本發(fā)明涉及一種利用芽孢桿菌HS17發(fā)酵生產(chǎn)膠原蛋白酶的方法，及其在膠原蛋白多肽制備中的應(yīng)用，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

膠原蛋白具有獨特的超螺旋結(jié)構(gòu)（3 條 α肽鏈的右手螺旋），性質(zhì)穩(wěn)定，一般加工溫度及短時間加熱都不能使其分解，不易被人體吸收利用。而將膠原蛋白水解為膠原多肽，具有易吸收、抗?jié)?、抗過敏、降血壓、抗菌、抗氧化、降膽固醇、抗衰老、促進傷口愈合、預(yù)防骨質(zhì)疏松及關(guān)節(jié)炎、促進角膜上皮損傷修復(fù)等多種生理活性，使得膠原多肽成為水產(chǎn)加工副產(chǎn)物高值化利用的研究熱點。

膠原蛋白酶是一種水解天然膠原的蛋白水解酶，能在生理 pH 和溫度條件下特異性地水解天然膠原蛋白的三維螺旋結(jié)構(gòu)，而不損傷其它蛋白質(zhì)和組織。膠原蛋白酶的降解活力、穩(wěn)定性等因素成為高效利用膠原蛋白關(guān)鍵。微生物源膠原蛋白酶是某些微生物在特定環(huán)境下分泌的具有降解膠原能力的蛋白酶類，微生物來源的膠原蛋白酶主要是細菌膠原酶，目前研究最多的微生物膠原蛋白酶來源為溶組織梭狀芽孢桿菌（Clostridium histolyticum），但其為病原菌，伴有毒素產(chǎn)生，并非理想的膠原酶來源。

基于目前水產(chǎn)加工企業(yè)產(chǎn)生大量魚皮下腳料的現(xiàn)狀，本發(fā)明是在獲得一株促進海馬健康養(yǎng)殖的芽孢桿菌（發(fā)明專利CN 104232541 A）的基礎(chǔ)上，該菌株為益生菌，經(jīng)培養(yǎng)特性研究發(fā)現(xiàn)該菌株也高產(chǎn)膠原蛋白酶，確定其產(chǎn)膠原蛋白酶的培養(yǎng)方法，并以此轉(zhuǎn)化底物膠原蛋白生產(chǎn)膠原蛋白多肽，實現(xiàn)魚皮等下腳料的高值化利用。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明針對上述技術(shù)存在的不足，提供一種利用芽孢桿菌HS17發(fā)酵生產(chǎn)高活性膠原蛋白酶的培養(yǎng)方法及其應(yīng)用，以解淀粉芽孢桿菌HS17為出發(fā)菌株，經(jīng)液體發(fā)酵的方法生產(chǎn)膠原蛋白酶，該酶可通過高效水解膠原蛋白來生產(chǎn)膠原蛋白多肽。

本發(fā)明所用的菌株為解淀粉芽孢桿菌HS17，其在添加明膠的培養(yǎng)平板上能產(chǎn)生較大的降解圈（附圖1），具有高產(chǎn)膠原蛋白酶的，其保藏名稱為：HS17，保藏單位：中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏日期：2014年8月20日，保藏號為CGMCC No.9532，分類命名：解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens）。

本發(fā)明是通過如下技術(shù)方案來實現(xiàn)的：

1.菌種活化

取試管斜面保存的菌種轉(zhuǎn)接活化培養(yǎng)基中，于37℃、200 rpm下活化18～24h至菌體混濁，制得活化種子液；所用的活化培養(yǎng)基：種子培養(yǎng)基：5 g/L葡萄糖，4 g/L牛肉膏，1 g/L明膠，3 g/L NaCl，1 g/L K₂HPO₄，0.4 g/L MgSO₄，0.2 g/L MnSO₄，pH7.2。

2．搖瓶培養(yǎng)發(fā)酵生產(chǎn)膠原蛋白酶

采用優(yōu)選發(fā)酵培養(yǎng)基：2～4 g/L明膠, 40～50 g/L果糖, 3～6 g/L酵母浸粉,3～5 g/L ZnSO₄, 3～4 g/L MnSO₄, 2～4 g/L FePO₄.2H₂O, 5～6 g/L (NH₄)₂SO₄, 3～5 g/L Na₂HPO₄, 4～6 g/L K₂HPO₄，初始pH 6～7，每500 mL三角燒瓶中分裝50～100 mL發(fā)酵培養(yǎng)基，115℃滅菌20 min。

