本發(fā)明涉及分子生物學(xué)領(lǐng)域，具體而言，涉及一種基因敲除載體及其構(gòu)建方法與應(yīng)用，MH7A細胞NLRP1基因敲除方法。

背景技術(shù)：

類風濕關(guān)節(jié)炎(Rheumatoid Arthritis，RA)是一種以關(guān)節(jié)滑膜炎為主要特征的慢性自身免疫性疾病，我國RA發(fā)病率約為0.3％～0.6％，發(fā)病率高，致殘率高，嚴重危害人類健康。

RA病因至今仍不是很明確，但今年來的研究表明其發(fā)病可能與核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域樣受體蛋白1(nucleotide-binding，leucine-rich repeat pyrin domain containing protein 1，NLRP1)相關(guān)。先天性免疫系統(tǒng)通過特定的模式識別受體(pattern-recognition receptor，PRR)識別入侵的微生物以及體內(nèi)的危險信號。PRR主要分為兩類，其中一類即為位于胞質(zhì)內(nèi)的Nod樣受體(NOD-like receptor，NLR)，NLP在凋亡相關(guān)斑點樣蛋白和半胱天冬氨酸酶等蛋白的參與下，可以形成一種蛋白質(zhì)復(fù)合物，稱為炎性體。其中，NLRP1炎性體是NLRP1在識別胞內(nèi)病原相關(guān)分子模式(PAMP)后與凋亡相關(guān)斑點樣蛋白(ASC)以及半胱天冬氨酸酶(Caspase-1、Caspase-5)前體等分子結(jié)合形成的蛋白復(fù)合物，活化后促進IL-1β、IL-18、IL-33等炎癥因子的成熟和釋放，在先天性免疫中發(fā)揮重要作用。

類風濕關(guān)節(jié)炎滑膜成纖維細胞(MH7A)是研究類風濕關(guān)節(jié)炎的常用模式細胞，因此，若能構(gòu)建出一種敲除NLRP1基因的MH7A細胞，將能有效搭建起一個類風濕關(guān)節(jié)炎的研究平臺，大大促進類風濕關(guān)節(jié)炎發(fā)病機制的研究，并可促進對NLRP1炎性體與各種炎性因子相互作用對類風濕關(guān)節(jié)炎及滑膜炎發(fā)病相關(guān)的分子機制的研究。

有鑒于此，特提出本發(fā)明。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種基因敲除載體，所述的基因敲除載體可用于敲除人NLRP1基因。

本發(fā)明還提供了該基因敲除載體的構(gòu)建方法與應(yīng)用；具體的，該應(yīng)用為一種在MH7A細胞NLRP1基因敲除方法。

為了實現(xiàn)本發(fā)明的上述目的，特采用以下技術(shù)方案：

一種基因敲除載體，所述基因敲除載體為將SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2所示核苷酸序列連入可表達CRISPR-Cas9基因編輯系統(tǒng)相關(guān)酶的質(zhì)粒即得。

CRISPR(clustered,regularly interspaced，short palindromic repeats)是一種來自細菌降解入侵的病毒DNA或其他外源DNA的免疫機制。在細菌及古細菌中，CRISPR系統(tǒng)共分成3類，其中Ⅰ類和Ⅲ類需要多種CRISPR相關(guān)蛋白(Cas蛋白)共同發(fā)揮作用，而Ⅱ類系統(tǒng)只需要一種Cas蛋白即可，這為其能夠廣泛應(yīng)用提供了便利條件。

目前，來自Streptococcus pyogenes的CRISPR-Cas9系統(tǒng)應(yīng)用最為廣泛。Cas9蛋白(含有兩個核酸酶結(jié)構(gòu)域，可以分別切割DNA兩條單鏈。Cas9首先與crRNA及tracrRNA結(jié)合成復(fù)合物，然后通過PAM序列結(jié)合并侵入DNA，形成RNA-DNA復(fù)合結(jié)構(gòu)，進而對目的DNA雙鏈進行切割，使DNA雙鏈斷裂。

