hù)乙醇脫氫酶(ADH)經(jīng)高溫處理25min仍具有較高活性；

圖7為不同組分比例的Dehydrin-S蛋白保護(hù)乳酸脫氫酶(LDH)經(jīng)高溫處理，LDH活性的變化；

圖8為Dehydrin-S蛋白保護(hù)乳酸脫氫酶(LDH)經(jīng)低溫處理，LDH活性的變化。

具體實(shí)施方式

以下通過(guò)特定的具體實(shí)例說(shuō)明本發(fā)明的實(shí)施方式，本領(lǐng)域技術(shù)人員可由本說(shuō)明書(shū)所揭露的內(nèi)容輕易地了解本發(fā)明的其他優(yōu)點(diǎn)與功效。本發(fā)明還可以通過(guò)另外不同的具體實(shí)施方式加以實(shí)施或應(yīng)用，本說(shuō)明書(shū)中的各項(xiàng)細(xì)節(jié)也可以基于不同觀點(diǎn)與應(yīng)用，在沒(méi)有背離本發(fā)明的精神下進(jìn)行各種修飾或改變。

在進(jìn)一步描述本發(fā)明具體實(shí)施方式之前，應(yīng)理解，本發(fā)明的保護(hù)范圍不局限于下述特定的具體實(shí)施方案；還應(yīng)當(dāng)理解，本發(fā)明實(shí)施例中使用的術(shù)語(yǔ)是為了描述特定的具體實(shí)施方案，而不是為了限制本發(fā)明的保護(hù)范圍；在本發(fā)明說(shuō)明書(shū)和權(quán)利要求書(shū)中，除非文中另外明確指出，單數(shù)形式“一個(gè)”、“一”和“這個(gè)”包括復(fù)數(shù)形式。

當(dāng)實(shí)施例給出數(shù)值范圍時(shí)，應(yīng)理解，除非本發(fā)明另有說(shuō)明，每個(gè)數(shù)值范圍的兩個(gè)端點(diǎn)以及兩個(gè)端點(diǎn)之間任何一個(gè)數(shù)值均可選用。除非另外定義，本發(fā)明中使用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語(yǔ)與本技術(shù)領(lǐng)域技術(shù)人員通常理解的意義相同。除實(shí)施例中使用的具體方法、設(shè)備、材料外，根據(jù)本技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的掌握及本發(fā)明的記載，還可以使用與本發(fā)明實(shí)施例中所述的方法、設(shè)備、材料相似或等同的現(xiàn)有技術(shù)的任何方法、設(shè)備和材料來(lái)實(shí)現(xiàn)本發(fā)明。

除非另外說(shuō)明，本發(fā)明中所公開(kāi)的實(shí)驗(yàn)方法、檢測(cè)方法、制備方法均采用本技術(shù)領(lǐng)域常規(guī)的分子生物學(xué)、生物化學(xué)、染色質(zhì)結(jié)構(gòu)和分析、分析化學(xué)、細(xì)胞培養(yǎng)、重組DNA技術(shù)及相關(guān)領(lǐng)域的常規(guī)技術(shù)。這些技術(shù)在現(xiàn)有文獻(xiàn)中已有完善說(shuō)明，具體可參見(jiàn)Sambrook等

MOLECULAR CLONING：A LABORATORY MANUAL，Second edition，Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989and Third edition，2001；Ausubel等，CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY，John Wiley&Sons，New York，1987and periodic updates；the series METHODS IN ENZYMOLOGY，Academic Press，San Diego；Wolffe，CHROMATIN STRUCTURE AND FUNCTION，Third edition，Academic Press，San Diego，1998；METHODS IN ENZYMOLOGY，Vol.304，Chromatin(P.M.Wassarman and A.P.Wolffe，eds.)，Academic Press，San Diego，1999；和METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY，Vol.119，Chromatin Protocols(P.B.Becker，ed.)Humana Press，Totowa，1999等。

實(shí)施例1

狗牙根‘Tifway’Dehydrin-S基因的克?。?/p>

1.植物材料的獲得

取狗牙根‘Tifway’葉片組織，用于提取RNA；

2.RNA的抽提

用“RNA prep pure植物總RNA提取試劑盒”抽提總RNA(Trizol：Invitrogen)，用甲醛變性膠電泳鑒定RNA的完整性，然后在分光光度計(jì)(Thermo Scientific NANODROP 1000Spectrophotometer)上測(cè)定RNA的純度及濃度；