按照3～6%（v/v）的接種量接入活化的種子活化液，后入200 rpm的旋轉(zhuǎn)搖床中培養(yǎng)，控制溫度為溫度30～33℃，發(fā)酵36～48 h后培養(yǎng)完畢，測定膠原蛋白酶活力。發(fā)酵液經(jīng)8000r/min離心6 min，去除菌體后收集保留上清液，然后再經(jīng)0.22 um的微孔過濾膜過濾除菌，即作為液體酶使用。

3. 發(fā)酵罐培養(yǎng)發(fā)酵生產(chǎn)膠原蛋白酶

以70%比例裝入發(fā)酵培養(yǎng)組分，經(jīng)118℃蒸汽滅菌20min后，火焰圈保護條件下按照3～6%（v/v）的比例接入活化的菌種，通過調(diào)節(jié)酸堿蠕動泵控制發(fā)酵過程中的pH始終維持在pH 6～7，利用發(fā)酵罐的加熱裝置調(diào)節(jié)培養(yǎng)溫度在30～33℃，溶解氧參數(shù)通過調(diào)節(jié)進罐的無菌空氣量和攪拌轉(zhuǎn)速的大小使其始終維持在6%以上。經(jīng)發(fā)酵30～42 h后發(fā)酵完畢，測定膠原蛋白酶活力。發(fā)酵液經(jīng)8000 r/min離心6 min，去除菌體后收集保留上清液，然后再經(jīng)0.22um的微孔過濾膜過濾除菌，即作為液體酶使用。所用的優(yōu)化培養(yǎng)基：2～4 g/L明膠, 40～50 g/L果糖, 3～6 g/L酵母浸粉,3～5 g/L ZnSO₄, 3～4 g/L MnSO₄, 2～4 g/L FePO₄.2H₂O, 5～6 g/L (NH₄)₂SO₄, 3～5 g/L Na₂HPO₄, 4～6 g/L K₂HPO₄。

4. 膠原蛋白多肽的制備

一定量的鱈魚皮膠原蛋白粉，按照1：5的比例加入磷酸緩沖液（pH 7.2）中，然后加入膠原蛋白酶液（底物與酶量比為2：1），在35℃條件下緩慢振搖反應(yīng)10～20 h后終止反應(yīng)。膠原蛋白水解液經(jīng)90℃加熱滅酶10 min，經(jīng)10000 r/min離心8 min去除蛋白沉淀，在-75℃下冷凍干燥獲得膠原蛋白多肽粉。

所用的膠原蛋白酶活力測定方法：1mg的魚鱗膠原蛋白用0.5 mL磷酸緩沖液溶解（pH7.4），加入0.1ml稀釋酶液，37℃反應(yīng)40min。加0.5 mL三氯乙酸（10%，m/v）終止反應(yīng)，再加入0.9mL乙酸緩沖液（pH5.4）和1mL茚三酮顯色液混勻。100℃下水浴加熱10min，冷卻后用3 mL的60%％乙醇稀釋，在570 nm下比色測定。

所用的酶活力測定的對照組處理：為消除干擾，首先取0.1 mL的稀釋酶液在100℃下水浴煮沸10min將酶進行滅活，其余步驟同酶活力測定。

所用的酶活力計算方法：在37℃條件下以每mL酶液水解膠原蛋白每min生成1ug的甘氨酸的量為一個酶活力單位（U）。

所用的相對酶活力計算方法：每組中的樣品酶活力/每組中的最大樣品酶活力×100%。

本發(fā)明的有益效果在于：

（1）本發(fā)明所用的芽孢桿菌HS17是來自海馬腸道的內(nèi)生解淀粉芽孢桿菌，非致病菌，生產(chǎn)的膠原蛋白酶安全性高。

（2）培養(yǎng)方法切合實際，發(fā)酵條件易操作，產(chǎn)酶量高

采用本發(fā)明的培養(yǎng)方法，發(fā)酵生產(chǎn)的膠原蛋白酶活力值，與初期的培養(yǎng)方法比較，其酶產(chǎn)量提高了20多倍，培養(yǎng)方法的產(chǎn)量突出。

