本發(fā)明屬于分子遺傳學(xué)領(lǐng)域，涉及以綿羊的功能基因的單核苷酸多態(tài)性(SNP)作為分子遺傳標(biāo)記，特別涉及綿羊PCNP基因的單核苷酸多態(tài)性及其檢測(cè)方法。

背景技術(shù)：

在綿羊育種中，人們期望通過(guò)對(duì)繁殖性狀密切相關(guān)，并且與數(shù)量性狀緊密連鎖的DNA標(biāo)記的選擇，達(dá)到早期選種和提高育種值準(zhǔn)確性的目的，從而在畜禽育種中獲得更大的遺傳進(jìn)展。

分子育種，即分子標(biāo)記輔助選擇育種(Molecular Mark-Assist Selection,MAS)，該技術(shù)是借助DNA分子標(biāo)記對(duì)遺傳資源或育種材料進(jìn)行選擇，對(duì)畜禽的綜合性狀進(jìn)行品種改良，它是利用現(xiàn)代分子生物學(xué)和傳統(tǒng)遺傳育種相結(jié)合的方法，進(jìn)行新品種選育。

基因多態(tài)性是指不同物種或者同一物種內(nèi)的不同個(gè)體間基因組序列的差異，這些差異是由于染色體中DNA等位基因中核苷酸改變引起，主要是包括堿基的替換、插入、缺失以及重復(fù)序列拷貝數(shù)的變化。

單核苷酸多態(tài)性(Single Nucleotide Polymorphism,SNP)是由美國(guó)麻省理工學(xué)院的人類基因組研究中心的學(xué)者Lander(1996)提出的一類遺傳標(biāo)記系統(tǒng)，就是指基因組DNA序列中由于單個(gè)核苷酸(A/T/C/G)的替換而引起的多態(tài)性。SNP作為新的遺傳標(biāo)記已廣泛應(yīng)用于基因定位、克隆、遺傳育種及多樣性的研究。SNP是基因組中存在的一種數(shù)量非常豐富的變異形式，占人類基因組中遺傳多態(tài)性的90％以上。SNP與罕見(jiàn)的變異不同，通常在種群中頻率等于或小于1％的此種變異被稱為突變，而只有頻率大于1％時(shí)才被稱為單核苷酸多態(tài)性。它的變異形式有：顛換、轉(zhuǎn)換、插入和缺失等，主要由單個(gè)堿基的轉(zhuǎn)換或者顛換所引起。具有轉(zhuǎn)換型的堿基變異的SNPs約占2/3。

根據(jù)基因組中單核苷酸多態(tài)性產(chǎn)生的位置，可分為以下3類：基因編碼區(qū)單核苷酸多態(tài)性(Coding-region SNPs,cSNPs)、基因周邊單核苷酸多態(tài)性(Perigenic SNPs,pSNPs)以及基因間單核苷酸多態(tài)性(Intergenic SNPs,iSNPs)。

研究表明，位于編碼區(qū)內(nèi)的cSNP比較少。基因編碼區(qū)內(nèi)的cSNP又可分為2種：一種是編碼區(qū)內(nèi)的同義cSNP(Synonymous cSNP)，即SNP所致編碼序列的改變并不會(huì)影響其所翻譯的蛋白質(zhì)中氨基酸序列的改變；另一種是編碼區(qū)內(nèi)的非同義cSNP(Non-Synonymous cSNP)，即堿基序列的改變將導(dǎo)致編碼氨基酸的改變，從而導(dǎo)致蛋白質(zhì)中氨基酸序列的改變，可能最終影響到蛋白質(zhì)的功能。