3.基因的全長(zhǎng)克隆

用Takara的cDNA第一鏈高效合成試劑盒(Primer ScriptTM 1st cDNA Synthesis Kit)。按說(shuō)明書(shū)方法得到cDNA，-20℃保存?zhèn)溆?。用引物EF-DHN和HR-DHN，以cDNA為模版，PCR擴(kuò)增克隆Dehydrin-S基因，PCR反應(yīng)循環(huán)條件為：94℃變性2min后進(jìn)入循環(huán)反應(yīng)，94℃變性1min，54℃退火1min，72℃延伸1min(循環(huán)30次)，72℃延伸10min。

EF-DHN:5’-CCGGAATTCATGGAGCACCAGGGACAGTAC-3’(SEQ ID No.3)

HR-DHN:5’-CCCAAGCTTGTGCTGGCCGGGGAGCTT-3’(SEQ ID No.4)

實(shí)施例2

表達(dá)載體構(gòu)建：

以質(zhì)粒pET-21a(購(gòu)自優(yōu)寶生物,中國(guó)湖南)為模板，將實(shí)施例1(3)的Dehydrin-S基因序列用HindIII和EcoRI酶切處理后，連接到pET-21a的HindIII和EcoRI酶切位點(diǎn)之間,將Dehydrin-S基因與His Tag連接形成完整的ORF表達(dá)框。獲得的重組質(zhì)粒命名為pET-21aDS。通過(guò)酶切和PCR對(duì)重組質(zhì)粒的正確性進(jìn)行驗(yàn)證，驗(yàn)證結(jié)果表明重組質(zhì)粒構(gòu)建成功(如圖3所示)。

實(shí)施例3

Dehydrin-S蛋白的原核表達(dá)、純化及Western blot鑒定：

1.原核表達(dá)及鑒定

含有Dehydrin-S基因的原核表達(dá)載體pET-21aDS轉(zhuǎn)入大腸桿菌Rosetta(DE3)中，菌液PCR篩選陽(yáng)性克隆。挑取含載體的Rosetta(DE3)陽(yáng)性克隆到5mL(含卡納和氯霉素抗生素)的LB培養(yǎng)液中，37℃，220rpm震蕩過(guò)夜。將培養(yǎng)液按1:100的比例接到10mL的LB中。37℃，220rpm培養(yǎng)OD₆₀₀＝0.4～0.6(約2.5h)。加入IPTG誘導(dǎo)物(終濃度1mM)，26℃，220rpm振蕩培養(yǎng)4-6h。取1mL菌液放入1.5mL的EP管中，12000rpm離心2min，收集菌體。除去上清，加入20ul PBS和20ul 2*蛋白上樣緩沖液充分混勻，將混勻的上樣液100℃加熱5min，裂解釋放蛋白；離心10min，SDS-PEG凝膠電泳鑒定Dehydrin-S蛋白的表達(dá)情況，鑒定結(jié)果如圖4所示，圖中箭頭所指處為Dehydrin-S蛋白表達(dá)條帶。

2.蛋白的純化

用ProteinIso Ni-NTA Resin(購(gòu)自全式金生物，中國(guó)北京)對(duì)His標(biāo)簽的蛋白進(jìn)行分離純化，步驟包括裝柱、平衡、上樣、洗滌、洗脫。平衡：用5-10倍體積的平衡緩沖溶液平衡層析柱，平衡液中加入低濃度咪唑(10-20mM)，提高特異性結(jié)合；上樣：樣品緩沖溶液盡可能與平衡液一致，且經(jīng)0.45um濾膜處理；

洗滌：用5-10倍體積的平衡液洗滌層析柱；洗脫：用不同濃度的咪唑洗脫目的蛋白，收集洗脫液。將上述所得蛋白用超濾離心管去離子，BCA法測(cè)定蛋白濃度，SDS-PAGE檢測(cè)純化后蛋白，結(jié)果如圖5所示，圖中箭頭所指處分別為Dehydrin-L、Dehydrin-S蛋白表達(dá)條帶，其中，Dehydrin-L的表達(dá)方法參照中國(guó)專利申請(qǐng)201610289163.5。-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