（3）利用該菌株所產(chǎn)膠原蛋白酶對膠原蛋白的水解效率高，用于膠原蛋白多肽的生產(chǎn)將具有廣闊的應(yīng)用前景。

附圖說明

圖1為芽孢桿菌HS17平板培養(yǎng)的明膠降解圈；

圖2為芽孢桿菌HS17在發(fā)酵罐中培養(yǎng)曲線；

圖3為酶解液的薄層層析定性分析，其中標號1為膠原蛋白，標號2為酶解液產(chǎn)物。

具體實施方式

以下結(jié)合具體實施例對本發(fā)明做進一步詳細描述，這些實施例用于理解而不是限制本發(fā)明的保護范圍。

實施例1：發(fā)酵生產(chǎn)膠原蛋白酶的培養(yǎng)基的單因素優(yōu)化

（1）菌種活化：取試管斜面保存的菌種轉(zhuǎn)接活化培養(yǎng)基中，于37℃、200 rpm下活化18～24h至菌體混濁，制得活化種子液；所用的活化培養(yǎng)基：種子培養(yǎng)基：5 g/L葡萄糖，4 g/L牛肉膏，1 g/L明膠，3 g/L NaCl， 1 g/L K₂HPO₄， 0.4 g/L MgSO₄， 0.2 g/L MnSO₄，pH7.2。

（2）發(fā)酵優(yōu)化：活化種子液按照5%（v/v）接種量接入不同的發(fā)酵培養(yǎng)基后，在30℃、200 rpm的搖床中發(fā)酵48 h后測定膠原蛋白酶活力。

碳源對菌株HS17產(chǎn)膠原蛋白酶的影響見表1，可以看出果糖作為碳源發(fā)酵生產(chǎn)膠原蛋白酶的效果最好，其次是葡萄糖和糊精。所用的發(fā)酵培養(yǎng)基（g/L）：碳源20（其種類見表1），蛋白胨8，明膠5，Na₂HPO₄ 2，K₂HPO₄ 3，pH 7.5。

表1 碳源對菌株產(chǎn)膠原蛋白酶的影響

氮源對菌株產(chǎn)膠原蛋白酶的影響見表2，所用的發(fā)酵培養(yǎng)基（g/L）：：果糖20，氮源8（其種類見表2），明膠5，Na₂HPO₄ 2，K₂HPO₄ 3，pH 7.5。在選用的有機氮源中，以酵母浸粉發(fā)酵生產(chǎn)膠原蛋白酶為最佳，其次為胰蛋白胨；無機氮源中，以硫酸銨為氮源時發(fā)酵生產(chǎn)膠原蛋白酶的效果最好，其次為氯化銨。在菌種培養(yǎng)前期快速利用無機氮源使得菌體大量增殖，而菌體濃度達到一定程度后，微生物體內(nèi)的代謝酶系開始形成，能夠緩慢利用有機氮源，并且在此階段能夠大量生產(chǎn)目標產(chǎn)物。依據(jù)氮源對芽孢桿菌HS17產(chǎn)膠原蛋白酶影響的結(jié)果，選取酵母粉和硫酸銨作為優(yōu)選氮源。

表2 氮源對菌株產(chǎn)膠原蛋白酶的影響

金屬鹽對菌株產(chǎn)膠原蛋白酶的影響見表3，所用的發(fā)酵培養(yǎng)基（g/L）：果糖20，酵母粉8，明膠5，Na₂HPO₄ 2，K₂HPO₄ 3，金屬鹽3（其種類見表3），pH 7.5。與空白相比，對膠原蛋白酶的發(fā)酵生產(chǎn)有正影響的為硫酸錳、硫酸鋅和正磷酸鐵。

表3 金屬鹽對菌株產(chǎn)膠原蛋白酶的影響

實施例2：發(fā)酵生產(chǎn)膠原蛋白酶的培養(yǎng)基的多因素優(yōu)化

（1）菌種活化：取試管斜面保存的菌種轉(zhuǎn)接活化培養(yǎng)基中，于37℃、200 rpm下活化18～24h至菌體混濁，制得活化種子液；所用的活化培養(yǎng)基：種子培養(yǎng)基：5 g/L葡萄糖，4 g/L牛肉膏，1 g/L明膠，3 g/L NaCl， 1 g/L K₂HPO₄， 0.4 g/L MgSO₄， 0.2 g/L MnSO₄，pH7.2。

