本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種用于檢測人類CYP2D6基因多態(tài)性的核酸、試劑盒及方法。

背景技術(shù)：

CYP2D6是CYP酶家族中的重要成員之一，該基因位于22q13.1，含有9個外顯子和8個內(nèi)含子，總長為7kb左右，是一個完整的功能性基因。研究表明，肝臟中CYP2D6只占2-9％，但卻參與20％～30％藥物的代謝，包括抗抑郁藥、抗心律失常藥、抗精神病藥、鎮(zhèn)痛藥等。CYP2D6具有廣泛的基因多態(tài)性，目前已經(jīng)報道的有100多種基因變異，如單一堿基的突變、缺失或插入和大片段的缺失。這些基因變異可引起酶活性和數(shù)量的差異，從而導(dǎo)致藥物代謝個體差異的產(chǎn)生。CYP2D6的代謝表型可分為超快代謝型(UMs)、快代謝型(EMs)、中等代謝型(IMs)、慢代謝型(PMs)。

他莫昔芬也叫枸櫞酸他莫昔芬(tamoxifen)，為一種選擇性雌激素受體調(diào)節(jié)劑(SERM)。這種藥物結(jié)構(gòu)類似雌激素，能模擬雌激素的作用，與雌激素受體結(jié)合形成穩(wěn)定的復(fù)合物，并轉(zhuǎn)運入核內(nèi)，阻止染色體基因開放，從而使癌細胞的生長和發(fā)育受到抑制，是目前治療某些乳腺癌和卵巢癌以及乳腺增生的有效藥物之一。他莫昔芬口服后主要在肝內(nèi)代謝，主要代謝物為N-去甲基三苯氧胺和4-羥基三苯氧胺，與雌激素受體的親和力和抑制癌細胞增值的能力比他莫昔芬高至少100倍。

近年來，為提高他莫昔芬臨床應(yīng)用的安全性和有效性，國內(nèi)外學(xué)者對他莫昔芬藥效的影響因素進行了大量研究，相關(guān)研究結(jié)果表明藥物代謝相關(guān)基因的多態(tài)性是引起個體藥效差異的重要原因之一。他莫西芬作為無活性的前藥，在體內(nèi)主要由CYP2D6催化形成有活性的化學(xué)成分Endoxifen，發(fā)揮藥物療效，因此CYP2D6基因多態(tài)性導(dǎo)致的酶活性改變將直接影響他莫西芬用藥效果。所以CYP2D6基因的分型檢測對于臨床他莫西芬用藥指導(dǎo)有重要意義。

CYP2D6基因多態(tài)性在不同種族人群中的分布頻率具有較大的差異，東方人群中突變頻率較高的是CYP2D6*10和CYP2D6*14基因多態(tài)性。CYP2D6*10在東方人群中分布頻率高達40％～49.5％，CYP2D6*14為東方人特有的等位基因，分布頻率約為1％-2％，這兩種基因型是造成東方人CYP2D6酶慢代謝型和弱代謝型的主要原因。因此，綜合檢測CYP2D6*10和CYP2D6*14基因多態(tài)性可以篩選那些在更能在TAM治療中受益的患者，這對于臨床個體化化療方案的制定具有重要意義。

目前，CYP2D6基因多態(tài)性檢測的主要方法有：測序法、芯片法和溶解曲線法。測序法是基因多態(tài)性檢測最常見的方法，也是基因多態(tài)性位點檢測的金標準，盡管該方法具有高通量、多位點的優(yōu)勢，但該方法同時存在操作繁瑣、靈敏度低、樣品易污染，導(dǎo)致假陽性結(jié)果，及儀器成本高等問題。芯片法需先進行PCR擴增，之后將含有目的SNP位點的PCR產(chǎn)物與突變探針、野生探針雜交，通過比較兩個探針雜交的信號強度判斷樣品基因型。該方法操作過程繁瑣，無法實現(xiàn)批量化和自動化，且結(jié)果不易判讀，假陽性概率高。對于溶解曲線法，不管是染料溶解曲線還是探針溶解曲線法，都無法有效區(qū)分同一位點的多種突變類型。液相芯片法操作過程復(fù)雜，且容易污染，假陽性率高。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

為克服現(xiàn)有技術(shù)檢測技術(shù)的不足，本發(fā)明的目的是提供一組用于檢測CYP2D6基因多態(tài)性的核酸。本發(fā)明的另一個目的是提供一種用于檢測CYP2D6基因多態(tài)性的試劑盒及其檢測方法。

為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案：

一組用于檢測CYP2D6基因多態(tài)性的核酸，該核酸包括CYP2D6*10基因和CYP2D6*14基因多態(tài)性的檢測引物及檢測探針，其中，所述CYP2D6*10基因多態(tài)性的檢測引物和檢測探針包括針對C100T位點的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示的C100T野生型上游引物1W-F、如SEQ ID No.2所示的C100T突變型上游引物1M-F和如SEQ ID No.3所示的C100T公用下游引物1C-R，和核苷酸序列如SEQ ID No.4所示的C100T檢測探針1P；

