本發(fā)明屬于動物和人類生殖與發(fā)育生物工程技術(shù)，主要涉及一種小鼠或人類的全能性干細胞quteASCs誘導(dǎo)及培養(yǎng)建系方法。

背景技術(shù)：

動物胚胎干細胞(Embryonic Stem Cells，ES)研究開始于上世紀90年代，首次在小鼠和人類獲得成功，兩組科學(xué)家并因此獲得2009年度諾貝爾獎。動物成體細胞干細胞誘導(dǎo)技術(shù)(induced pluripotent stem cells,iPS)是由Takahashi和Yamanaka在2006年創(chuàng)立，利用Oct4,Sox2,Klf4和c-Myc四個轉(zhuǎn)錄因子重編程小鼠成纖維細胞，使之逆轉(zhuǎn)發(fā)育為全能干細胞?？傮w來說，近幾年各國開展的干細胞相關(guān)研究主要集中在小鼠和人類領(lǐng)域，小鼠模型主要是進行干細胞相關(guān)的生命科學(xué)基礎(chǔ)研究，人類干細胞的醫(yī)學(xué)應(yīng)用目的非常顯著。

隨著動物遺傳調(diào)控機制、基因編輯技術(shù)、生物個體發(fā)育等生命科學(xué)基礎(chǔ)理論研究進展與生物工程技術(shù)的發(fā)展，動物干細胞誘導(dǎo)方法變的多元化和干細胞種類更加細分，但是還沒有獲得一種“全能性干細胞”單獨或者通過嵌合體模式能夠在子宮內(nèi)像正常受精產(chǎn)生的胚胎與胎盤相結(jié)合發(fā)育到動物個體的情況。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是，提供一種小鼠和人類全能性干細胞quteASCs誘導(dǎo)及培養(yǎng)建系方法。

為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采用的技術(shù)方案是：一種小鼠或人類的全能性干細胞quteASCs誘導(dǎo)及培養(yǎng)建系方法，包括以下步驟：

1)小鼠或人類早期胚胎的準備

材料來源是3-8天的小鼠早期胚胎或3-14天的人類早期胚胎；

2)ASCs過渡型干細胞誘導(dǎo)建系

將步驟1)中獲得小鼠胚胎或者人類早期胚胎在KSOM培養(yǎng)液體外培養(yǎng)2天后，通過用臺氏酸去掉胚胎的透明帶，然后把裸露的胚胎在不使用血清替代物和飼養(yǎng)層細胞的條件下，在N2B27基礎(chǔ)培養(yǎng)液中添加堿性纖維母細胞生長因子bFGF、激活素A的AF培養(yǎng)液中進行干細胞誘導(dǎo)建系處理；

500ml ASCs干細胞誘導(dǎo)建系的AF培養(yǎng)液組成：

獲得的干細胞稱為ASCs過渡型干細胞；

3)quteASCs多能性干細胞誘導(dǎo)傳代

把獲得的ASCs過渡型干細胞通過Wnt基因、BMP4基因干細胞信號通路調(diào)控，進一步誘導(dǎo)培養(yǎng)獲得多能性干細胞quteASCs；具體方法為：首先，在不使用血清替代物和飼養(yǎng)層細胞的條件下，在N2B27基礎(chǔ)培養(yǎng)液中添加激活素A、BMP4、CHIR99021和LIF的ABCL培養(yǎng)液進行干細胞誘導(dǎo)，培養(yǎng)10-14天后ASCs細胞中開始出現(xiàn)綠色標記細胞GOF-GFP，把綠色細胞克隆挑出傳代或者繼續(xù)培養(yǎng)形成細胞雜合體通過流式細胞儀把綠色細胞分離純化，在同樣條件下進行干細胞培養(yǎng)增殖傳代2-3天，用細胞消化液消化后采用同樣培養(yǎng)液和方法繼續(xù)傳代20代以上；