由于SNPs是二等位基因分子標(biāo)記，所以，理論上在一個(gè)二倍體生物群體中，SNPs可能是由2個(gè)、3個(gè)或4個(gè)等位基因構(gòu)成，但實(shí)際上3個(gè)或4個(gè)等位基因的SNPs很罕見(jiàn)，故SNPs通常被簡(jiǎn)單地稱為二等位基因分子標(biāo)記。目前，主要采用幾種不同的路線來(lái)發(fā)現(xiàn)SNPs：即DNA序列測(cè)定方法、聚合酶鏈反應(yīng)—單鏈構(gòu)象多態(tài)(Polymerase Chain Reaction-Single Strand Conformation Polymorphism，PCR-SSCP)與DNA測(cè)序結(jié)合法、等位特異性PCR(Allele Specific PCR，AS-PCR)方法、引物延伸法和寡核苷酸連接反應(yīng)等。在這些SNP檢測(cè)技術(shù)中，DNA序列測(cè)定法是最為準(zhǔn)確的SNP檢測(cè)方法，但是，其檢測(cè)費(fèi)用昂貴，且需要有DNA測(cè)序儀等大型儀器，同時(shí)，在測(cè)序過(guò)程中需要非常熟練的技術(shù)人員和經(jīng)驗(yàn)，所以，DNA序列測(cè)定法不是一種應(yīng)用于生產(chǎn)實(shí)際的理想SNP檢測(cè)方法；當(dāng)然，利用PCR-SSCP與DNA測(cè)序結(jié)合法檢測(cè)SNP可以適當(dāng)降低檢測(cè)費(fèi)用，但是，PCR-SSCP的實(shí)驗(yàn)過(guò)程比較長(zhǎng)，操作比較繁瑣，且實(shí)驗(yàn)過(guò)程中存在假陽(yáng)性問(wèn)題，所以，也并非理想的SNP檢測(cè)手段；AS-PCR方法作為一種新型的SNP檢測(cè)方法，在未來(lái)的應(yīng)用領(lǐng)域中具有非常廣闊的前景，但是，該方法需要設(shè)計(jì)特別的引物，且只能針對(duì)特定的基因位點(diǎn)，同時(shí)，檢測(cè)過(guò)程中還存在誤檢的概率，因此，目前不具有普遍應(yīng)用的特點(diǎn)；而引物延伸法和寡核苷酸連接反應(yīng)技術(shù)檢測(cè)SNP位點(diǎn)，需要平板讀數(shù)儀、基因芯片、微球陣列技術(shù)和質(zhì)譜儀等檢測(cè)平臺(tái)，對(duì)于一般的分子實(shí)驗(yàn)室來(lái)說(shuō)可實(shí)施性不強(qiáng)。

限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性-聚合酶鏈反應(yīng)(Restriction Fragment Length Polymorphism-Polymerase Chain Reaction，RFLP-PCR)方法是一種檢測(cè)SNP的有效技術(shù)，在發(fā)現(xiàn)SNP位點(diǎn)后設(shè)計(jì)上下游引物用限制性內(nèi)切酶進(jìn)行切割，然后進(jìn)行瓊脂糖、聚丙烯凝膠電泳分析，就能準(zhǔn)確地鑒別SNP位點(diǎn)。RFLP-PCR方法不僅具有DNA測(cè)序法的準(zhǔn)確性，又克服了費(fèi)用昂貴、繁瑣操作、假陽(yáng)性的缺點(diǎn)，而且所檢測(cè)的序列位點(diǎn)無(wú)特殊性要求。

PCNP(PEST-containing nuclear protein)是一類定位于細(xì)胞核并含有PEST序列(即富含脯氨酸(P)、谷氨酸(E)、絲氨酸(S)和蘇氨酸(T)四種氨基酸的蛋白。

通過(guò)比對(duì)多個(gè)物種的序列發(fā)現(xiàn)，PCNP基因核酸序列的同源性較高，尤其在哺乳動(dòng)物中均達(dá)到94％以上，都比較保守，說(shuō)明在生物體中該蛋白應(yīng)具有重要的作用及功能。在人類基因組中PCNP基因被定位在3q12.3，編碼178個(gè)氨基，對(duì)其理化性質(zhì)進(jìn)行分析后顯示其是由18種氨基酸組成的一種半衰期較短且不穩(wěn)定的親水性蛋白。PCNP很可能在細(xì)胞周期調(diào)控與腫瘤發(fā)生過(guò)程中發(fā)揮作用，編碼PCNP的基因所在的3號(hào)染色體含有趨化因子受體(CKR)基因簇和多種人類癌癥相關(guān)基因位點(diǎn)，關(guān)鍵腫瘤抑制基因如凋亡調(diào)控因子RASSF1、細(xì)胞移調(diào)控因子HYAL1、血管生成抑制因子SEMA3B也都在3號(hào)染色體，馬凡綜合征、卟啉癥、Von Hippel-Lindau綜合癥、成骨不全癥等遺傳病也與3號(hào)染色體相關(guān)。

