本發(fā)明屬于細(xì)胞工程與病毒培養(yǎng)
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體地說，本發(fā)明涉及一種能大幅提高PCV2(豬圓環(huán)病毒2型)培養(yǎng)毒價(jià)的鏈球菌培養(yǎng)物制劑及其制備方法與使用該制劑提高PCV2培養(yǎng)毒價(jià)的方法。
背景技術(shù)：
：目前國(guó)內(nèi)正在使用的豬圓環(huán)病毒疫苗主要有2種——亞單位苗和全病毒疫苗，亞單位苗雖安全性較好，但生產(chǎn)成本高昂，免疫期短。因此國(guó)內(nèi)絕大部分豬場(chǎng)仍以全病毒疫苗為主。但全病毒疫苗生產(chǎn)亦有其技術(shù)瓶頸：圓環(huán)病毒體外培養(yǎng)的細(xì)胞感染能力不高，感染速度慢，病毒在不同細(xì)胞個(gè)體中的復(fù)制速度差異極大，病毒培養(yǎng)效價(jià)很難上升到理想狀態(tài)。為解決該難題，所有生產(chǎn)者都在其培養(yǎng)工藝中增加一個(gè)用D-氨基葡萄糖處理，使細(xì)胞停留于分裂Ⅱ期，保證病毒擴(kuò)增的程序。但該程序不僅增加了原材料投入，而且增加了生產(chǎn)環(huán)節(jié)、人力投入和廢棄物排放量等，使生產(chǎn)成本至少增加1倍以上，即便如此，國(guó)內(nèi)許多廠家生產(chǎn)的圓環(huán)病毒疫苗，其病毒效價(jià)在104以下，免疫效果較差。歐美國(guó)家采取篩選對(duì)圓環(huán)病毒高度敏感細(xì)胞系培養(yǎng)圓環(huán)病毒以及進(jìn)行病毒濃縮，其病毒含量均在106以上，免疫效果較好，但其生產(chǎn)成本高昂，因此其銷售價(jià)格往往是國(guó)產(chǎn)疫苗的3-5倍。因此如何提高圓環(huán)病毒的培養(yǎng)毒價(jià)而又降低生產(chǎn)成本是國(guó)內(nèi)廠家目前提高圓環(huán)病毒疫苗競(jìng)爭(zhēng)能力的主攻方向。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)存在的缺點(diǎn)與不足，提供一種能大幅提高PCV2培養(yǎng)毒價(jià)的鏈球菌培養(yǎng)物制劑及其制備方法與使用該制劑提高PCV2培養(yǎng)毒價(jià)的方法。本發(fā)明的目的通過下述技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)：一種能大幅度提高PCV2培養(yǎng)毒價(jià)的鏈球菌培養(yǎng)物制劑，由鏈球菌與貼壁細(xì)胞在維持培養(yǎng)基中共培養(yǎng)后收獲的含鏈球菌的上清液經(jīng)高溫滅活制得。其中，所述的鏈球菌優(yōu)選為無乳鏈球菌；所述的細(xì)胞優(yōu)選為PK-15細(xì)胞；所述的維持培養(yǎng)基優(yōu)選為含血清含量≤2％的培養(yǎng)基；所述的貼壁細(xì)胞脫落到維持培養(yǎng)基的含量?jī)?yōu)選為500～1000個(gè)/mL；所述的含鏈球菌的上清液中鏈球菌的含量?jī)?yōu)選為1億～9億個(gè)/mL。所述的鏈球菌培養(yǎng)物制劑能夠使PCV2在不用D-氨基葡萄糖處理的情況下，培養(yǎng)的毒價(jià)達(dá)到10-7以上。所述的能大幅度提高PCV2培養(yǎng)毒價(jià)的鏈球菌培養(yǎng)物制劑的制備方法，包括如下步驟：將培養(yǎng)貼壁細(xì)胞的培養(yǎng)基更換為維持培養(yǎng)基后接種鏈球菌繼續(xù)培養(yǎng)，當(dāng)鏈球菌密度達(dá)到1億～9億個(gè)/mL時(shí)收獲上清液，上清液通過高溫滅活。此滅活后的上清液即為能制劑刺激PCV2培養(yǎng)體系產(chǎn)毒、大幅度提高PCV2培養(yǎng)毒價(jià)的鏈球菌培養(yǎng)物制劑。優(yōu)選的，所述的能大幅度提高PCV2培養(yǎng)毒價(jià)的鏈球菌培養(yǎng)物制劑的制備方法包括如下步驟：(1)貼壁細(xì)胞制備：按照貼壁細(xì)胞培養(yǎng)方法將PK-15細(xì)胞解凍后，培養(yǎng)于克氏瓶中，傳代培養(yǎng)至所需數(shù)量，備用。(2)鏈球菌接種：上述貼壁細(xì)胞最后一次傳代培養(yǎng)至48小時(shí)后更換培養(yǎng)基為含血清2％以下的維持培養(yǎng)基，同時(shí)用接種環(huán)接種鏈球菌，繼續(xù)于37℃、5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。