由于PAM序列結(jié)構(gòu)簡單(5’-NGG-3’)，幾乎可以在所有的基因中找到大量靶點，因此得到廣泛的應(yīng)用。CRISPR-Cas9系統(tǒng)已經(jīng)成功應(yīng)用于植物、細菌、酵母、魚類及哺乳動物細胞，是目前最高效的基因組編輯系統(tǒng)。

在本申請中，SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2所示核苷酸序列即為從NLRP1公共編碼區(qū)中篩選得到的帶有PAM序列靶點序列。這兩個靶點序列特異性好，不易脫靶，敲除效率高。

優(yōu)選的，如上所述的基因敲除載體，所述可表達CRISPR-Cas9基因編輯系統(tǒng)相關(guān)酶的質(zhì)粒為pGK1.1linear vector。

如上所述的基因敲除載體的構(gòu)建方法，包括以下步驟：

1)、選取NLRP1基因五個轉(zhuǎn)錄本的公共編碼區(qū)的第一個外顯子進行CRISPR靶向序列設(shè)計，得到SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2所示核苷酸序列；

2)、根據(jù)SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2所示核苷酸序列設(shè)計正向寡核苷酸序列和反向寡核苷酸序列；

3)、將所述正向寡核苷酸序列和反向寡核苷酸序列進行退火反應(yīng)形成雙鏈寡核苷酸；

4)、將所述雙鏈寡核苷酸連入線性化的可表達CRISPR-Cas9基因編輯系統(tǒng)相關(guān)酶的質(zhì)粒得到基因敲除載體。

正向寡核苷酸序列和反向寡核苷酸序列的設(shè)計方法是根據(jù)所用的可表達CRISPR-Cas9基因編輯系統(tǒng)相關(guān)酶的質(zhì)粒的粘性末端進行設(shè)計的，在本申請的一個實施例中，有針對pGK1.1linear vector設(shè)計正向寡核苷酸序列和反向寡核苷酸序列的具體實施方式。

含有如上所述基因敲除載體的宿主細胞。

由于NLRP1基因較為保守，所以本發(fā)明提供的基因敲除載體適用于幾乎所有哺乳動物表達NLRP1基因的細胞。

一種MH7A細胞NLRP1基因敲除方法，包括以下步驟：

a)、將權(quán)利要求2所述基因敲除載體轉(zhuǎn)化G10Competent Cell，并用含有對應(yīng)所述基因敲除載體抗性的抗生素的培養(yǎng)基進行培養(yǎng)；

b)、利用pGK1.1linear vector的通用引物VSP primer作為上游引物，用SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2設(shè)計出的反向寡核苷酸序列作為下游引物篩選陽性克隆并測序驗證；

c)、提取步驟b)中經(jīng)驗證正確的陽性克隆中的質(zhì)粒并轉(zhuǎn)染MH7A細胞得到細胞池細胞；

d)、轉(zhuǎn)染24h后對所述細胞池細胞進行嘌呤霉素藥殺處理；

e)、轉(zhuǎn)染72h后有限稀釋法稀釋MH7A細胞至96孔板制備單克隆并對其得到的單克隆進行培養(yǎng)；

f)、以所述單克隆的基因組DNA為模板，以SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4所示核苷酸序列為引物進行PCR擴增；

g)、用Cruiser^TM對擴增產(chǎn)物進行酶切初篩陽性克隆并測序驗證。

本發(fā)明所用MH7A細胞購自上海弘順生物科技有限公司，細胞貨號：C0878,來源于日本RICKEN細胞庫。

優(yōu)選的，如上所述的MH7A細胞NLRP1基因敲除方法，在步驟c)中，所述質(zhì)粒的濃度為1μg/μl～3μg/μl，所述MH7A細胞的濃度為2×10⁶～3×10⁶個/mL。

進一步優(yōu)選的，在步驟c)中，所述轉(zhuǎn)染為電轉(zhuǎn)；

所述電轉(zhuǎn)的條件為：所述電轉(zhuǎn)的條件為：電轉(zhuǎn)電壓1000V～1100V、電轉(zhuǎn)時間28ms～32ms、電轉(zhuǎn)1次。