國(guó)內(nèi)外目前關(guān)于PCNP的研究還比較少。朱江木研究發(fā)現(xiàn)PCNP的過(guò)表達(dá)能顯著促進(jìn)小鼠骨骼肌細(xì)胞C2C12細(xì)胞生長(zhǎng)，PCNP可能參與了肌細(xì)胞的周期調(diào)控，對(duì)肌細(xì)胞生長(zhǎng)有調(diào)控作用，對(duì)肌細(xì)胞的功能也有影響。孫穎川研究發(fā)現(xiàn)在類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者外周血中PCNP在基因水平和蛋白水平的表達(dá)增高，類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎病情的輕重與PCNP的表達(dá)量正相關(guān)。在類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的發(fā)病中，該基因的表達(dá)變化和病人的病情密切相關(guān)，PCNP有可能成為臨床診斷類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的檢測(cè)指標(biāo)，也可作為疾病病情發(fā)展、預(yù)后的參考指標(biāo)，亦可能是潛在的分子治療靶點(diǎn)。通過(guò)mRNA差異顯示技術(shù)獲得屬于PCNP基因的表達(dá)量差異片段GW360093，在不同繁殖力山羊的卵巢組織中存在表達(dá)量差異，真正影響山羊繁殖性狀差異的是該基因表達(dá)產(chǎn)物的多少。

PCNP在綿羊上被準(zhǔn)確定位到1號(hào)染色體上，包括5個(gè)外顯子。Genomic的登錄號(hào)(NC_019458.1)，predicted mRNA登錄號(hào)XM_012189341.1，mRNA全長(zhǎng)為712bp，該基因的CDS序列全長(zhǎng)為537bp(7-543)，可以編碼179個(gè)氨基酸。針對(duì)綿羊PCNP的研究還很少，國(guó)內(nèi)外鮮見(jiàn)報(bào)道。2013年河北農(nóng)業(yè)大學(xué)邢增喜成功的克隆了山羊PCNP基因的啟動(dòng)子并預(yù)測(cè)了其核心調(diào)控區(qū)，為研究PCNP基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

關(guān)于動(dòng)物PCNP基因遺傳變異的研究國(guó)內(nèi)外多見(jiàn)于人、鼠、豬等動(dòng)物，而未有綿羊PCNP基因遺傳變異或SNP研究的報(bào)道。由于目前中國(guó)湖羊、小尾寒羊PCNP基因遺傳變異領(lǐng)域的研究匱乏，使該基因位點(diǎn)的功能研究及該基因遺傳變異與經(jīng)濟(jì)性狀，如繁殖性狀關(guān)聯(lián)的研究成為空白。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種利用PCR-RFLP檢測(cè)綿羊PCNP基因單核苷酸多態(tài)性的方法及其應(yīng)用，利用PCR-RFLP方法針對(duì)其基因位點(diǎn)上的錯(cuò)義突變可能導(dǎo)致編碼蛋白構(gòu)象發(fā)生變化的單核苷酸多態(tài)性進(jìn)行檢測(cè)，提前淘汰產(chǎn)生錯(cuò)義突變的個(gè)體，加快具有優(yōu)質(zhì)經(jīng)濟(jì)性狀綿羊種群的建立。

本發(fā)明通過(guò)以下技術(shù)方案來(lái)實(shí)現(xiàn)：

綿羊PCNP基因第5019位為G或A的單核苷酸多態(tài)性的檢測(cè)方法為：以包含PCNP基因的待測(cè)綿羊(如湖羊、小尾寒羊等)全基因組DNA為模板，以引物對(duì)P為引物，PCR擴(kuò)增湖羊、小尾寒綿羊PCNP基因；用限制性內(nèi)切酶SPhI消化PCR擴(kuò)增產(chǎn)物之后，再對(duì)酶切后的擴(kuò)增片段進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳；根據(jù)電泳結(jié)果鑒定綿羊PCNP基因第5019位的單核苷酸多態(tài)性；