（2）發(fā)酵優(yōu)化：活化種子液按照5%（v/v）接種量接入不同的發(fā)酵培養(yǎng)基后，在30℃、200 rpm的搖床中發(fā)酵48 h后測定膠原蛋白酶活力。根據(jù)對碳源、氮源和金屬離子對芽孢桿菌HS17產(chǎn)膠原蛋白酶的優(yōu)化結(jié)果，選取明膠、果糖、酵母浸粉、ZnSO₄、MnSO₄、FePO₄.2H₂O、(NH₄)₂SO₄、Na₂HPO₄和K₂HPO₄進行9因素2水平的的Plackett–Burman設(shè)計優(yōu)化，其因素和水平見表4，結(jié)果見表5，在第3組時獲得最大膠原蛋白酶活性，為105.81 U/mL。

表4 Plackett–Burman 設(shè)計優(yōu)化的因素水平

表5 Plackett–Burman 設(shè)計優(yōu)化的結(jié)果

采用Design Expert軟件對Plackett–Burman 設(shè)計進行優(yōu)化分析，基于修正后一階方程和回歸分析結(jié)果，確定果糖、MnSO₄和(NH₄)₂SO₄是最顯著因素，這意味著提高果糖、MnSO₄和(NH₄)₂SO₄濃度有利于提高膠原蛋白酶產(chǎn)量。采用Plackett–Burman設(shè)計優(yōu)化后各因素條件，進行爬坡實驗，其結(jié)果見表6。由表6可以看出，在第3組時得到最大膠原蛋白酶活力，為125.42 U/mL，因此以45 g/L果糖、3.5 g/L MnSO₄和3.5 g/L (NH₄)₂SO₄為中心點，進行中心組合設(shè)計和響應(yīng)面分析優(yōu)化。

表6爬坡實驗設(shè)計與結(jié)果

利用 Design-Expert軟件分別對果糖、MnSO₄和(NH₄)₂SO₄這3個因素進行中心組合設(shè)計，因素水平編碼見表7，其中心組合設(shè)計和發(fā)酵產(chǎn)酶結(jié)果見表8。

表7中心組合設(shè)計的水平和編碼

采用Design Expert軟件對所得數(shù)據(jù)進行回歸分析，編碼因子A（果糖）、B（MnSO₄）和C（(NH₄)₂SO₄）的二次多項回歸方程：膠原酶活性（Y，U/mL）= 126.36 + 10.12A -12.88B + 8.09C - 19.36AB + 17.81AC – 1.87BC – 12.18A² – 5.32B² – 8.43C²；該回歸模型的F=137.13，p<0.0001，表明模型顯著，僅有0.01%的優(yōu)化誤差；失擬項F=2.10，p=0.2177>0.05，即方程模型失擬不顯著，說明該方程能較好的描述各發(fā)酵條件與膠原蛋白酶活性的關(guān)系。

根據(jù)所建立的數(shù)學模型進行參數(shù)的響應(yīng)面最優(yōu)化分析，50 g/L果糖、3 g/L MnSO₄和6 g/L (NH₄)₂SO₄時，理論膠原蛋白酶最高活性值為170.58 U/mL。為檢驗方法的可靠性，采用優(yōu)化發(fā)酵培養(yǎng)組分（g/L）：明膠 3, 果糖 50, 酵母浸粉4,ZnSO₄ 4, MnSO₄ 3_, FePO₄.2H₂O 3, (NH₄)₂SO₄ 6, Na₂HPO₄ 4, K₂HPO₄ 5，發(fā)酵生產(chǎn)膠原蛋白酶，在此條件下進行3次平行試驗，實際得到膠原蛋白酶活性平均值為171.85U/mL，實際值與預(yù)測值之間的誤差約為0.74%。 因此采用響應(yīng)面優(yōu)化菌株HS17發(fā)酵生產(chǎn)膠原蛋白酶的條件可靠，具有實用價值。

表8中心組合設(shè)計與結(jié)果

實施例3：發(fā)酵生產(chǎn)膠原蛋白酶的培養(yǎng)條件的單因素優(yōu)化

（1）菌種活化：取試管斜面保存的菌種轉(zhuǎn)接活化培養(yǎng)基中，于37℃、200 rpm下活化18～24h至菌體混濁，制得活化種子液；所用的活化培養(yǎng)基：種子培養(yǎng)基：5 g/L葡萄糖，4 g/L牛肉膏，1 g/L明膠，3 g/L NaCl， 1 g/L K₂HPO₄， 0.4 g/L MgSO₄， 0.2 g/L MnSO₄，pH7.2。