本發(fā)明所用電轉(zhuǎn)杯體積為200μl。

在本發(fā)明的一個實施例中，提供了電轉(zhuǎn)條件摸索的一個具體實施過程。

優(yōu)選的，如上所述的MH7A細胞NLRP1基因敲除方法，在步驟d)中，對所述細胞池細胞進行嘌呤霉素藥殺處理時，所用嘌呤霉素的濃度為0.45μg/mL～0.55μg/mL。

優(yōu)選的，如上所述的MH7A細胞NLRP1基因敲除方法，在步驟g)之后，還包括以下步驟：

對于步驟g)中驗證正確的陽性克隆中兩等位基因突變情況不一樣的陽性克隆重新做TA克隆后送測序，跟野生型比對，確定每個等位基因的突變情況。

通常人細胞是二倍體，如果陽性克隆細胞兩個親本缺失堿基情況不一致的話，單克隆測序峰圖是出現(xiàn)套峰，需要進一步PCR擴增出陽性克隆細胞目的基因片段，然后連接到T載體上，采用通用測序引物測序看看兩個親本堿基缺失分別是什么情況。

優(yōu)選的，如上所述MH7A細胞NLRP1基因敲除方法制備的敲除了NLRP1基因的MH7A細胞。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果為：

本發(fā)明采用CRISPR-Cas9基因敲除系統(tǒng)，以NLRP1為靶基因進行CRISPR靶向序列設(shè)計并制備出了針對NLRP1基因的敲除載體，利用其對MH7A細胞進行轉(zhuǎn)染，能高效地敲除MH7A細胞中的NLRP1基因，從而有效搭建起一個類風濕關(guān)節(jié)炎的研究平臺，大大促進類風濕關(guān)節(jié)炎發(fā)病機制的研究，并可促進對NLRP1炎性體與各種炎性因子相互作用對類風濕關(guān)節(jié)炎及滑膜炎發(fā)病相關(guān)的分子機制的研究。

附圖說明

為了更清楚地說明本發(fā)明具體實施方式或現(xiàn)有技術(shù)中的技術(shù)方案，下面將對具體實施方式或現(xiàn)有技術(shù)描述中所需要使用的附圖作簡單地介紹，顯而易見地，下面描述中的附圖是本發(fā)明的一些實施方式，對于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員來講，在不付出創(chuàng)造性勞動的前提下，還可以根據(jù)這些附圖獲得其他的附圖。

圖1為實施例1中1000V，30ms，1pulse條件電轉(zhuǎn)后24h后在顯微鏡下的照片；圖1A為光鏡下的照片；圖1B為電轉(zhuǎn)后細胞所發(fā)的綠色熒光照片；

圖2為pGK1.1linear vector的質(zhì)粒圖譜；

圖3為實施例2步驟3中用BbsI酶切pGK1.1載體回收后載體片段核酸電泳圖；

圖4為實施例3步驟2中用VSP primer和下游負鏈Oligo引物進行菌落PCR擴增后的電泳圖。

圖5為Guide#1位點的pool測序峰圖；

圖6為Guide#2位點的pool測序峰圖；

圖7為Guide#3位點的pool測序峰圖。

具體實施方式

下面將結(jié)合實施例對本發(fā)明的實施方案進行詳細描述，但是本領(lǐng)域技術(shù)人員將會理解，下列實施例僅用于說明本發(fā)明，而不應(yīng)視為限制本發(fā)明的范圍。實施例中未注明具體條件者，按照常規(guī)條件或制造商建議的條件進行。所用試劑或儀器未注明生產(chǎn)廠商者，均為可以通過市售購買獲得的常規(guī)產(chǎn)品。

實施例1預(yù)實驗操作

1、單克隆生長驗證試驗。

有限稀釋：將MH7A細胞制成細胞懸液細胞計數(shù)后取一定量細胞懸液進行稀釋，使最終96孔板中每孔細胞數(shù)為1個或5個，(每孔100μl)在確定稀釋準確后，將稀釋后于37℃，5％CO₂培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)；7～10天后鏡下觀察發(fā)現(xiàn)可形成單克隆，細胞有增殖趨勢且能形成細胞簇。

