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基因敲除載體,MH7A細(xì)胞NLRP1基因敲除方法與流程

文檔序號:12412210閱讀:來源:國知局

技術(shù)特征:

1.一種基因敲除載體,其特征在于,所述基因敲除載體為將SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2所示核苷酸序列連入可表達(dá)CRISPR-Cas9基因編輯系統(tǒng)相關(guān)酶的質(zhì)粒即得。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基因敲除載體,其特征在于,所述可表達(dá)CRISPR-Cas9基因編輯系統(tǒng)相關(guān)酶的質(zhì)粒為pGK1.1linear vector。

3.權(quán)利要求1或2所述的基因敲除載體的構(gòu)建方法,其特征在于,包括以下步驟:

1)、選取NLRP1基因五個(gè)轉(zhuǎn)錄本的公共編碼區(qū)的第一個(gè)外顯子進(jìn)行CRISPR靶向序列設(shè)計(jì),得到SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2所示核苷酸序列;

2)、根據(jù)SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2所示核苷酸序列設(shè)計(jì)正向寡核苷酸序列和反向寡核苷酸序列;

3)、將所述正向寡核苷酸序列和反向寡核苷酸序列進(jìn)行退火反應(yīng)形成雙鏈寡核苷酸;

4)、將所述雙鏈寡核苷酸連入線性化的可表達(dá)CRISPR-Cas9基因編輯系統(tǒng)相關(guān)酶的質(zhì)粒得到基因敲除載體。

4.含有權(quán)利要求1或2所述基因敲除載體的宿主細(xì)胞。

5.MH7A細(xì)胞NLRP1基因敲除方法,其特征在于,括以下步驟:

a)、將權(quán)利要求2所述基因敲除載體轉(zhuǎn)化G10Competent Cell,并用含有對應(yīng)所述基因敲除載體抗性的抗生素的培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng);

b)、利用pGK1.1linear vector的通用引物VSP primer作為上游引物,用SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2設(shè)計(jì)出的反向寡核苷酸序列作為下游引物篩選陽性克隆并測序驗(yàn)證;

c)、提取步驟b)中經(jīng)驗(yàn)證正確的陽性克隆中的質(zhì)粒并轉(zhuǎn)染MH7A細(xì)胞得到細(xì)胞池細(xì)胞;

d)、轉(zhuǎn)染24h后對所述細(xì)胞池細(xì)胞進(jìn)行嘌呤霉素藥殺處理;

e)、轉(zhuǎn)染72h后有限稀釋法稀釋MH7A細(xì)胞至96孔板制備單克隆并對其得到的單克隆進(jìn)行培養(yǎng);

f)、以所述單克隆的基因組DNA為模板,以SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4所示核苷酸序列為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增;

g)、用CruiserTM對擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行酶切初篩陽性克隆并測序驗(yàn)證。

6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的MH7A細(xì)胞NLRP1基因敲除方法,其特征在于,在步驟c)中,所述質(zhì)粒的濃度為1μg/μl~3μg/μl,所述MH7A細(xì)胞的濃度為2×106~3×106個(gè)/mL。

7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的MH7A細(xì)胞NLRP1基因敲除方法,其特征在于,在步驟c)中,所述轉(zhuǎn)染為電轉(zhuǎn);

所述電轉(zhuǎn)的條件為:電轉(zhuǎn)電壓1000V~1100V、電轉(zhuǎn)時(shí)間28ms~32ms、電轉(zhuǎn)1次。

8.根據(jù)權(quán)利要求5所述的MH7A細(xì)胞NLRP1基因敲除方法,其特征在于,在步驟d)中,對所述細(xì)胞池細(xì)胞進(jìn)行嘌呤霉素藥殺處理時(shí),所用嘌呤霉素的濃度為0.45μg/mL~0.55μg/mL。

9.根據(jù)權(quán)利要求5~8任一項(xiàng)所述的MH7A細(xì)胞NLRP1基因敲除方法,其特征在于,在步驟g)之后,還包括以下步驟:

對于步驟g)中驗(yàn)證正確的陽性克隆中兩等位基因突變情況不一樣的陽性克隆重新做TA克隆后送測序,跟野生型比對,確定每個(gè)等位基因的突變情況。

10.權(quán)利要求5~9任一項(xiàng)所述MH7A細(xì)胞NLRP1基因敲除方法制備的敲除了NLRP1基因的MH7A細(xì)胞。

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