500ml quteASCs多能性干細胞誘導(dǎo)的ABCL培養(yǎng)液組成：

所述步驟1)中，3-8天的小鼠早期胚胎來源于體外受精或者從母體子宮回收；3-14天的人類早期胚胎來源于體外受精或者從母體子宮回收。

本發(fā)明的有益效果是：實驗動物、人類的干細胞研究結(jié)果顯示，到目前為止還沒有獲得哺乳動物包括人類在內(nèi)的全能性干細胞，而本發(fā)明通過特定誘導(dǎo)方法成功獲得了小鼠和人類新型干細胞quteASCs，并通過實驗手段驗證了其向動物個體組織及其胎盤發(fā)育的全能性。

附圖說明

圖1是本發(fā)明的第一步誘導(dǎo)建立過度型干細胞ASCs技術(shù)流程。

圖2是本發(fā)明的第二步進一步誘導(dǎo)完成新型多能型干細胞quteASCs建系技術(shù)流程。

圖3顯示了ESCs與quteASCs基因表達差別圖。

圖4通過4N補償技術(shù)(4倍體染色體加倍胚胎)能貢獻小鼠胎兒所有組織和胎兒胎盤組織的發(fā)育圖。

具體實施方式

下面結(jié)合附圖和具體實施方式對本發(fā)明作進一步詳細說明：

如圖1-2所示，本發(fā)明材料來源是3-8天的小鼠早期胚胎(體外受精或者從母體子宮回收)，3-14天的人類早期胚胎(體外受精或者從母體子宮回收)。誘導(dǎo)方法包括兩個關(guān)鍵技術(shù)流程：第一步誘導(dǎo)建立過度型干細胞ASCs流程(關(guān)鍵誘導(dǎo)因子：AF)，第二步進一步誘導(dǎo)完成新型多能型干細胞quteASCs建系技術(shù)流程(關(guān)鍵誘導(dǎo)因子：ABCL)。

1、小鼠和人類早期胚胎的準備

以小鼠為模型的新型多能性干細胞誘導(dǎo)方法是通過公鼠和母鼠自然交配后，從母體小鼠子宮回收受精后3-8天的小鼠胚胎，用于以下的新型多能性干細胞誘導(dǎo)與培養(yǎng)建系。人類早期胚胎的一般通過體外受精3-5天或者人工流產(chǎn)14天以內(nèi)胎兒獲得。

2、ASCs過渡型干細胞誘導(dǎo)建系及培養(yǎng)液組成

通過上述方法回收的受精后3-8天的小鼠早期胚胎或者3-14天的人類早期胚胎在KSOM培養(yǎng)液體外培養(yǎng)2天后，通過用臺氏酸去掉小鼠胚胎的透明帶(zona pelucida)，然后把裸露的胚胎在不使用血清替代物和飼養(yǎng)層細胞的條件下，在N2B27基礎(chǔ)培養(yǎng)液中添加bFGF、Activin A的特定培養(yǎng)液(AF培養(yǎng)液)進行干細胞誘導(dǎo)建系處理。

ASCs干細胞誘導(dǎo)建系培養(yǎng)液(AF培養(yǎng)液)組成(總體積為500ml)：

這個階段獲得的干細胞稱為ASCs(advanced stem cells,具有干細胞自我復(fù)制功能的過渡型干細胞)。形態(tài)特點：與EpiSCs相似，基因表達特點：Oct4(基因水平有表達，雖然有GOF-GFP標記，但是，在ASC階段Oct4驅(qū)動的GOF-GFP顯陰性)、Nanog和Sox2等多能性基因表達水平很低；此外，內(nèi)胚層特異性基因blimp1、Gata4和Gata6的表達水平很高。