（2）發(fā)酵優(yōu)化：在不同接種量、初始pH、培養(yǎng)溫度和裝液量條件下，發(fā)酵48 h后測定膠原蛋白酶活力。所用發(fā)酵培養(yǎng)基（g/L）: 明膠 3, 果糖 50, 酵母浸粉4,ZnSO₄ 4, MnSO₄3_, FePO₄.2H₂O 3, (NH₄)₂SO₄ 6, Na₂HPO₄ 4, K₂HPO₄ 5。

接種量對芽孢桿菌HS17產(chǎn)膠原蛋白酶的影響見表9，由表9可以看出最適初始pH為4%（v/v）。發(fā)酵初始pH對芽孢桿菌HS17產(chǎn)膠原蛋白酶的影響見表10，在pH 6.5時獲得最大產(chǎn)膠原蛋白酶能力。培養(yǎng)溫度對芽孢桿菌HS17產(chǎn)膠原蛋白酶的影響見表11，最佳產(chǎn)膠原蛋白酶的培養(yǎng)溫度為32℃。裝液量對芽孢桿菌HS17產(chǎn)膠原蛋白酶的影響見表12，最佳裝液量為100 mL/500 mL三角燒瓶。

表9 接種量對菌株HS17產(chǎn)膠原蛋白酶的影響

表10 初始pH對菌株HS17產(chǎn)膠原蛋白酶的影響

表11 培養(yǎng)溫度對菌株HS17產(chǎn)膠原蛋白酶的影響

表12 裝液量對菌株HS17產(chǎn)膠原蛋白酶的影響

實施例4：發(fā)酵生產(chǎn)膠原蛋白酶的培養(yǎng)條件的多因素優(yōu)化

（1）菌種活化：取試管斜面保存的菌種轉(zhuǎn)接活化培養(yǎng)基中，于37℃、200 rpm下活化18～24h至菌體混濁，制得活化種子液；所用的活化培養(yǎng)基：種子培養(yǎng)基：5 g/L葡萄糖，4 g/L牛肉膏，1 g/L明膠，3 g/L NaCl， 1 g/L K₂HPO₄， 0.4 g/L MgSO₄， 0.2 g/L MnSO₄，pH7.2。

（2）發(fā)酵優(yōu)化：根據(jù)單因素優(yōu)化的試驗結(jié)果，接種量、初始pH和培養(yǎng)溫度對芽孢桿菌HS17產(chǎn)膠原蛋白酶有較大的影響。利用 Design-Expert軟件對接種量、初始pH和培養(yǎng)溫度這3個因素進行中心組合設(shè)計，因素水平編碼見表13，其結(jié)果見表14。

表13中心組合設(shè)計的水平和編碼

采用Design Expert軟件對所得數(shù)據(jù)進行回歸分析，編碼因子A（接種量）、B（培養(yǎng)溫度）和C（(初始pH）的二次多項回歸方程：膠原蛋白酶活性（Y，U/mL）= 263.39 + 6.98A - 11.99B - 8.95C – 25.16AB + 10.01AC – 25.03BC – 45.55A² – 7.52B² + 3.29C²；回歸模型的F=185.90，p<0.0001，表明模型顯著，僅有0.01%的優(yōu)化誤差；失擬項F=2.91，p=0.1331>0.05，即方程模型失擬不顯著，說明該方程能較好的描述各發(fā)酵條件與膠原蛋白酶活性的關(guān)系。

根據(jù)所建立的數(shù)學模型進行參數(shù)最優(yōu)化分析，接種量4.46%（v/v）、培養(yǎng)溫度30℃和初始pH為7時，模型模擬的理論膠原蛋白酶最高活性值為268.68 U/mL。為檢驗方法的可靠性，采用得到的最優(yōu)發(fā)酵培養(yǎng)組分和條件，進行發(fā)酵生產(chǎn)膠原蛋白酶，在此條件下進行3次平行試驗，實際得到膠原蛋白酶活性平均值為267.15 U/mL，實際值與預(yù)測值之間的誤差約為0.68%。 因此采用響應(yīng)面優(yōu)化芽孢桿菌HS17發(fā)酵生產(chǎn)膠原蛋白酶的條件可靠，具有實用價值。