實(shí)施例4

Dehydrin-S蛋白對(duì)乙醇脫氫酶(ADH)高溫處理的保護(hù)：

ADH((EC1.1.1.1,來(lái)自釀酒酵母,Sigma-Aldrich,USA)，溶解于10mM磷酸緩沖溶液(pH7.4)中，濃度為10mg/mL，作為母液備用，工作液濃度為0.5mg/mL。實(shí)施例3中純化所得蛋白(DS)、BSA(Sigma-Aldrich，USA)配制成濃度為0.5mg/ml的實(shí)驗(yàn)緩沖液。酶反應(yīng)溶液包含1.25mM乙醇and 2mM NAD⁺(100mM NaH₂PO₄，pH 7.5)。等體積的ADH與DS或BSA混合進(jìn)行溫度處理。

高溫處理實(shí)驗(yàn)，將ADH和蛋白混合液于50℃水浴中25min，冰浴20min后取10ul混合液加入200ul反應(yīng)緩沖溶液中。用酶標(biāo)儀在25℃下測(cè)定6min中340nm的吸光值，檢測(cè)結(jié)果如圖6所示，結(jié)果顯示，Dehydrin-S蛋白保護(hù)乙醇脫氫酶經(jīng)高溫處理25min仍具有較高活性。

實(shí)施例5

Dehydrin-S蛋白對(duì)乳酸脫氫酶(LDH)高溫處理的保護(hù)：

按照實(shí)施例4中的步驟將LDH與蛋白分別以1：1，1：2；1：5的濃度比例混合，其中，LDH的濃度為10μg/mL，混合液置于50℃，25分鐘后取樣，測(cè)定340nm的吸光值，結(jié)果如圖7所示，結(jié)果顯示，Dehydrin-S蛋白保護(hù)乳酸脫氫酶(LDH)經(jīng)高溫處理后，LDH與蛋白以1：2混合，對(duì)LDH活性的保護(hù)最好。

實(shí)施例6

Dehydrin-S蛋白對(duì)乳酸脫氫酶(LDH)低溫處理的保護(hù)：

按照實(shí)施例4中的步驟將LDH與蛋白分別以1：2的比例混合(其中，test protein為BSA和DS，test protein與LDH的濃度比均為2:1；LDH濃度均為10ug/ml)，混合液置于-20℃，分別于0,10,20,30分鐘后取樣，測(cè)定340nm的吸光值，結(jié)果如圖8所示，結(jié)果顯示，Dehydrin-S蛋白保護(hù)乳酸脫氫酶(LDH)經(jīng)低溫處理后，仍具有較高活性。

實(shí)施例7

Dehydrin-S蛋白對(duì)蘋果酸脫氫酶、乙醇脫氫酶、檸檬酸合成酶、細(xì)胞壁溶解酶、熒光素酶高溫處理的保護(hù)：

將蘋果酸脫氫酶、乙醇脫氫酶、檸檬酸合成酶、細(xì)胞壁溶解酶、熒光素酶分別溶解于10mM磷酸緩沖溶液(pH7.4)中，母液濃度均為10mg/mL。實(shí)施例3中純化所得蛋白(DS)、BSA(Sigma-Aldrich，USA)配制成工作液濃度為0.5mg/mL的實(shí)驗(yàn)緩沖液，其中，BSA和DS的濃度與酶的濃度相同。酶實(shí)驗(yàn)緩沖溶液包含2mM NADH、10mM丙酮酸鈉、10mM磷酸緩沖溶液(pH7.4)。

高溫處理實(shí)驗(yàn)，將上述酶和蛋白的溶液等比例混合液于50℃水浴中25min，冰浴20min后取10ul混合液加入200ul反應(yīng)緩沖溶液中。用酶標(biāo)儀在25℃下測(cè)定6min中340nm的吸光值，結(jié)果顯示，Dehydrin-S蛋白保護(hù)的蘋果酸脫氫酶、乙醇脫氫酶、檸檬酸合成酶、細(xì)胞壁溶解酶、熒光素酶經(jīng)高溫處理25min后仍具有較高活性。