3、quteASCs新型多能性干細胞誘導(dǎo)傳代及培養(yǎng)液組成

把獲得的ASCs過渡型干細胞通過Wnt基因、BMP4基因干細胞信號通路調(diào)控，進一步誘導(dǎo)培養(yǎng)獲得新型多能性干細胞quteASCs。具體方法為：首先，在不使用血清替代物和飼養(yǎng)層細胞的條件下，在N2B27基礎(chǔ)培養(yǎng)液中添加Activin A、BMP4、CHIR99021和LIF的特定培養(yǎng)液(ABCL培養(yǎng)液)進行干細胞誘導(dǎo)。在此條件下培養(yǎng)10-14天后ASCs細胞中開始出現(xiàn)綠色標記細胞(GOF-GFP)，把綠色細胞克隆挑出傳代或者繼續(xù)培養(yǎng)形成細胞雜合體通過流式細胞儀把綠色細胞分離純化，在同樣條件下進行干細胞培養(yǎng)增殖傳代(2-3天)，用Accutase(細胞消化液)消化后采用同樣的培養(yǎng)液和方法繼續(xù)傳代20代以上。

quteASCs新型多能性干細胞誘培養(yǎng)液(ABCL培養(yǎng)液)組成(總體積為500ml)：

ASCs細胞培養(yǎng)到ABCL培養(yǎng)液的主要目的是激活Wnt基因(胚胎3個胚層進一步分化的信號調(diào)控通路)和BMP4(胚胎中胚層進一步分化的信號通路)信號通路。新型多能性干細胞quteASCs的形態(tài)特點：類似ESCs；基因表達特點：常規(guī)干細胞特異性基因(Oct4、Nanog和Sox2)與ESCs表達水平基本相同，但是中胚層相關(guān)特異性基因(T和Sox17)表達水平顯著高于ESCs。

4、新型多能性干細胞quteASCs特性及發(fā)育潛能分析

嵌合體形成能力：通過顯微操作方法把10-15個quteASCs干細胞注射到2N(二倍體)小鼠囊胚腔中，與常規(guī)干細胞相同具有與正常胚胎形成嵌合、并且能夠進行生殖嵌合與傳代，但是與常規(guī)干細胞相比能夠明顯貢獻胎盤組織的形成。形成個體的發(fā)育潛能：通過4N補償技術(shù)(4倍體染色體加倍胚胎)，能貢獻小鼠胎兒所有組織并支撐胎兒胎盤組織的發(fā)育，同樣與常規(guī)干細胞相比能夠明顯貢獻胎盤組織的形成。

5、干細胞冷凍保存及冷凍液組成

不論是建系傳代的過渡型ASCs和quteASCs新型全能性干細胞的基礎(chǔ)冷凍液均為百分之九十的血清替代物加百分之十的二甲基亞砜，細胞密度為每毫升5-10萬個細胞，按照這個密度先把干細胞樣品放到-80℃低溫冰箱靜置12小時，然后移入液氮中長期保存。

實施例1:小鼠新型全能性干細胞(quteASCs)誘導(dǎo)及建系結(jié)果

1、小鼠早期胚胎的準備

通過自然交配和手術(shù)方法獲取小鼠胚胎，分別從處理的母體小鼠子宮回收受精后3.5和6.5天的50個早期胚胎(為了合理安排每次實驗時間，一般上午回收早期胚胎，根據(jù)受精時間推算正好是3.5天和6.5天)，用于新型干細胞誘導(dǎo)與培養(yǎng)建系。

2、ASCs過渡型干細胞誘導(dǎo)建系

將把上述方法獲得3.5天的小鼠囊胚在KSOM培養(yǎng)液體外培養(yǎng)2天后，用用臺氏酸去除透明帶后接種到Fibronectin(纖維連接蛋白)(纖維連接蛋白用磷酸鹽緩沖液稀釋成1:60的工作液)處理的24孔板中，用AF培養(yǎng)液進行培養(yǎng)建系。按照上述培養(yǎng)方法，從50個3.5天的小鼠囊胚中可建系獲得ASCs干細胞系25個。這些新型干細胞的形態(tài)與EpiSCs相似，表達干細胞特異性基因Oct4、Nanog和Sox2等基因表達水平很低；而內(nèi)胚層特異性基因blimp1、Gata4和Gata6的表達水平顯著高于ESCs?；厥?.5天的小鼠胚胎后將把胚胎的外胚層(Epiblast)和胚外外胚層(extra-embryonic ectoderm)用細的玻璃針切開分離后把外胚層(Epiblast)的部分培養(yǎng)到Fibronectin處理的24孔板中，用AF培養(yǎng)液進行培養(yǎng)建系。