表14中心組合設(shè)計與結(jié)果

實施例5：搖瓶發(fā)酵生產(chǎn)膠原蛋白酶

菌種活化：取試管斜面保存的菌種轉(zhuǎn)接活化培養(yǎng)基中，于37℃、200 rpm下活化18～24h至菌體混濁，制得活化種子液；所用的活化培養(yǎng)基：種子培養(yǎng)基：5 g/L葡萄糖，4 g/L牛肉膏，1 g/L明膠，3 g/L NaCl， 1 g/L K₂HPO₄， 0.4 g/L MgSO₄， 0.2 g/L MnSO₄，pH7.2。

發(fā)酵生產(chǎn)：采用得到的最優(yōu)發(fā)酵培養(yǎng)組分和條件: 3 g/L明膠, 50 g/L果糖, 4 g/L酵母浸粉,4 g/L ZnSO₄, 3 g/L MnSO₄, 3 g/L FePO₄.2H₂O, 6 g/L (NH₄)₂SO₄, 4 g/L Na₂HPO₄, 5 g/L K₂HPO₄，裝液量100 mL/500 mL，接種量4.46%（v/v）、培養(yǎng)溫度30℃和初始pH 7，進行發(fā)酵生產(chǎn)膠原蛋白酶，，搖床轉(zhuǎn)速200 rpm，定期取樣測定酶活性，在發(fā)酵42 h時獲得最大酶活力，為284.71 U/mL。

實施例6：發(fā)酵罐發(fā)酵生產(chǎn)膠原蛋白酶

（1）對比例1

菌種活化：取試管斜面保存的菌種轉(zhuǎn)接活化培養(yǎng)基中，于37℃、200 rpm下活化18～24h至菌體混濁，制得活化種子液；所用的活化培養(yǎng)基：種子培養(yǎng)基：5 g/L葡萄糖，4 g/L牛肉膏，1 g/L明膠，3 g/L NaCl， 1 g/L K₂HPO₄， 0.4 g/L MgSO₄， 0.2 g/L MnSO₄，pH7.2。

發(fā)酵生產(chǎn)：采用得到的最優(yōu)發(fā)酵培養(yǎng)組分和條件: 2 g/L明膠, 40 g/L果糖, 3 g/L酵母浸粉,3 g/L ZnSO₄, 3 g/L MnSO₄, 2 g/L FePO₄.2H₂O, 5 g/L (NH₄)₂SO₄, 3 g/L Na₂HPO₄, 4 g/L K₂HPO₄。以70%比例裝入發(fā)酵培養(yǎng)組分，經(jīng)118℃蒸汽滅菌20min后，火焰圈保護條件下按照3%（v/v）的比例接入活化的菌種，通過調(diào)節(jié)酸堿蠕動泵控制發(fā)酵過程中的pH始終維持在pH 6，利用發(fā)酵罐的加熱裝置調(diào)節(jié)培養(yǎng)溫度在30℃，溶解氧參數(shù)通過調(diào)節(jié)進罐的無菌空氣量和攪拌轉(zhuǎn)速的大小使其始終維持在6%以上，定期測定膠原蛋白酶活力，在發(fā)酵36 h時獲得最大膠原蛋白酶活力為365.32 U/mL。。發(fā)酵液經(jīng)8000 r/min離心6 min，去除菌體后收集保留上清液，然后再經(jīng)0.22um的微孔過濾膜過濾除菌，即作為液體酶使用。

（2）對比例2

菌種活化：取試管斜面保存的菌種轉(zhuǎn)接活化培養(yǎng)基中，于37℃、200 rpm下活化18～24h至菌體混濁，制得活化種子液；所用的活化培養(yǎng)基：種子培養(yǎng)基：5 g/L葡萄糖，4 g/L牛肉膏，1 g/L明膠，3 g/L NaCl， 1 g/L K₂HPO₄， 0.4 g/L MgSO₄， 0.2 g/L MnSO₄，pH7.2。