及針對G4268C位點的核苷酸序列如SEQ ID No.5所示的G4268C野生型上游引物2W-F、如SEQ ID No.6所示的G4268C突變型上游引物2M-F和如SEQ ID No.7所示的G4268C公用下游引物2C-R，及核苷酸序列如SEQ ID No.8所示的G4268C檢測探針2P；

所述CYP2D6*14基因多態(tài)性的檢測引物和檢測探針包括核苷酸序列如SEQ ID No.9所示的G1758A野生型上游引物3W-F、如SEQ ID No.10所示的G1758A突變型上游引物3M-F和如SEQ ID No.11所示的G1758A公用下游引物3C-R，和核苷酸序列如SEQ ID No.12所示的G1758A檢測探針3P。

如上所述的核酸，優(yōu)選地，所述核酸還包括內(nèi)部質(zhì)控，其包括質(zhì)控引物對和質(zhì)控探針，所述質(zhì)控引物對的核苷酸序列如SEQ ID No.13和SEQ ID No.14所示，所述質(zhì)控探針的核苷酸序列如SEQ ID No.15所示。

如上所述的核酸，優(yōu)選地，所述核酸還包括CYP2D6*10基因C100T位點、G4268C位點和CYP2D6*14基因G1758A位點對應(yīng)的野生型陽性對照物、突變型陽性對照物及質(zhì)控陽性對照物，其中，所述C100T位點的野生型陽性對照物含有如SEQ ID No.16所示的核苷酸序列，所述C100T位點的突變型陽性對照物含有如SEQ ID No.17所示的核苷酸序列，所述G4268C位點的野生型陽性對照物含有如SEQ ID No.18所示的核苷酸序列，所述G4268C位點的突變型陽性對照物含有如SEQ ID No.19所示的核苷酸序列，所述G1758A位點的野生型陽性對照物含有如SEQ ID No.20所示的核苷酸序列，所述G1758A位點的突變型陽性對照物含有如SEQ ID No.21所示的核苷酸序列，所述質(zhì)控陽性對照物含有如SEQ ID No.22所示的核苷酸序列。

一種用于快速檢測CYP2D6基因多態(tài)性的試劑盒，該試劑盒包括如上所述的核酸，其中，各基因的所述檢測探針的5＇端連接熒光基團，3＇端連接淬滅基團。

如上所述的試劑盒，優(yōu)選地，試劑盒還包括10×PCR緩沖液、DNA聚合酶、dNTPs、礦物油、陰性對照物：無核酸酶水。

如上所述的試劑盒，優(yōu)選地，所述熒光基團為FAM、JOE、CY3、HEX中任意一種，所述淬滅基團為MGB、BHQ1、TAMRA、BHQ2中任意一種。

如上所述試劑盒的使用方法，該方法包括以下步驟：

(1)待測樣本基因組DNA的提?。?/p>

(2)PCR反應(yīng)液配制：每多態(tài)性位點分別配制突變型檢測體系和野生型檢測體系；分別向所述突變型檢測體系和所述野生型檢測體系中加入同一樣本DNA，短暫離心，混合均勻；

(3)熒光定量PCR檢測：將配制好的PCR體系放入熒光PCR儀器中，進行熒光定量PCR擴增檢測；

(4)結(jié)果判讀：根據(jù)突變型檢測體系的Ct值與野生型檢測體系的Ct值的差△Ct對樣品的基因型進行判讀，若△Ct<-3，則該樣本該基因位點基因型為突變型；若-3≤△Ct≤3，則該樣本該基因位點基因型為雜合型；若△Ct>3，則該樣本該基因位點基因型為野生型。

如上所述的使用方法，優(yōu)選地，步驟(2)中，所述實時熒光PCR擴增的反應(yīng)程序為：

第一階段：95℃5min；

第二階段：95℃5s，58℃30s，10個循環(huán)；

第三階段：95℃5s，58℃30s，72℃30s，35個循環(huán)；

信號收集：第三階段72℃時收集熒光信號。

如上所述的使用方法，優(yōu)選地，在步驟(2)中，所述野生型檢測體系和所述突變型檢測體系中還包括有作為內(nèi)部質(zhì)控的質(zhì)控引物對和質(zhì)控探針，所述質(zhì)控探針的5＇端連接有不同于任一檢測探針的熒光基團。

如上所述的使用方法，優(yōu)選地，各基因的所述檢測探針的5＇端連接FAM，3＇端連接MGB，所述質(zhì)控探針的5＇端連接JOE，3＇端連接BHQ1。

如上所述的使用方法，優(yōu)選地，在所述步驟(4)中，檢測樣本的所述內(nèi)部質(zhì)控的JOE信號應(yīng)有典型的“S”型擴增曲線，且Ct值在12～30之間，再確定所述樣本DNA的基因型；否則應(yīng)重新進行檢測。