2、MH7A細胞電轉(zhuǎn)條件摸索

MH7A細胞制成均勻的單細胞懸液后，取一部分混勻進行血小板臺盼藍染色計數(shù)(活細胞率＞95％方能進行電轉(zhuǎn))，計算出細胞懸液濃度；取1×10⁷個細胞懸于無菌管中，1000rpm離心4min；取細胞沉淀，向其中加入一定量DPBS，混勻后加入pEGFP-N1質(zhì)粒(總量10μg，去內(nèi)毒素處理)，使最終總體系在410μl左右；混勻后用電轉(zhuǎn)槍頭分別加入2個電擊杯中，使管口液面凸起，杯內(nèi)無氣泡形成，蓋上蓋進行標記后，進行電轉(zhuǎn)。電轉(zhuǎn)電壓條件為：1000V、1100V；(30ms，1pulse)；混勻電擊后細胞取等部分細胞分別置于準備好的預(yù)熱6孔板各孔中。24h～48h后鏡下觀察，(可見及熒光視野)拍照，電轉(zhuǎn)24h后細胞狀態(tài)如圖1所示。從圖1可知1000V電轉(zhuǎn)的細胞活率及發(fā)綠色熒光細胞百分率相對更佳。

3、MH7A細胞最小全致死濃度摸索(Puro)

貼壁細胞：細胞懸液計數(shù)后，于24孔板每孔接種50000個細胞(每孔500ul)，待細胞貼壁后向其中加入不同濃度的嘌呤霉素(Puro，母液濃度1mg/ml，藥殺濃度梯度為：0，0.5，1ug/ml)，2～3天后鏡下觀察細胞，選擇細胞全致死的最低濃度作為后續(xù)實驗的藥物篩選濃度。摸索得到的Puro藥物篩選濃度為0.5μg/ml。

實施例2基因敲除載體的構(gòu)建方法

在本實施例中，提供了一種用于敲除NLRP1基因的基因敲除載體的構(gòu)建方法，包括如下步驟：

1、靶位點設(shè)計及合成

1)設(shè)計CRISPR-Cas9敲除靶位點

首先，需要在靶標DNA區(qū)域中設(shè)計一對20bp左右的Oligo DNA，通過以下在線工具設(shè)計：

麻省理工學(xué)院的CRISPR Design：http://crispr.mit.edu/

選取NLRP1基因五個轉(zhuǎn)錄本的公共CDS區(qū)，找出公共CDS區(qū)的第一個外顯子進行靶位點設(shè)計。最好一次只輸入一個外顯子，避免Guide序列跨內(nèi)含子的。

其中，大寫字母的堿基代表的是外顯子，加粗和帶下劃線標記的堿基代表的是選定的靶序列。

靶序列的NCBI打分情況如下：

2、引物添加接頭

引物合成需在靶序列頭部添加額外的堿基，正向引物添加CACC，反向引物添加AAAC，需要特別注意的是靶序列的第一個堿基必須是G，如果你選取的靶序列第一個堿基不是G，可自行在靶序列前加一個G，靶序列引物設(shè)計如下：

Guide#1

NLRP1-1F:TCGCCAATAAAGCGCACTCC

NLRP1-1R:GGAGTGCGCTTTATTGGCGA

Guide#2

NLRP1-2F:CATGGAGGTGGCCTCGTACC

NLRP1-2R:GGTACGAGGCCACCTCCATG

Guide#3

NLRP1-3F:GGCCGCCTGGCCTGTTACT

NLRP1-3R:AGTAACAGGCCAGGCGGCCC

其中，加粗和下劃線的部分為額外加入的序列，是要與BbsI酶切后的載體相互補的部分。

3、敲除載體構(gòu)建

1)Oligo雜交，敲除載體連接反應(yīng)

將合成后的2條單鏈Oligo DNA稀釋成10μM，退火形成dsDNA，再與線性化后的pGK1.1linear vector載體連接，可直接用T4DNA Ligase連接，退火反應(yīng)體系如下：