所述的引物對(duì)P為：

上游引物：5’-AGAATAGCATGGGCAGAA-3’ 18nt；

下游引物：5’-TCATTTCTGTGGGACACC-3’ 18nt。

所述的PCR擴(kuò)增反應(yīng)程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性5min；94℃變性30s，55.3℃退火30s，72℃延伸50s，35個(gè)循環(huán)；72℃延伸10min。

所述的瓊脂糖凝膠電泳為質(zhì)量濃度為1％的瓊脂糖凝膠電泳。

根據(jù)瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果PCNP基因第5019位堿基多態(tài)性為：AA型表現(xiàn)：377bp和309bp；GA型表現(xiàn)：686bp、377bp和309bp；GG型表現(xiàn)：686bp。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下有益的技術(shù)效果：

本發(fā)明利用RFLP-PCR方法對(duì)綿羊PCNP基因第5019位點(diǎn)上的突變可能產(chǎn)生編碼蛋白構(gòu)象發(fā)生變化的單核苷酸多態(tài)性進(jìn)行檢測(cè)，當(dāng)位點(diǎn)由G突變?yōu)锳時(shí)，為G→A的突變，該突變未引起氨基酸的改變，屬于同義突變，使具有重要生理功能的PCNP基因所編碼蛋白的空間二、三級(jí)構(gòu)型發(fā)生變化，以至影響蛋白的生物學(xué)功能。該核苷酸多態(tài)性能夠作為一個(gè)分子遺傳標(biāo)記，利用標(biāo)記位點(diǎn)信息和數(shù)量性狀的表型信息，更準(zhǔn)確估計(jì)動(dòng)物個(gè)體的育種值，提高選擇效率，加快育種進(jìn)展。

本發(fā)明通過(guò)設(shè)計(jì)特定的PCR引物擴(kuò)增片段，能夠用RFLP-PCR方法簡(jiǎn)單、快速、成本低、精確的檢測(cè)上述PCNP基因的單核苷酸的多態(tài)性。

本發(fā)明對(duì)PCNP基因的SNP進(jìn)行了基因分型和基因頻率分析，以及與湖羊、小尾寒羊生長(zhǎng)性狀之間進(jìn)行了關(guān)聯(lián)分析；結(jié)果顯示PCNP基因的核苷酸多態(tài)位點(diǎn)能夠成為分子遺傳輔助育種的標(biāo)記。

本發(fā)明提供的檢測(cè)方法為PCNP基因的SNP與生長(zhǎng)性狀關(guān)系的建立奠定了基礎(chǔ)，以便用于中國(guó)湖羊、小尾寒羊等綿羊品種生長(zhǎng)性狀的標(biāo)記輔助選擇，快速建立遺傳資源優(yōu)良的綿羊種群。

附圖說(shuō)明

圖1為湖羊、小尾寒羊血樣基因組DNA電泳檢測(cè)圖；

圖2為湖羊、小尾寒羊PCNP基因PCR擴(kuò)增的686bp片段的電泳圖；

圖3為湖羊、小尾寒羊PCNP基因686bp PCR產(chǎn)物的SPhI酶切電泳檢測(cè)PCNP基因多態(tài)性的電泳結(jié)果圖；泳道1,2：GG基因型個(gè)體(686bp)；泳道3,4：AA基因型個(gè)體(377bp，309bp)；泳道5,6：GA基因型個(gè)體(686bp，377bp和309bp)；M：Marker(2000bp，1000bp，750bp，250bp，100bp)；

圖4為湖羊、小尾寒羊PCNP基因5019位SNP的不同基因型測(cè)序峰圖，其中，a對(duì)應(yīng)GG基因型，b對(duì)應(yīng)AA基因型，c對(duì)應(yīng)GA基因型。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合附圖和實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明，所述實(shí)施例是對(duì)本發(fā)明的解釋，而不是限定。