(3)含鏈球菌的培養(yǎng)液收獲：當(dāng)鏈球菌密度達(dá)到1億～9億個(gè)/mL時(shí)，停止培養(yǎng)，收獲上清液。(4)滅活處理：將步驟(3)中收獲的上清液經(jīng)高溫高壓處理使上清液中的鏈球菌被徹底滅活。所述的高溫高壓處理的條件優(yōu)選為：120℃、0.15Pa處理30分鐘。利用上述鏈球菌培養(yǎng)物制劑提高PCV2培養(yǎng)毒價(jià)的方法，包括如下步驟：將鏈球菌培養(yǎng)物制劑按照0.1～1％(體積百分比)的濃度加到維持培養(yǎng)基中，配成刺激PCV2產(chǎn)毒的專用培養(yǎng)基，以該專用培養(yǎng)基作為PCV2培養(yǎng)用維持培養(yǎng)基培養(yǎng)PCV2。優(yōu)選的，所述的利用上述鏈球菌培養(yǎng)物制劑提高PCV2培養(yǎng)毒價(jià)的方法，包括如下步驟：(1)宿主細(xì)胞制備：將PK-15細(xì)胞解凍，培養(yǎng)于克氏瓶中，傳代至所需數(shù)量。(2)病毒接種：將PCV2接種于上述PK-15細(xì)胞，繼續(xù)培養(yǎng)24小時(shí)。(3)刺激PCV2產(chǎn)毒的專用培養(yǎng)基配制：將上述鏈球菌培養(yǎng)物制劑按照0.1～1％的濃度加入到維持培養(yǎng)基中，配成刺激PCV2產(chǎn)毒的專用培養(yǎng)基。(4)刺激PCV2產(chǎn)毒的專用培養(yǎng)基使用：將上述步驟(2)中接種了PCV2并繼續(xù)培養(yǎng)了24小時(shí)的PK-15細(xì)胞的培養(yǎng)液更換為上述步驟(3)中所述的刺激PCV2產(chǎn)毒的專用培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)72～96小時(shí)。本發(fā)明創(chuàng)造了一種能夠顯著提高PCV2培養(yǎng)毒價(jià)的新制劑，與目前普遍采用的用D-氨基葡萄糖處理接種過PCV2的PK-15細(xì)胞以提高PCV2培養(yǎng)毒價(jià)的方法相比較，用本發(fā)明所制備的制劑提高PCV2培養(yǎng)毒價(jià)，不僅大幅度提高了增殖病毒的效果，而且操作更為簡(jiǎn)單，成本更低。與現(xiàn)有技術(shù)相比較，本發(fā)明具有如下優(yōu)點(diǎn)：(1)病毒毒價(jià)的大幅度提高，將使產(chǎn)品質(zhì)量大幅度提升，這對(duì)提高我國(guó)產(chǎn)品與國(guó)外同類產(chǎn)品的競(jìng)爭(zhēng)能力將起到極大的保證作用?，F(xiàn)行技術(shù)用D-氨基葡萄糖處理感染PCV2后的PK-15細(xì)胞，使培養(yǎng)體系產(chǎn)毒能力快速提高，一般生產(chǎn)情況下，只能達(dá)到10-5.5～10-6.5。本發(fā)明則可以使培養(yǎng)體系的PCV2毒價(jià)達(dá)到10-7以上。(2)生產(chǎn)工藝的大幅度簡(jiǎn)化?，F(xiàn)行技術(shù)用D-氨基葡萄糖處理感染PCV2后的PK-15細(xì)胞，使培養(yǎng)體系產(chǎn)毒能力快速提高。由于D-氨基葡萄糖對(duì)培養(yǎng)體系后續(xù)產(chǎn)毒有一定的影響，故其流程中必須加入棄去D-氨基葡萄糖、再用PBS溶液洗滌細(xì)胞幾次的程序，在生產(chǎn)實(shí)際中，每增加一個(gè)程序，將意味著原材料、人力等成本按比例增加，每增加一個(gè)程序還意味著增加一次開啟培養(yǎng)體系出入口，這將極大地增加污染的可能性，這也是導(dǎo)致目前PCV2疫苗生產(chǎn)成本高昂，市場(chǎng)價(jià)格較高的主要原因，盡管目前生產(chǎn)中也有直接將D-氨基葡萄糖加入維持液中培養(yǎng)產(chǎn)毒細(xì)胞，省去洗滌過程，但其對(duì)PCV2增殖效果較經(jīng)典程序大幅度降低，生產(chǎn)的產(chǎn)品質(zhì)量也大幅度降低。本發(fā)明所制備的能大幅度提高PCV2培養(yǎng)毒價(jià)的鏈球菌培養(yǎng)物制劑，則可直接配入培養(yǎng)病毒的維持液，無須經(jīng)歷更換培養(yǎng)基、洗滌等程序，因此將大幅降低生產(chǎn)成本。具體實(shí)施方式下面結(jié)合具體的實(shí)施實(shí)例來進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)當(dāng)理解，這些實(shí)例僅用于說明本發(fā)明，而不能限制本發(fā)明的保護(hù)范圍。