實(shí)施例8

Dehydrin-S蛋白對(duì)蘋果酸脫氫酶、乙醇脫氫酶、檸檬酸合成酶、細(xì)胞壁溶解酶、熒光素酶冷凍處理的保護(hù)：

按照實(shí)施例6中的步驟將分別將蘋果酸脫氫酶、乙醇脫氫酶、檸檬酸合成酶、細(xì)胞壁溶解酶、熒光素酶與蛋白混合液置于-20℃，分別于0,30,60,90min取樣，測(cè)定340nm的吸光值，結(jié)果顯示，Dehydrin-S蛋白保護(hù)的蘋果酸脫氫酶、乙醇脫氫酶、檸檬酸合成酶、細(xì)胞壁溶解酶、熒光素酶經(jīng)低溫冷凍處理后仍具有較高活性。

綜上所述，本發(fā)明有效克服了現(xiàn)有技術(shù)中的種種缺點(diǎn)而具高度產(chǎn)業(yè)利用價(jià)值。

上述實(shí)施例僅例示性說(shuō)明本發(fā)明的原理及其功效，而非用于限制本發(fā)明。任何熟悉此技術(shù)的人士皆可在不違背本發(fā)明的精神及范疇下，對(duì)上述實(shí)施例進(jìn)行修飾或改變。因此，舉凡所屬技術(shù)領(lǐng)域中具有通常知識(shí)者在未脫離本發(fā)明所揭示的精神與技術(shù)思想下所完成的一切等效修飾或改變，仍應(yīng)由本發(fā)明的權(quán)利要求所涵蓋。

SEQUENCE LISTING

<110> 上海交通大學(xué)

<120> 一種可用作酶活保護(hù)劑的蛋白

<130> PCN

<160> 4

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 177

<212> PRT

<213> Cynodon dactylon

<400> 1

Met Glu His Gln Gly Gln Tyr Gly His Gly Thr Thr Gly Arg Val Asp

1 5 10 15

Glu Tyr Gly Asn Pro Val Ala Gly His Gly Thr Gly Thr Gly Glu Met

20 25 30

Gly Met Gly Thr His Gly Thr Thr Gly Thr Gly Gly Met Gly Met Gly

35 40 45

Thr His Gly Thr Gly Thr Gly Ala Gly Met Gly Gly Gln Phe Gln Pro

50 55 60

Thr Arg Glu Glu His Lys Thr Gly Gly Ile Leu His Arg Ser Gly Ser

65 70 75 80

Ser Ser Ser Ser Ser Ser Glu Asp Asp Gly Met Gly Gly Arg Arg Lys

85 90 95

Lys Gly Ile Lys Asp Lys Ile Lys Glu Lys Leu Pro Gly Gly His Lys

100 105 110

Asp Asp Gln Gln Gln Met Gly Thr Gly Thr Tyr Gly Gln Gln Gly His

115 120 125

Thr Gly Met Thr Gly Ser Thr Gly Thr Gly Thr Gly Thr Tyr Gly His

130 135 140

Glu Thr Gly Glu Lys Lys Gly Ile Met Asp Lys Ile Lys Glu Arg Leu

145 150 155 160

Pro Gly Gln His Lys Leu Ala Ala Ala Leu Glu His His His His His

165 170 175

His

<210> 2

<211> 534

<212> DNA

<213> Cynodon dactylon

<400> 2

atggagcacc agggacagta cggccacggc accacgggcc gcgtcgacga gtacggtaac 60

ccggttgccg gacacggcac cggaacagga gaaatgggca tgggaaccca cggcaccacc 120

ggtaccggcg gcatgggcat gggaacgcac ggcaccggta ccggcgccgg catgggcggg 180

cagttccagc ccaccaggga ggagcacaag accggaggca tcctgcaccg ctccggcagc 240

tccagctcca gctcgtctga ggatgatggc atgggtggcc ggaggaagaa gggaatcaag 300

gacaagatca aggaaaagct acccggcggc cacaaggacg accagcagca gatgggtacc 360

ggcacctacg gtcagcaagg acacaccggc atgaccggct ccaccggaac tggcaccggc 420

acctacggcc acgagaccgg cgagaagaag ggcatcatgg acaagatcaa ggagaggctc 480

cccggccagc acaagcttgc ggccgcactc gagcaccacc accaccacca ctga 534

<210> 3

<211> 30

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 引物

<400> 3

ccggaattca tggagcacca gggacagtac 30

<210> 4

<211> 27

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 引物

<400> 4

cccaagcttg tgctggccgg ggagctt 27