如上所述的使用方法，優(yōu)選地，在步驟(2)中，還設(shè)有陽性對照和陰性對照，所述陽性對照為以各基因?qū)?yīng)的野生型陽性對照物和突變型陽性對照物、及質(zhì)控陽性對照物為模板，進行所述野生型檢測體系和突變型檢測體系的實時熒光PCR擴增；所述陰性對照為以水為模板，進行所述野生型檢測體系和突變型檢測體系的實時熒光PCR擴增；

在步驟(4)中，各基因的所述陽性對照的野生型反應(yīng)體系和突變型反應(yīng)體系應(yīng)有有典型的“S”型擴增曲線，且Ct值≤30；所述陰性對照的各基因的野生型檢測體系和突變型檢測體系的應(yīng)無擴增曲線和Ct值，符合要求；否則，應(yīng)重新進行檢測。

本發(fā)明提供了一組用于快速檢測CYP2D6基因位點多態(tài)性的核酸，同時建立了一種比較高效、靈敏的CYP2D6基因多態(tài)性位點的檢測試劑盒及快速檢測方法。具體實現(xiàn)對CYP2D6*10基因C100T和G4268C、CYP2D6*14基因G1758A的位點多態(tài)性進行檢測，其檢測試劑盒，使用方便，操作簡便，自動化程度高，大大簡化了操作過程，并減少了在操作過程的污染，檢測效果好，具有高靈敏度、高特異性、高準確度、高精確度的特點。提供的檢測方法采用完全閉管操作，操作簡單、方便快捷、通過直接探測PCR過程中熒光信號值的獲得檢測的結(jié)果，不需要PCR后處理或電泳檢測，克服了常規(guī)PCR技術(shù)的易污染、出現(xiàn)假陽性，能有效避免非特異性擴增難題，并且適合大批量樣本的檢測。

本發(fā)明提供的檢測試劑盒及方法，用于檢測CYP2D6基因多態(tài)性位點時，為了避免漏檢、及初步判斷樣本DNA量是否在允許范圍內(nèi)，設(shè)有內(nèi)部質(zhì)控，為了判斷檢測體系是否正常，還設(shè)有陰性對照和檢測引物的陽性對照；為了避免假陰性及漏檢，設(shè)有野生型、突變型和內(nèi)部質(zhì)控的陽性對照，其陽性對照檢測呈陽性結(jié)果，說明檢測體系沒有問題，不會出現(xiàn)假陰性結(jié)果及漏檢，如陽性對照檢測呈陰性結(jié)果，說明檢測體系有問題，或試劑已經(jīng)失效，應(yīng)重新配置體系進行檢測；為了避免假陽性及漏檢，設(shè)有陰性對照，其陰性對照檢測呈陰性結(jié)果，說明檢測體系沒有問題，不會出現(xiàn)假陽性結(jié)果及漏檢，如陰性對照檢測呈陽性結(jié)果，說明檢測體系有問題，已被污染，應(yīng)重新配置體系進行檢測；本發(fā)明提供檢測試劑盒及方法設(shè)計嚴謹，有效避免漏檢、錯檢的可能。

本發(fā)明設(shè)計的引物和探針序列靈敏度高，可以準確檢出低至1ng的基因組DNA，特異性強，只能特異性擴增目標片段，無非特異性擴增；本發(fā)明所提供的檢測方法與測序法100％吻合；本發(fā)明方法能夠準確區(qū)分各種基因型，且結(jié)果直觀、易判讀，本發(fā)明所提供的檢測方法能在90分鐘內(nèi)完成檢測，所需時間遠低于測序法，特別適合臨床用藥診斷；本發(fā)明試劑盒和檢測方法適用于ABI7500、羅氏LC480、Bio-Rad CFX96等熒光定量PCR儀，適用性好。

附圖說明

圖1、圖2和圖3為實施例4中EDTA抗凝全血提取的基因組DNA樣本(樣本1)的擴增曲線。

圖4、圖5和圖6為實施例4中口腔拭子提取的基因組DNA樣本(樣本2)的擴增曲線。

圖7、圖8和圖9為本發(fā)明優(yōu)選的試劑盒檢測靈敏度的擴增曲線。

圖10、圖11和圖12本發(fā)明優(yōu)選的試劑盒檢測精密度的擴增曲線。

圖13、圖14和圖15本發(fā)明優(yōu)選的試劑盒檢測特異性的擴增曲線。

具體實施方式

以下結(jié)合具體實例對本發(fā)明做進一步詳細說明，并非對本發(fā)明的限定，本發(fā)明的實施方式并不限于此，本發(fā)明提供的核苷酸序列的互補序列也可實現(xiàn)本發(fā)明，如無特殊說明，所用試劑為常規(guī)試劑，因此凡依照本公開內(nèi)容所作出的本領(lǐng)域的等同替換，均屬于本發(fā)明的保護范圍。