3、quteASCs新型多能性干細胞誘導(dǎo)方法

把獲得的25個ASCs培養(yǎng)到ABCL培養(yǎng)液(激活Wnt和BMP4信號通路)，在此條件下培養(yǎng)10-14天后ASCs細胞中開始出現(xiàn)綠色標記細胞(GOF-GFP)，然后用機械方法把綠色細胞克隆挑出傳代、或者繼續(xù)培養(yǎng)形成細胞雜合體通過流式細胞儀把綠色細胞分離純化，在同樣條件下進行干細胞培養(yǎng)增殖傳代(2-3天)，用Accutase(細胞消化液)消化后能穩(wěn)定傳代20代以上(12孔板)。用上述方法獲得quteASCs干細胞系6個(雌3個、雄3個)。形態(tài)特點類似ESCs，常規(guī)干細胞特異性基因(Oct4、Nanog和Sox2)與ESCs表達水平基本相同，但是中胚層相關(guān)特異性基因(T和Sox17)表達水平顯著高于ESCs(見圖3，顯示了ESCs與quteASCs基因表達差別)。

4、新型干細胞特性及發(fā)育潛能分析

通過顯微操作方法把quteASCs干細胞注射到2N小鼠囊胚(2倍體正常胚胎)后能形成胚胎嵌合體，并且能夠進行生殖嵌合與傳代(表1、表2)，同時具有通過4N補償技術(shù)(4倍體染色體加倍胚胎)能貢獻小鼠胎兒所有組織和胎兒胎盤組織的發(fā)育(圖4)。

表1、通過顯微操作方法把15個quteASCs干細胞注射到每個2N小鼠囊胚(2倍體正常胚胎)后能形成胚胎嵌合體，并且能夠進行生殖嵌合與傳代。

表2、通過顯微操作方法把1個quteASCs干細胞注射到每個2N小鼠囊胚(2倍體正常胚胎)后能形成胚胎嵌合體，并且能夠進行生殖嵌合與傳代

實施例2:人類新型全能性干細胞(quteASCs)誘導(dǎo)及建系結(jié)果

1、人類早期胚胎的準備

從體外受精獲得3.5天的10個早期胚胎用于新型干細胞誘導(dǎo)與培養(yǎng)建系實驗。

2、ASCs過渡型干細胞誘導(dǎo)建系

將把上述方法獲得3.5天的人類早期胚胎在KSOM培養(yǎng)液體外培養(yǎng)2天后，用用臺氏酸去除透明帶后接種到Fibronectin(纖維連接蛋白)(纖維連接蛋白用磷酸鹽緩沖液稀釋成1:60的工作液)處理的24孔板中，用AF培養(yǎng)液進行培養(yǎng)建系。按照上述培養(yǎng)方法，從10個3.5天的人類早期胚胎建系獲得ASCs干細胞系6個。這些新型干細胞的形態(tài)與EpiSCs相似，表達干細胞特異性基因Oct4、Nanog和Sox2等基因表達水平很低；而內(nèi)胚層特異性基因blimp1、Gata4和Gata6的表達水平顯著高于ESCs。

3、quteASCs新型多能性干細胞誘導(dǎo)方法

把獲得的6個ASCs培養(yǎng)到ABCL培養(yǎng)液(激活Wnt和BMP4信號通路)，在此條件下培養(yǎng)10-14天后把細胞克隆挑出傳代，在同樣條件下進行干細胞培養(yǎng)增殖傳代(2-3天)，用Accutase(細胞消化液)消化后能穩(wěn)定傳代20代以上(12孔板)。用上述方法獲得quteASCs干細胞系2個。形態(tài)特點和基因表達類似。

以上所述的實施例僅用于說明本發(fā)明的技術(shù)思想及特點，其目的在于使本領(lǐng)域內(nèi)的技術(shù)人員能夠理解本發(fā)明的內(nèi)容并據(jù)以實施，不能僅以本實施例來限定本發(fā)明的專利范圍，即凡本發(fā)明所揭示的精神所作的同等變化或修飾，仍落在本發(fā)明的專利范圍內(nèi)。