實(shí)施例1能大幅度提高PCV2培養(yǎng)毒價(jià)的鏈球菌培養(yǎng)物制劑的制備1、材料和方法(1)種子培養(yǎng)物及主要試劑：PK-15細(xì)胞、無乳鏈球菌：購(gòu)自CCTCC。PBS粉劑：市場(chǎng)購(gòu)買、國(guó)產(chǎn)產(chǎn)品。新生牛血清、DMEM培養(yǎng)基：購(gòu)自Hyclone公司。胰蛋白酶：購(gòu)自sigma公司。(2)主要操作步驟及方法：①貼壁細(xì)胞制備：按照常規(guī)貼壁細(xì)胞培養(yǎng)方法將PK-15細(xì)胞解凍后，培養(yǎng)于克氏瓶中，傳代培養(yǎng)至所需數(shù)量，備用。②鏈球菌接種：上述貼壁細(xì)胞最后一次傳代并培養(yǎng)至48小時(shí)后更換培養(yǎng)基為含血清2％以下的維持培養(yǎng)基(含2％以下新生牛血清的DMEM培養(yǎng)基)，同時(shí)用接種環(huán)接種鏈球菌，繼續(xù)于37℃、5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)(若未特殊說明，文中所述的培養(yǎng)均在37℃、5％CO2培養(yǎng)箱中進(jìn)行)。③含鏈球菌的培養(yǎng)液收獲：上述接種過鏈球菌的細(xì)胞培養(yǎng)12小時(shí)后，每隔6小時(shí)計(jì)數(shù)一次培養(yǎng)液中鏈球菌的密度，期間隨著與鏈球菌共培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，貼壁細(xì)胞會(huì)不斷脫落，收獲不同培養(yǎng)時(shí)間段、不同密度鏈球菌的培養(yǎng)上清液，直至貼壁細(xì)胞完全脫落(脫落的貼壁細(xì)胞含量約為900～1000個(gè)/mL)。收獲的不同時(shí)間的培養(yǎng)液用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。④滅活處理：將步驟③中收獲的上清液經(jīng)120℃、0.15Pa的高溫高壓處理30分鐘，此時(shí)上清液中的鏈球菌被徹底滅活。此滅活后的上清液即為能制劑刺激PCV2培養(yǎng)體系產(chǎn)毒、大幅度提高PCV2培養(yǎng)毒價(jià)的鏈球菌培養(yǎng)物制劑。2、結(jié)果(1)共培養(yǎng)條件下，鏈球菌繁殖速度觀察，結(jié)果見表1：表1培養(yǎng)時(shí)間(小時(shí))1224364860728496108鏈球菌數(shù)(億個(gè)/mL)000.030.51.258.258.52.252.5細(xì)胞脫落情況(％)0000102060100100(2)高溫高壓滅活制劑后無菌檢測(cè)，結(jié)果見表2：表2批次123滅活前鏈球菌活菌數(shù)(個(gè)/mL)0.1×1081×10810×108滅活后鏈球菌活菌數(shù)(個(gè)/mL)000實(shí)施例2鏈球菌與貼壁細(xì)胞共培養(yǎng)物制劑刺激PCV2培養(yǎng)體系產(chǎn)毒效果觀察1、材料和方法(1)種子培養(yǎng)物及主要試劑PK-15細(xì)胞、PCV2種毒：均購(gòu)自CCTCC。PBS粉劑、D-氨基葡萄糖、PCV2專用PCR檢測(cè)試劑盒：市場(chǎng)購(gòu)買、國(guó)產(chǎn)產(chǎn)品。新生牛血清、DMEM培養(yǎng)基：Hyclone公司產(chǎn)品。胰蛋白酶：sigma公司產(chǎn)品。(2)主要操作步驟及方法①宿主細(xì)胞制備：按照常規(guī)方法將PK-15細(xì)胞解凍，培養(yǎng)于克氏瓶中，傳代至所需數(shù)量。②病毒接種：按照常規(guī)方法將PCV2接種于上述PK-15細(xì)胞，繼續(xù)培養(yǎng)24小時(shí)。③刺激PCV2產(chǎn)毒的專用培養(yǎng)基配制：將用實(shí)施例1制備的鏈球菌培養(yǎng)物制劑按照0～1％的濃度(V/V)加入維持培養(yǎng)基中，配成刺激PCV2產(chǎn)毒的專用培養(yǎng)基。④刺激PCV2產(chǎn)毒的專用培養(yǎng)基使用：將上述步驟②中接種了PCV2并繼續(xù)培養(yǎng)了24小時(shí)的PK-15細(xì)胞的培養(yǎng)液更換為上述步驟③中所述的刺激PCV2產(chǎn)毒的專用培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)一定時(shí)間(12～108小時(shí))。