實施例1引物、探針、驗證模板設(shè)計

根據(jù)NCBI dbSNP數(shù)據(jù)庫(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/SNP/)公布的CYP2D6*10和CYP2D6*14序列信息，分別針對這CYP2D6基因的2種等位基因如表1，設(shè)計多態(tài)性位點的檢測引物和探針，經(jīng)過篩選、優(yōu)化、大量試驗驗證獲得引物和探針序列具體如下：

(1)用于CYP2D6*10SNP位點基因多態(tài)性檢測的引物和探針：

C100T野生型等位基因上游引物(1W-F)：

5'-CGCCAACGCTGGGCTGCACGCTAC-3'(SEQ ID NO.1),

C100T突變型等位基因上游引物(1M-F)：

5'-CGCCAACGCTGGGCTGCACGCTAT-3'(SEQ ID NO.2),

C100T等位基因公用下游引物(1C-R):

5'-CCTCAGGACCTCTGCCGCCCTCC-3'(SEQ ID NO.3),

C100T等位基因特異性探針(1P)：

5'-TGTTCTGGAAGTCCACATGCAGCA-3'(SEQ ID NO.4)；

G4268C野生型等位基因上游引物(2W-F)：

5'-TGTCTTTGCT TTCCTGGTGAG-3'(SEQ ID NO.5)；

G4268C突變型等位基因上游引物(2W-F)：

5'-TGTCTTTGCT TTCCTGGTGAC-3'(SEQ ID NO.6)；

G4268C等位基因公用下游引物(2C-R)：

5'-GTGAGCAGGGGACCCGAGTTGG-3'(SEQ ID NO.7)；

G4268C等位基因特異性探針(2P)：

5'-GGCTGGGGACTAGGTACCCCATT-3'(SEQ ID NO.8)；

(2)用于CYP2D6*10SNP位點基因多態(tài)性檢測的引物和探針：

G1758A野生型等位基因上游引物(3W-F)：

5'-TGCCCTTCTGCCCATCACCCACG-3'(SEQ ID NO.9)；

G1758A突變型等位基因上游引物(3M-F)：

5'-TGCCCTTCTGCCCATCACCCACA-3'(SEQ ID NO.10)；

G1758A等位基因公用下游引物(3C-R)：

5'-CGCGAGCAGAGGCGCTTCTCCGT-3'(SEQ ID NO.11)；

G1758A等位基因特異性探針(3P)：

5'-CTCCTCGGTCACCCACTGCTCCAGCGACTTC-3'(SEQ ID NO.12)。

表1.CYP2D6基因2種等位基因

野生型上游引物與下游引物擴增的PCR產(chǎn)物可作為野生型陽性模板，突變型上游引物與公共下游引物擴增的PCR產(chǎn)物可作為突變型陽性模板，各基因的多態(tài)性位點對應(yīng)的野生型陽性對照物、突變型陽性對照物如下CYP2D6*10基因C100T位點的野生型陽性對照物含有如SEQ ID No.16所示的核苷酸序列，C100T位點的突變型陽性對照物含有如SEQ ID No.17所示的核苷酸序列，CYP2D6*10基因的G4268C位點的野生型陽性對照物含有如SEQ ID No.18所示的核苷酸序列，G4268C位點的突變型陽性對照物含有如SEQ ID No.19所示的核苷酸序列，CYP2D6*14基因的G1758A位點的野生型陽性對照物含有如SEQ ID No.20所示的核苷酸序列，G1758A位點的突變型陽性對照物含有如SEQ ID No.21所示的核苷酸序列。

SEQ ID No.16：

5’-CGCCAACGCTGGGCTGCACGCTACCCACCAGGCCCCCTGCCACTGCCCGGGCTGGGCAACCTGCTGCATGTGGACTTCCAGAACACACCATACTGCTTCGACCAGGTGAGGGAGGAGGTCCTGGAGGGCGGCAGAGGTCCTGAGG-3’

SEQ ID No.17：

5’-CGCCAACGCTGGGCTGCACGCTATCCACCAGGCCCCCTGCCACTGCCCGGGCTGGGCAACCTGCTGCATGTGGACTTCCAGAACACACCATACTGCTTCGACCAGGTGAGGGAGGAGGTCCTGGAGGGCGGCAGAGGTCCTGAGG-3’

SEQ ID No.18：

5’-TGTCTTTGCTTTCCTGGTGAGCCCATCCCCCTATGAGCTTTGTGCTGTGCCCCGCTAGAATGGGGTACCTAGTCCCCAGCCTGCTCCCTAGCCAGAGGCTCTAATGTACAATAAAGCAATGTGGTAGTTCCAACTCGGGTCCCCTGCTCAC-3’