本發(fā)明以PCNP基因保守序列設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增PCNP基因第2外顯子686bp片段，以湖羊、小尾寒羊基因組為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)測(cè)序后尋找該擴(kuò)增片段的單核苷酸多態(tài)；針對(duì)發(fā)現(xiàn)的單核苷酸多態(tài)進(jìn)行性狀關(guān)聯(lián)性分析，并提供其檢測(cè)方法，使得PCNP基因的核苷酸多態(tài)性成為一種能夠快速、方便檢測(cè)的分子遺傳標(biāo)記，為加快建立具有優(yōu)質(zhì)經(jīng)濟(jì)性狀的湖羊、小尾寒羊等綿羊種群提供依據(jù)。

a、綿羊PCNP基因多態(tài)性的檢測(cè)

1、綿羊血樣的采集及處理

取湖羊、小尾寒羊血樣10mL，加入0.5mol/L的EDTA 500μL抗凝，緩慢顛倒3次后放入冰盒，-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

本發(fā)明采用湖羊、小尾寒羊品種，具體如表1所示。

表1 綿羊樣品來(lái)源表

2、血樣基因組DNA的提取

(1)冰凍的血樣在室溫水浴中融化；

(2)將1mL全血轉(zhuǎn)入一個(gè)無(wú)菌的2mL離心管中；

(3)加入等體積(1mL)的PBS緩沖液，溫和搖動(dòng)15-20min；

(4)4℃12000*g離心10min；

(5)用移液槍棄上清，重復(fù)步驟3、4至上清液透明，沉淀白色；

(6)離心管中加DNA提取液650-750μL，溫和搖動(dòng)使細(xì)胞沉淀懸浮；

(7)37℃水浴1h；(可省略)

(8)加入蛋白酶K 3μL(終濃度為60μg/mL)，混勻；

(9)在恒溫水浴箱中55℃溫育過(guò)夜(16h左右)，至細(xì)胞沉淀物被完全消化，溶液澄清；

(10)反應(yīng)液冷卻至室溫，加入1倍體積(800μL-1mL)的Tris飽和酚，放置冰上溫和搖動(dòng)15min；

(11)4℃，12000g離心10min；

(12)將上層水相用移液槍移到另一滅菌離心管中；

(13)加入0.5倍體積(0.5mL)的酚和0.5倍(0.5mL)的氯仿，放置冰上溫和搖動(dòng)15min；

(14)4℃，12000g離心10min；

(15)將上層水相用移液槍移到另一滅菌離心管中；

(16)加入1倍體積(1mL)的氯仿，放置冰上溫和搖動(dòng)15min；

(17)4℃，12000g離心10min；

(18)將上層水相用移液槍移到另一滅菌離心管中；

(19)加入2倍體積的預(yù)冷無(wú)水乙醇(-20℃)，輕輕口底搖晃多次至DNA析出，然后-20℃放置30min；

(20)4℃，12000g離心10min；棄上清液；

(21)加入70％乙醇1mL，溫和搖動(dòng)10min；

(22)4℃，12000g離心10min，棄乙醇，重復(fù)漂洗一次；

(23)真空干燥或室溫下使乙醇揮發(fā)干凈；

(24)根據(jù)DNA的量，加入超純水100-300μL，4℃保存至DNA完全溶解，分光光度計(jì)測(cè)定濃度后，-80℃保存。

3、DNA池的構(gòu)建

(1)1％瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)

選部分DNA樣品進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，選擇DNA樣品條帶均一、無(wú)拖尾、無(wú)降解的樣品進(jìn)行DNA池的構(gòu)建。

(2)OD值測(cè)定

用紫外光光度計(jì)測(cè)定DNA樣品在260nm、280nm處的OD值。計(jì)算DNA含量和OD₂₆₀/OD₂₈₀的比值。如OD₂₆₀/OD₂₈₀比值小于1.6，說(shuō)明樣品中含有較多的蛋白質(zhì)或酚，則應(yīng)進(jìn)行純化；若比值大于1.8，則應(yīng)該考慮去除RNA純化。

DNA濃度(ng/μL)＝50×OD₂₆₀值×稀釋倍數(shù)