用BbsI酶切將pGK1.1linear vector載體

pGK1.1linear vector是線性化載體，無需酶切處理，可直接用于T4DNA Ligase連接反應(yīng)，pGK1.1載體已經(jīng)優(yōu)化過，其轉(zhuǎn)染和敲除的效率比一般CRISPR載體更高。pGK1.1linear vector的質(zhì)粒圖譜如圖2所示。構(gòu)建靶位點敲除載體前，用BbsI酶切pGK1.1載體后膠回收載體片段，回收后載體片段核酸電泳圖如圖3所示。

將以上體系瞬時離心后，置于PCR儀中95℃孵育3min，孵育后自然冷卻20min。取1μl的雜交后的dsDNA進行T4DNA連接酶連接反應(yīng)，反應(yīng)體系如下：

將以上體系瞬時離心后，置于PCR儀中16℃孵育30min。

實施例3

在本實施例中，提供了一種MH7A細胞NLRP1基因敲除方法。

1、將實施例2中得到的基因敲除載體轉(zhuǎn)化進G10Competent Cell：

從-80℃冰箱中取1管G10Competent Cell，置冰上融解。

融解后加入10μl連接產(chǎn)物，輕彈混勻，冰上孵育30min。

42℃水浴熱擊60sec，迅速拿出置冰上冷卻2～3min。

向管中加入800μl無抗SOC液體培養(yǎng)基，至搖床(37℃/160rpm)恢復(fù)培養(yǎng)培養(yǎng)45min。

4500rpm離心5min，棄去800μl上清，將沉淀懸在剩余的100μl上清中，均勻涂布于含Kan抗性的的篩選平板上，倒置培養(yǎng)過夜。

2、篩選陽性重組子

轉(zhuǎn)染第二天使用上游引物VSP primer與各自的下游負鏈Oligo引物進行菌落PCR篩選，陽性克隆PCR正確大小應(yīng)為100bp，PCR擴增后的電泳結(jié)果如圖4所示，篩選到的陽性克隆抽質(zhì)粒進一步測序驗證。

測序正確的質(zhì)粒濃縮到1μg/μl濃度以上。

上游引物VSP primer的序列為：GGACTATCATATGCTTACCG。

3、電轉(zhuǎn)染靶細胞

1)、取狀態(tài)良好的對數(shù)生長期MH7A細胞懸液臺盼藍計數(shù)，確定細胞數(shù)及細胞活力(細胞活力>95％).

2)、取5×10⁶細胞于15ml離心管中，離心棄上清(1000rpm/4min)。

3)、將細胞沉淀懸浮于210μl DPBS中，轉(zhuǎn)移至1.5ml EP管中，加入所需量構(gòu)建好的敲除質(zhì)粒5μg～8μg(質(zhì)粒濃度要求1μg/μl～3μg/μl)，輕輕混勻。

4)、將上述細胞質(zhì)粒混合液用專用電轉(zhuǎn)槍頭轉(zhuǎn)移至電擊杯中，確定電擊杯中溶液無氣泡，且液面凸起后，蓋上電擊杯蓋并至于電轉(zhuǎn)儀，設(shè)定好電轉(zhuǎn)條件后進行電轉(zhuǎn)。待顯示峰圖正常后取出細胞液轉(zhuǎn)移至六孔板培養(yǎng)基中(培養(yǎng)基需事先37℃預(yù)熱且無抗生素)；電轉(zhuǎn)后得到pool細胞

所述電轉(zhuǎn)的條件為：1000V、30ms、1pulse。

5、pool細胞測序檢測敲除效率

電轉(zhuǎn)后24h puro藥殺處理；所用puro的濃度為0.5μg/mL。

電轉(zhuǎn)72hr后，pool細胞臺盼藍計數(shù)；

在篩選陽性克隆之前，需對pool細胞(混合克隆)的敲除效率進行體內(nèi)驗證，但其結(jié)果只能作為參考；

一般靶位點附近的序列測序中，陽性樣品應(yīng)在靶點位置及之后的序列中出現(xiàn)套峰，如敲除效率較低時，信號強度往往較低，影響判斷。從pool測序峰圖(圖5、圖6、圖7)的結(jié)果來看，Guide#3靶位點附近幾乎沒有套峰，敲除效率低；因而舍去該位點，只保留Guide#1和Guide#2位點。即最終本申請得到的基因敲除載體為將SEQ ID NO:1(Guide#1序列去除末端的AGG)或SEQ ID NO:2(Guide#2序列去除末端的TGG)所示核苷酸序列連入pGK1.1linear vector得到。