SEQ ID No.19：

5’-TGTCTTTGCTTTCCTGGTGACCCCATCCCCCTATGAGCTTTGTGCTGTGCCCCGCTAGAAT GGGGTACCTAGTCCCCAGCCTGCTCCCTAGCCAGAGGCTCTAATGTACAATAAAGCAATG TGGTAGTTCCAACTCGGGTCCCCTGCTCAC-3’

SEQ ID No.20：

5’-TGCCCTTCTGCCCATCACCCACGGGAGTGGTTGGCGAAGGCGGCACAAAGGCAGGCGGCCTCCTCGGTCACCCACTGCTCCAGCGACTTCTTG CCCAGGCCCAAGTTGCGCAAGGTGGAGACGGAGAAGCGCCTCTGCTCGCG-3’

SEQ ID No.21：

5’-TGCCCTTCTGCCCATCACCCACAGGAGTGGTTGGCGAAGGCGGCACAAAGGCAGGCGGCCTCCTCGGTCACCCACTGCTCCAGCGACTTCTTG CCCAGGCCCAAGTTGCGCAAGGTGGAGACGGAGAAGCGCCTCTGCTCGCG-3’

進一步，為了對實時熒光PCR反應(yīng)體系和實驗操作過程進行內(nèi)部質(zhì)控，同時檢測樣本的質(zhì)量，避免漏加檢測樣本，根據(jù)人類看家基因GAPDH(NC_000012.12)的序列，設(shè)計了作為內(nèi)部質(zhì)控的一對質(zhì)控引物對和質(zhì)控探針，要求該內(nèi)部質(zhì)控不僅可以作為試劑盒的質(zhì)控，還可以作為樣本DNA的質(zhì)控，保證提取出來的DNA包含基因，可以排除其他序列的非特異交叉反應(yīng)，同時它也不會對各基因多態(tài)性的野生型與突變性的目的基因及引物對和檢測探針產(chǎn)生交叉反應(yīng)，確保試劑盒的準確性。通過對內(nèi)部質(zhì)控的質(zhì)控引物對、質(zhì)控探針的篩選和體系優(yōu)化，建立了實時熒光PCR內(nèi)部質(zhì)控檢測體系，優(yōu)選地，質(zhì)控引物對(R-F、R-R)、質(zhì)控探針(RP)如下：

內(nèi)控上游引物(R-F)：5'-CATCAAGAAGGTGGTGAAGCAG-3'(SEQ ID NO.13)，

內(nèi)控下游引物(R-R)：5'-TGTCGCTGTTGAAGTCAGAGGA-3'(SEQ ID NO.14)，

內(nèi)控探針(RP)：5'-TGGTGCTCAGTGTAGCCCAGGATGC-3'(SEQ ID NO.15)。

作為內(nèi)部質(zhì)控的質(zhì)控引物對進行PCR擴增時，其擴增序列的大小為98bp。將擴增序列作為內(nèi)部質(zhì)控陽性對照物，即包含如SEQ ID No.22所示序列，作為驗證是否漏加檢測樣品的質(zhì)控陽性對照物，

SEQ ID No.22：

5’-CATCAAGAAGGTGGTGAAGCAGGCGTCGGAGGGCCCCCTCAAGGGCATCCTGGGCTACACTGAGCACCAGGTGGTCTCCTCTGACTTCAACAGCGACA-3’

作為試劑盒特異性驗證進行PCR擴增時，選擇人類基因組ABCB1基因，位于7號染色體上，其C3435T基因多態(tài)性也與阿片類藥物個體化用藥密切相關(guān)。為試劑盒有無交叉反應(yīng)驗證所需，其質(zhì)粒序列如SEQ ID No.23所示序列，長度為100bp。

SEQ ID No.23：

5’-TGGAGACAACAGCCGGGTGGTGTCACAGGAAGAGATCGTGAGGGCAGCAAAGGAGGCCAACATACATGCCTTCATCGAGTCACTGCCTAATGTAAGTCTC-3’。

實施例2用于檢測CYP2D6基因多態(tài)性位點的試劑盒

用于快速檢測CYP2D6基因多態(tài)性位點的實時熒光PCR試劑盒包括以下成分：如實施例1中所述的各基因的引物、檢測探針、野生型陽性對照物、突變型陽性對照物、各基因的檢測探針的5＇端連接熒光基團，3＇端連接淬滅基團；其中，熒光基團為FAM、JOE、CY3、HEX中任意一種，所述淬滅基團為MGB、BHQ1、TAMRA、BHQ2中任意一種。

為了避免漏檢，錯檢，還包括：作為內(nèi)部質(zhì)控的質(zhì)控引物對、質(zhì)控探針和質(zhì)控陽性對照物，序列如實施例1中所述，且質(zhì)控探針的熒光基團不同于檢測探針的熒光基團。