⑤收獲病毒：將上述步驟④中的培養(yǎng)上清液收獲，做好標(biāo)記，并進(jìn)行PCV2毒價(jià)測(cè)定，記錄備案，以供疫苗配制或其它后續(xù)使用。⑥PCV2毒價(jià)檢測(cè)：將健康PK-15細(xì)胞消化吹散后接種于96孔培養(yǎng)板，待細(xì)胞長(zhǎng)滿培養(yǎng)孔后，將待測(cè)病毒用維持培養(yǎng)基作10倍倍比稀釋，每個(gè)稀釋度按同步接種法接種6個(gè)培養(yǎng)孔，24小時(shí)后用3mol/L濃度的D-氨基葡萄糖溶液更換培養(yǎng)基，培養(yǎng)箱中作用2小時(shí)，取出，用PBS洗滌5次，更換為維持培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)72小時(shí)，取出培養(yǎng)板，放入-20℃冰箱中反復(fù)凍融三次，每孔分別吹勻后分別取樣，PCV2專用PCR檢測(cè)試劑盒檢測(cè)每孔中PCV2陽性情況，計(jì)算待測(cè)樣品PCV2毒價(jià)。2、結(jié)果(1)不同培養(yǎng)時(shí)間收獲的不同菌體含量的鏈球菌培養(yǎng)物制劑對(duì)PCV2增殖的影響，結(jié)果見表3：表3培養(yǎng)時(shí)間(小時(shí))1224364860728496108鏈球菌數(shù)(億個(gè)/mL)000.030.51.258.258.52.252.5細(xì)胞脫落情況(％)0000102060100100待測(cè)樣品PCV2毒價(jià)10-4.2510-4.7510-4.510-4.510-6.510-710-6.7510-6.510-6.5注：各組鏈球菌培養(yǎng)物制劑在維持培養(yǎng)基中的添加濃度均為0.5％；步驟④PCV2用專用培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)的時(shí)間為72小時(shí)。(2)鏈球菌培養(yǎng)物制劑使用濃度對(duì)PCV2毒價(jià)的影響，結(jié)果見表4：表4添加濃度(％)00.10.250.50.751待測(cè)樣品PCV2毒價(jià)10-4.510-6.510-710-710-710-5.5注：各組鏈球菌培養(yǎng)物制劑均為培養(yǎng)了72小時(shí)的鏈球菌培養(yǎng)物(即鏈球菌數(shù)濃度為8.25億個(gè)/mL)制備而成；步驟④PCV2用專用培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)的時(shí)間為72小時(shí)。(3)鏈球菌培養(yǎng)物制劑配制的專用培養(yǎng)基培養(yǎng)PCV2的時(shí)間對(duì)PCV2毒價(jià)的影響，結(jié)果見表5：表5培養(yǎng)時(shí)間(小時(shí))1224364860728496108待測(cè)樣品PCV2毒價(jià)0010-110-2.510-4.510-6.7510-710-710-5.5注：各組鏈球菌培養(yǎng)物制劑均為培養(yǎng)了72小時(shí)的鏈球菌培養(yǎng)物制備而成，在專用培養(yǎng)基中的添加濃度均為0.5％。(4)鏈球菌培養(yǎng)物制劑與D-氨基葡萄糖對(duì)提高PCV2培養(yǎng)毒價(jià)的對(duì)比觀察，結(jié)果見表6：表6試驗(yàn)批次123D-氨基葡萄糖處理組10-5.510-610-5.5鏈球菌培養(yǎng)物制劑處理組10-6.7510-710-6.5注：兩個(gè)處理組的區(qū)別在于上述步驟④，D-氨基葡萄糖處理組：按常規(guī)方法用D-氨基葡萄糖處理后繼續(xù)培養(yǎng)病毒72小時(shí)；鏈球菌培養(yǎng)物制劑處理組：培養(yǎng)了72小時(shí)的鏈球菌培養(yǎng)物制備的制劑配成濃度0.5％的專用培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)病毒72小時(shí)。上述實(shí)施例為本發(fā)明較佳的實(shí)施方式，但本發(fā)明的實(shí)施方式并不受上述實(shí)施例的限制，其他的任何未背離本發(fā)明的精神實(shí)質(zhì)與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡(jiǎn)化，均應(yīng)為等效的置換方式，都包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。當(dāng)前第1頁1 2 3