6、單克隆的制備和生長

有限稀釋法稀釋細胞至10塊96孔板中，37℃，CO₂培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)；一周后觀察單克隆生長情況，約兩周后將長起來的單克隆轉(zhuǎn)移至48孔中擴大培養(yǎng)；當細胞長滿48孔1/2時，即可取出一部分(10²～10⁴)，使用Genloci TNA抽提試劑盒(cat.no.GP0155，GP0156)提取細胞基因組。

7、單克隆基因組DNA的提取

1)、取10²～10⁴個細胞于1.5ml EP管中，室溫1500rpm離心5min，小心吸掉培養(yǎng)液。

2)、加入150μl PBS重懸細胞，室溫1500rpm離心5min，小心棄去上清。

3)、重復(fù)步驟2一次。

4)、向離心管中加入適量體積(推薦體積為50μl～200μl)預(yù)先配制的溶液A與溶液B的混合液，槍頭吹打5次，冰上放置10min，使細胞充分裂解。

5)、加入兩倍體積的無水乙醇，顛倒混勻，-20℃條件下沉淀20min以上。

6)、4℃，12000rpm，離心20min，棄上清。

7)、加入400μl～500μl預(yù)冷的75％乙醇洗滌沉淀，4℃，12000rpm，離心10min，小心棄去上清，自然晾干(不超過5min為宜)。

8)、加入適量體積(推薦體積為10μl～30μl)滅菌的雙蒸水溶解沉淀，溶液可直接用于PCR反應(yīng)，或于-20℃保存。

8、PCR擴增目的片段

1)、物設(shè)計引

在敲除靶位點附近設(shè)計高特異性的Primers，擴增產(chǎn)物長度為約340bp。Primers引物序列如下：

PrimerF:SEQ ID NO:3

PrimerR:SEQ ID NO:4

2)、PCR擴增獲得雜交DNA

在滅菌PCR管中配制如下反應(yīng)體系，使用高特異性的Primers，擴增獲得野生型和突變型充分雜交的DNA產(chǎn)物。

3)、PCR反應(yīng)程序如下：

自然冷卻至40℃以下(野生型片段與突變型片段雜交)。

PCR結(jié)束后，取2～3μl進行電泳檢測，要求目的片段明亮并且單一。

9、Cruiser^TM Enzyme酶切篩選陽性克隆

在滅菌PCR管中配制如下反應(yīng)體系：

PCR擴增產(chǎn)物

45℃反應(yīng)20min后立即向上述10μl反應(yīng)體系內(nèi)加入2μl 6×Stop Buffer，隨后進行瓊脂糖電泳檢測或置于-20℃保存。

10、測序篩選陽性克隆

對Crusier酶切初步篩選出來的陽性克隆進行測序驗證，進一步確認陽性克隆。

11、TA克隆

對于陽性克隆中，兩個等位基因突變情況不一樣的陽性克隆，重新做TA克隆后送測序，跟野生型比對，確定每個等位基因的突變情況。

最后應(yīng)說明的是：以上各實施例僅用以說明本發(fā)明的技術(shù)方案，而非對其限制；盡管參照前述各實施例對本發(fā)明進行了詳細的說明，但本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)當理解：其依然可以對前述各實施例所記載的技術(shù)方案進行修改，或者對其中部分或者全部技術(shù)特征進行等同替換；而這些修改或者替換，并不使相應(yīng)技術(shù)方案的本質(zhì)脫離本發(fā)明各實施例技術(shù)方案的范圍。

SEQUENCE LISTING

<110> 重慶西南醫(yī)院

<120> 基因敲除載體，MH7A細胞NLRP1基因敲除方法

<160> 4

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

tcgccaataa agcgcactcc 20

<210> 2

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

catggaggtg gcctcgtacc 19

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

taagagccaa ggcaaaggac 20

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

cagtgacctc agccccatct 20