為了防止反應(yīng)體系在PCR擴增過程中揮發(fā)，影響檢測效果，試劑盒還包括有礦物油。

為了便于反應(yīng)體系的配置，試劑盒還包括10×PCR緩沖液、DNA聚合酶、dNTPs、陰性對照物：無核酸酶水。其中DNA聚合酶可采用Taqman Master Mix全稱TaqMan Real-Time PCR Master Mixes，購自Thermo Fisher Scientific(賽默飛世爾科技公司)；10×PCR buffer(Mg²⁺Plus)采用TaKaRa寶生物工程(大連)有限公司，也可應(yīng)用市場上其他公司的緩沖液與DNA聚合酶。

實施例3檢測試劑盒的制備

本實施例的試劑盒是在實施例2的基礎(chǔ)上，制備成可以直接加入檢測樣品后進行檢測的試劑盒，由CYP2D6 6聯(lián)PCR反應(yīng)條以及CYP2D6陽性對照組成，試劑盒中各管中的成分見表2。

表2 試劑盒組成

Taqman Master Mix的全稱為TaqMan Real-Time PCR Master Mixes，購自Thermo Fisher Scientific(賽默飛世爾科技公司)；10×PCR buffer(Mg²⁺Plus)采用TaKaRa寶生物工程(大連)有限公司，也可應(yīng)用市場上其他公司的緩沖液與DNA聚合酶。

實施例4本發(fā)明試劑盒的使用方法

本實施例中收集正常人EDTA抗凝全血樣本(由武大人民醫(yī)院提供)和口腔拭子樣本(由同濟醫(yī)院提供)各一例，并從中提取基因組DNA，用CYP2D6基因多態(tài)性檢測試劑盒檢測待測樣本中CYP2D6基因突變狀態(tài)。具體步驟如下：

1、臨床樣本DNA的提取

參照天根生化科技有限公司血液基因組DNA提取試劑盒和口腔拭子基因組DNA提取試劑盒說明，獲得樣品基因組DNA。DNA提取完畢后用Nanodrop 2000超微量分光光度計對樣品DNA進行濃度測定，樣本DNA濃度應(yīng)在20ng/μL～200ng/μL為宜，且OD260/OD280在1.65～1.80之間。

2、PCR反應(yīng)體系配制

應(yīng)用本發(fā)明實施例3制備的試劑盒對檢測樣品的DNA模板，進行CYP2D6*10基因的C100T位點、CYP2D6*10基因的G4268C位點、CYP2D6*14基因的G1758A位點多態(tài)性實時熒光PCR擴增檢測。

其中，每個多態(tài)性檢測位點分別包括突變型檢測體系和野生型檢測體系，具體地，各檢測體系配置可將見表3和表4，其中各基因的檢測探針的5＇端連接FAM，3＇端連接MGB，所述質(zhì)控探針的5＇端連接JOE，3＇端連接BHQ1。以上檢測體系配制完成后分別分裝到PCR反應(yīng)管中，向以上PCR反應(yīng)管中分別加入2.0μL同一樣本DNA，短暫離心數(shù)秒，使PCR反應(yīng)體系混合均勻。

表3 CYP2D6*10熒光定量PCR反應(yīng)體系

表4 CYP2D6*14熒光定量PCR反應(yīng)體系

3、熒光PCR檢測

將配置好的PCR體系放入ABI7500熒光PCR儀器中，進行熒光PCR擴增檢測。反應(yīng)條件為：

第一階段：95℃預(yù)變性5min；

第二階段：95℃20s，58℃30s，10個循環(huán)；

第三階段:95℃20s，58℃30s(收集FAM和JOE信號)，35個循環(huán)。

PCR程序結(jié)束后，自動設(shè)置基線和閾值線，得到樣本的Ct值。

4、結(jié)果判讀

NTC和陽性對照分析：正常情況下NTC反應(yīng)孔應(yīng)無擴增曲線和Ct值，否則，說明可能存在操作污染，此時，應(yīng)排除污染來源后重新開始實驗；陽性對照反應(yīng)孔應(yīng)有典型的“S”型擴增曲線，且Ct值≤30，否則，說明PCR反應(yīng)體系可能出現(xiàn)異常，影響了擴增效率。

內(nèi)控分析：一般地，內(nèi)控JOE信號應(yīng)有典型的“S”型擴增曲線，且Ct值在12～30之間。若Ct值≤12，表明所加樣本DNA濃度過高，應(yīng)酌情減少DNA上樣量；若Ct≥30，表明所加樣本DNA拷貝數(shù)偏低或者樣本DNA中可能存在PCR抑制劑；若內(nèi)控JOE信號無擴增曲線，可能存在樣本DNA漏加，應(yīng)重新開始實驗。

樣本基因型分析：在NTC(陰性對照)、陽性對照和內(nèi)控JOE信號均正常的前提下，根據(jù)突變型檢測體系Ct值與野生型檢測體系Ct值的差(△Ct)對樣品的基因型進行判讀(見表5)。針對任意一個多態(tài)性檢測位點，若△Ct<-3，則該樣本該基因位點基因型為突變型；若-3≤△Ct≥3，則該樣本該基因位點基因型為雜合型；若△Ct>3，則該樣本該基因位點基因型為野生型。