發(fā)酵生產(chǎn)：采用得到的最優(yōu)發(fā)酵培養(yǎng)組分和條件: 4 g/L明膠, 50 g/L果糖, 6 g/L酵母浸粉,5 g/L ZnSO₄, 4 g/L MnSO₄, 4 g/L FePO₄.2H₂O, 6 g/L (NH₄)₂SO₄, 5 g/L Na₂HPO₄, 6 g/L K₂HPO₄。以70%比例裝入發(fā)酵培養(yǎng)組分，經(jīng)118℃蒸汽滅菌20min后，火焰圈保護條件下按照6%（v/v）的比例接入活化的菌種，通過調(diào)節(jié)酸堿蠕動泵控制發(fā)酵過程中的pH始終維持在pH 7，利用發(fā)酵罐的加熱裝置調(diào)節(jié)培養(yǎng)溫度在33℃，溶解氧參數(shù)通過調(diào)節(jié)進罐的無菌空氣量和攪拌轉(zhuǎn)速的大小使其始終維持在6%以上，定期測定膠原蛋白酶活力，在發(fā)酵40 h時獲得最大膠原蛋白酶活力為389.27 U/mL。發(fā)酵液經(jīng)8000 r/min離心6 min，去除菌體后收集保留上清液，然后再經(jīng)0.22um的微孔過濾膜過濾除菌，即作為液體酶使用。

（3）對比例3

菌種活化：取試管斜面保存的菌種轉(zhuǎn)接活化培養(yǎng)基中，于37℃、200 rpm下活化18～24h至菌體混濁，制得活化種子液；所用的活化培養(yǎng)基：種子培養(yǎng)基：5 g/L葡萄糖，4 g/L牛肉膏，1 g/L明膠，3 g/L NaCl， 1 g/L K₂HPO₄， 0.4 g/L MgSO₄， 0.2 g/L MnSO₄，pH7.2。

發(fā)酵生產(chǎn)：采用的發(fā)酵培養(yǎng)組分和條件: 3 g/L明膠, 50 g/L果糖, 4 g/L酵母浸粉,4 g/L ZnSO₄, 3 g/L MnSO₄, 3 g/L FePO₄.2H₂O, 6 g/L (NH₄)₂SO₄, 4 g/L Na₂HPO₄, 5 g/L K₂HPO₄。以70%比例裝入發(fā)酵培養(yǎng)組分，經(jīng)118℃蒸汽滅菌20min后，火焰圈保護條件下按照4.46%（v/v）的比例接入活化的菌種，通過調(diào)節(jié)酸堿蠕動泵控制發(fā)酵過程中的pH始終維持在pH 7，利用發(fā)酵罐的加熱裝置調(diào)節(jié)培養(yǎng)溫度在30℃，溶解氧參數(shù)通過調(diào)節(jié)進罐的無菌空氣量和攪拌轉(zhuǎn)速的大小使其始終維持在6%以上。發(fā)酵液經(jīng)8000 r/min離心6 min，去除菌體后收集保留上清液，然后再經(jīng)0.22um的微孔過濾膜過濾除菌，即作為液體酶使用。發(fā)酵38 h時獲得最大菌體濃度40.56（OD600），發(fā)酵35 h時獲得最大膠原蛋白酶產(chǎn)量為415.39 U/mL（見附圖2）。

實施例7：水解膠原蛋白制備膠原蛋白多肽

稱取10 g鱈魚皮膠原蛋白粉，按照1：5的比例加入磷酸緩沖液（pH 7.2）中，然后加入膠原蛋白酶液（底物與酶量比為2：1），在35℃條件下緩慢振搖反應(yīng)20 h后終止反應(yīng)。膠原蛋白水解液經(jīng)90℃加熱滅酶10min，經(jīng)10000 r/min離心8 min去除蛋白沉淀，在-75℃下冷凍干燥獲得膠原蛋白多肽粉6.12 g。由附圖3可以看出，酶解膠原蛋白后產(chǎn)生6種以上的膠原蛋白多肽，且隨著反應(yīng)時間的延長，膠原多肽的產(chǎn)生量越多，故生產(chǎn)的膠原酶具有較好的膠原蛋白降解效果。

將蛋白水解液經(jīng)10000r/min冷凍離心（5℃）8min，采用茚三酮顯色法測定水解蛋白液中的-NH₂含量，計算水解度后確定膠原蛋白的水解率為68%。所用的水解度計算方法如下：水解度（DH）=h/h_b×100%,式中h為水解后每克膠原蛋白被裂解的肽鍵毫摩爾數(shù)，h_b為每克膠原蛋白原料的肽鍵毫摩爾數(shù)（為8.41）。