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用于檢測人類CYP2D6基因多態(tài)性的核酸、試劑盒及方法與流程

文檔序號:12412750閱讀:來源:國知局

技術特征:

1.一組用于檢測CYP2D6基因多態(tài)性的核酸,其特征在于,該核酸包括CYP2D6*10基因和CYP2D6*14基因多態(tài)性的檢測引物及檢測探針,其中,所述CYP2D6*10基因多態(tài)性的檢測引物和檢測探針包括針對C100T位點的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示的C100T野生型上游引物1W-F、如SEQ ID No.2所示的C100T突變型上游引物1M-F和如SEQ ID No.3所示的C100T公用下游引物1C-R,和核苷酸序列如SEQ ID No.4所示的C100T檢測探針1P;

及針對G4268C位點的核苷酸序列如SEQ ID No.5所示的G4268C野生型上游引物2W-F、如SEQ ID No.6所示的G4268C突變型上游引物2M-F和如SEQ ID No.7所示的G4268C公用下游引物2C-R,及核苷酸序列如SEQ ID No.8所示的G4268C檢測探針2P;

所述CYP2D6*14基因多態(tài)性的檢測引物和檢測探針包括核苷酸序列如SEQ ID No.9所示的G1758A野生型上游引物3W-F、如SEQ ID No.10所示的G1758A突變型上游引物3M-F和如SEQ ID No.11所示的G1758A公用下游引物3C-R,和核苷酸序列如SEQ ID No.12所示的G1758A檢測探針3P。

2.如權利要求1所述的核酸,其特征在于,所述核酸還包括內部質控,其包括質控引物對和質控探針,所述質控引物對的核苷酸序列如SEQ ID No.13和SEQ ID No.14所示,所述質控探針的核苷酸序列如SEQ ID No.15所示。

3.如權利要求2所述所述的核酸,其特征在于,所述核酸還包括CYP2D6*10基因C100T位點、G4268C位點和CYP2D6*14基因G1758A位點對應的野生型陽性對照物、突變型陽性對照物及質控陽性對照物,其中,所述C100T位點的野生型陽性對照物含有如SEQ ID No.16所示的核苷酸序列,所述C100T位點的突變型陽性對照物含有如SEQ ID No.17所示的核苷酸序列,所述G4268C位點的野生型陽性對照物含有如SEQ ID No.18所示的核苷酸序列,所述G4268C位點的突變型陽性對照物含有如SEQ ID No.19所示的核苷酸序列,所述G1758A位點的野生型陽性對照物含有如SEQ ID No.20所示的核苷酸序列,所述G1758A位點的突變型陽性對照物含有如SEQ ID No.21所示的核苷酸序列,所述質控陽性對照物含有如SEQ ID No.22所示的核苷酸序列。

4.一種用于快速檢測CYP2D6基因多態(tài)性的試劑盒,其特征在于,該試劑盒包括如權利要求1-3中任一所述的核酸,其中,各基因的所述檢測探針的5'端連接熒光基團,3'端連接淬滅基團。

5.如權利要求4所述的試劑盒,其特征在于,該試劑盒還包括10×PCR緩沖液、DNA聚合酶、dNTPs、陰性對照物:無核酸酶水;所述熒光基團為FAM、JOE、CY3、HEX中任意一種,所述淬滅基團為MGB、BHQ1、TAMRA、BHQ2中任意一種。

6.如權利要求4或5所述試劑盒的使用方法,其特征在于,該方法包括以下步驟:

(1)待測樣本基因組DNA的提取;

(2)PCR反應液配制:每多態(tài)性位點分別配制突變型檢測體系和野生型檢測體系;分別向所述突變型檢測體系和所述野生型檢測體系中加入同一樣本DNA,短暫離心,混合均勻;

(3)熒光定量PCR檢測:將配制好的PCR體系放入熒光PCR儀器中,進行熒光定量PCR擴增檢測;

(4)結果判讀:根據(jù)突變型檢測體系的Ct值與野生型檢測體系的Ct值的差△Ct對樣品的基因型進行判讀,若△Ct<-3,則該樣本該基因位點基因型為突變型;若-3≤△Ct≤3,則該樣本該基因位點基因型為雜合型;若△Ct>3,則該樣本該基因位點基因型為野生型。

7.如權利要求6所述的使用方法,其特征在于,步驟(2)中,所述實時熒光PCR擴增的反應程序為:

第一階段:95℃5min;

第二階段:95℃5s,58℃30s,10個循環(huán);

第三階段:95℃5s,58℃30s,72℃30s,35個循環(huán);

信號收集:第三階段72℃時收集熒光信號。

8.如權利要求7所述的使用方法,其特征在于,在步驟(2)中,所述野生型檢測體系和所述突變型檢測體系中還包括有作為內部質控的質控引物對和質控探針,所述質控探針的5'端連接有不同于任一檢測探針的熒光基團。

9.如權利要求8所述的使用方法,其特征在于,各基因的所述檢測探針的5'端連接FAM,3'端連接MGB,所述質控探針的5'端連接JOE,3'端連接BHQ1;

在所述步驟(4)中,檢測樣本的所述內部質控的JOE信號應有典型的“S”型擴增曲線,且Ct值在12~30之間,再確定所述樣本DNA的基因型;否則應重新進行檢測。

10.如權利要求8或9所述的方法,其特征在于,在步驟(2)中,還設有陽性對照和陰性對照,所述陽性對照為以各基因對應的野生型陽性對照物和突變型陽性對照物、及質控陽性對照物為模板,進行所述野生型檢測體系和突變型檢測體系的實時熒光PCR擴增;所述陰性對照為以水為模板,進行所述野生型檢測體系和突變型檢測體系的實時熒光PCR擴增;

在步驟(4)中,各基因的所述陽性對照的野生型反應體系和突變型反應體系應有有典型的“S”型擴增曲線,且Ct值≤30;所述陰性對照的各基因的野生型檢測體系和突變型檢測體系的應無擴增曲線和Ct值,符合要求;否則,應重新進行檢測。

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