表5 CYP2D6基因三個多態(tài)性位點基因型結(jié)果判定

本實施例中EDTA抗凝全血提取的基因組DNA樣本(樣本1標記為rm1)的擴增曲線見圖1、圖2和圖3，基因多態(tài)性見表6。

本實施例中口腔拭子提取的基因組DNA樣本(樣本2標記為rm2)的擴增曲線見圖4、圖5和圖6，基因多態(tài)性見表6。

表6 樣本檢測結(jié)果

說明：EDTA抗凝血提取的基因組DNA和口腔拭子提取的基因組DNA用本發(fā)明的試劑盒檢測的結(jié)果和sanger測序的結(jié)果完全一致，試劑盒準確度高，適應(yīng)樣本廣。Sanger測序法是臨床檢驗上普遍使用的金標準檢測方法。

實施例5：本發(fā)明試劑盒的性能分析實驗

CYP2D6重組質(zhì)粒購自南京金斯瑞生物科技有限公司，以現(xiàn)有基因工程技術(shù)人工合成的CYP2D6*10基因C100T多態(tài)性位點含有SEQ ID NO:16所示序列為野生型質(zhì)粒，含有SEQ ID NO:17所示序列為突變型質(zhì)粒；CYP2D6*10基因G4268C多態(tài)性位點含有SEQ ID NO:18所示序列為野生型質(zhì)粒，含有SEQ ID NO:19所示序列為突變型質(zhì)粒；CYP2D6*14基因的G1758A多態(tài)性位點含有SEQ ID NO:20所示序列為野生型質(zhì)粒，含有SEQ ID NO:21所示序列為突變型質(zhì)粒；人工合成含有SEQ ID NO:22所示序列為內(nèi)控質(zhì)粒。各質(zhì)粒干粉用TE(10mmol/L，PH8.0)復(fù)溶，定量后稀釋。

(1)靈敏度

分別取三種基因位點的2×10¹copies/μL的野生型質(zhì)粒與內(nèi)控質(zhì)粒1:1混合，配置成終濃度為10copies/μL的CYP2D6野生型參考品(編號為：CY100W-1、CY4268W-1、CY1758W-1)；分別取三種基因位點的2×10¹copies/μL的突變型質(zhì)粒與內(nèi)控質(zhì)粒1:1混合，配置成終濃度為10copies/μL的CYP2D6突變型參考品(編號為：CY100M-1、CY4268M-1、CY1758M-1)；分別取三種基因位點的取2×10¹copies/μL的野生型質(zhì)粒、突變型質(zhì)粒、內(nèi)控質(zhì)粒1:1:2體積比混合，配置成終濃度為10copies/μL的CYP2D6雜合型參考品(編號為：CY100WM-1、CY4268WM-1、CY1758WM-1)。以這三種參考品為模板，采用實施例4中熒光定量PCR方法進行擴增，擴增圖結(jié)果見圖7、圖8、圖9。檢測結(jié)果表明，本發(fā)明的熒光PCR方法特異性強，靈敏度高，10copies/μL濃度的DNA模板均可檢出。

(2)精密度

分別取三種基因位點的6×10³copies/μL的野生型質(zhì)粒、突變型質(zhì)粒、內(nèi)控質(zhì)粒1:1:2體積比混合，配置成終濃度為3×10³copies/μL的CYP2D6雜合參考品(編號為：CY100WM-2、CY4268WM-2、CY1758WM-2)。以這三種參考品為模板，采用實施例4中熒光定量PCR方法進行擴增，擴增圖結(jié)果見圖10、圖11、圖12。結(jié)果表明本發(fā)明的實時熒光PCR擴增方法重復(fù)性好(20次重復(fù)實驗結(jié)果穩(wěn)定，CV<5％)。

(3)特異性

ABCB1質(zhì)粒人工合成于南京金斯瑞生物科技有限公司。以現(xiàn)有基因工程技術(shù)人工合成的含有SEQ ID NO:23所示序列ABCB1基因質(zhì)粒，分別取6×10⁴copies/μL的CYP2D6的野生型質(zhì)粒和ABCB1基因質(zhì)粒與內(nèi)控質(zhì)粒1:1混合，配置成終濃度為3×10⁴copies/μL的野生型參考品(樣品編號為：CY100W-3、CY4268W-3、CY1758W-3、ABW-3)，檢測體系編號記為CYP2D6W-3；取上述兩個基因的6×10⁴copies/μL突變型質(zhì)粒和內(nèi)控質(zhì)粒1:1混合，配置成終濃度為3×10⁴copies/μL的突變型參考品(編號為：CY100M-3、CY4268M-3、CY1758M-3、ABM-3)，檢測體系編號記為CYP2D6M3；分別取三種基因位點的野生型質(zhì)粒、突變型質(zhì)粒、ABCB1基因質(zhì)粒和內(nèi)控質(zhì)粒，配置成終濃度為3×10⁴copies/μL的CYP2D6雜合型參考品(編號為：CY100WM-3、CY4268WM-3、CY1758WM-3、ABWM-3)，檢測體系編號記為CYP2D6M3。以上述三種參考品為模板，用本發(fā)明實施例3制備的試劑盒對進行實時熒光PCR擴增檢測，擴增圖見圖13、圖14、圖15。結(jié)果表明，本發(fā)明的熒光PCR方法特異性強，ABCB1基因和CYP2D6基因之間無交叉反應(yīng)，3×10⁴copies/μL濃度的ABCB1基因各反應(yīng)體系中均不能檢出，表明本發(fā)明設(shè)計的各基因位點的引物對、探針的特異性好。

以上所述實施例僅是為充分說明本發(fā)明而所舉的較佳的實施例，本發(fā)明的保護范圍不限于此。本技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員在本發(fā)明基礎(chǔ)上所作的等同替代或變換，均在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。

SEQUENCE LISTING

<110> 武漢海吉力生物科技有限公司

<120> 用于檢測人類CYP2D6基因多態(tài)性的核酸、試劑盒及方法

<130>

<160> 23

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 1

cgccaacgct gggctgcacg ctac 24

<210> 2

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 2

cgccaacgct gggctgcacg ctat 24

<210> 3

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 3

cctcaggacc tctgccgccc tcc 23

<210> 4

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 4

tgttctggaa gtccacatgc agca 24

<210> 5

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 5

tgtctttgct ttcctggtga g 21

<210> 6

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 6

tgtctttgct ttcctggtga c 21

<210> 7

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 7

gtgagcaggg gacccgagtt gg 22

<210> 8

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 8

ggctggggac taggtacccc att 23

<210> 9

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 9

tgcccttctg cccatcaccc acg 23

<210> 10

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 10

tgcccttctg cccatcaccc aca 23

<210> 11

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 11

cgcgagcaga ggcgcttctc cgt 23

<210> 12

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 12

ctcctcggtc acccactgct ccagcgactt c 31

<210> 13

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 13

catcaagaag gtggtgaagc ag 22

<210> 14

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 14

tgtcgctgtt gaagtcagag ga 22

<210> 15

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 15

tggtgctcag tgtagcccag gatgc 25

<210> 16

<211> 145

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 16

cgccaacgct gggctgcacg ctacccacca ggccccctgc cactgcccgg gctgggcaac 60

ctgctgcatg tggacttcca gaacacacca tactgcttcg accaggtgag ggaggaggtc 120

ctggagggcg gcagaggtcc tgagg 145

<210> 17

<211> 145

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 17

cgccaacgct gggctgcacg ctatccacca ggccccctgc cactgcccgg gctgggcaac 60

ctgctgcatg tggacttcca gaacacacca tactgcttcg accaggtgag ggaggaggtc 120

ctggagggcg gcagaggtcc tgagg 145

<210> 18

<211> 151

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 18

tgtctttgct ttcctggtga gcccatcccc ctatgagctt tgtgctgtgc cccgctagaa 60

tggggtacct agtccccagc ctgctcccta gccagaggct ctaatgtaca ataaagcaat 120

gtggtagttc caactcgggt cccctgctca c 151

<210> 19

<211> 151

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 19

tgtctttgct ttcctggtga ccccatcccc ctatgagctt tgtgctgtgc cccgctagaa 60

tggggtacct agtccccagc ctgctcccta gccagaggct ctaatgtaca ataaagcaat 120

gtggtagttc caactcgggt cccctgctca c 151

<210> 20

<211> 143

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 20

tgcccttctg cccatcaccc acgggagtgg ttggcgaagg cggcacaaag gcaggcggcc 60

tcctcggtca cccactgctc cagcgacttc ttgcccaggc ccaagttgcg caaggtggag 120

acggagaagc gcctctgctc gcg 143

<210> 21

<211> 143

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 21

tgcccttctg cccatcaccc acaggagtgg ttggcgaagg cggcacaaag gcaggcggcc 60

tcctcggtca cccactgctc cagcgacttc ttgcccaggc ccaagttgcg caaggtggag 120

acggagaagc gcctctgctc gcg 143

<210> 22

<211> 98

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 22

catcaagaag gtggtgaagc aggcgtcgga gggccccctc aagggcatcc tgggctacac 60

tgagcaccag gtggtctcct ctgacttcaa cagcgaca 98

<210> 23

<211> 100

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 23

tggagacaac agccgggtgg tgtcacagga agagatcgtg agggcagcaa aggaggccaa 60

catacatgcc ttcatcgagt cactgcctaa tgtaagtctc 100