(3)品種DNA池的構(gòu)建

DNA檢測(cè)完畢后，取出一定的量稀釋至50ng/μL，然后從湖羊、小尾寒羊50個(gè)濃度為50ng/μL DNA樣品中取10μL混合構(gòu)建成品種DNA池；

湖羊、小尾寒羊血樣基因組DNA的檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)圖1，從圖中可以看出湖羊、小尾寒羊基因組DNA的質(zhì)量非常高。

4、PCR擴(kuò)增

以綿羊DNA池為模版，用設(shè)計(jì)的引物對(duì)P進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR總反應(yīng)體系為25.3μL，見(jiàn)表2；PCR總反應(yīng)程序，見(jiàn)表3。

表2 PCR反應(yīng)體系

引物對(duì)P：

上游引物：5’-AGAATAGCATGGGCAGAA-3’ 18nt；

下游引物：5’-TCATTTCTGTGGGACACC-3’ 18nt

表3 引物最佳PCR反應(yīng)程序

5、PCR產(chǎn)物純化和測(cè)序

PCR擴(kuò)增完成之后進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，電泳結(jié)果如圖2所示，可以清楚看到686bp的條帶；然后進(jìn)行PCR產(chǎn)物的切膠回收及純化：在紫外燈下從瓊脂糖凝膠上切下含目的片段的凝膠，放入1.5mL離心管中，然后用PCR產(chǎn)物回收純化試劑盒(北京天根生物公司)純化PCR產(chǎn)物，按照試劑盒說(shuō)明書操作，具體步驟如下：

(1)首先向吸附柱中加入500μL平衡液BL，12000r/min離心1min，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱重新放回收集管中。

(2)將單一的目的DNA條帶從瓊脂糖凝膠中切下放入干凈的離心管中，稱取重量。

(3)向膠塊中加入等體積溶液PC，60℃水浴放置10min左右，其間不斷溫和地上下翻轉(zhuǎn)離心管，以確保膠塊充分溶解。

(4)將上一步所得溶液加入一個(gè)吸附柱中，12000r/min離心1min，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱重新放入收集管中。

(5)向吸附柱中加入700μL漂洗液，12000r/min離心1min，倒掉廢液，將吸附柱重新放入收集管中。

(6)向吸附柱中加入500μL漂洗液，12000r/min離心1min，倒掉廢液，將離心吸附柱放入收集管中，12000r/min離心2min，盡量除去漂洗液。將吸附柱置于室溫或50℃溫箱數(shù)分鐘，徹底晾干。

(7)將吸附柱放到一個(gè)干凈的離心管中，向吸附膜中間位置懸空滴加適量的洗脫緩沖液，室溫放置2分鐘。12000r/min離心1min收集DNA溶液。

(8)為了提高DNA的回收量，可將離心得到的溶液重新加回離心吸附柱中，重復(fù)步驟7。

把以湖羊、小尾寒羊DNA池為模板的PCR純化產(chǎn)物送上海生物工程有限公司進(jìn)行雙向測(cè)序。湖羊、小尾寒羊PCNP基因目的片段686bp的測(cè)序結(jié)果如圖4所示。

對(duì)測(cè)序峰圖進(jìn)行分析，其中在同一位點(diǎn)有兩個(gè)不同峰的是發(fā)生了單核苷酸突變；位于湖羊、小尾寒羊PCNP基因的第5019位出現(xiàn)了G、A兩種檢測(cè)結(jié)果，即為篩查到的湖羊、小尾寒羊PCNP基因的SNP多態(tài)性，該位點(diǎn)是為G或A的堿基多態(tài)性。

b、綿羊PCNP基因G>A突變多態(tài)性的RFLP-PCR檢測(cè)

由于篩查到的堿基多態(tài)性為自然酶切位點(diǎn)，能被常用的內(nèi)切酶進(jìn)行PCR-RFLP來(lái)鑒定。當(dāng)湖羊、小尾寒羊的PCNP基因第5019位未發(fā)生G>A突變時(shí)，即為突變前G，利用引物對(duì)P擴(kuò)增的PCNP基因序列GCATGC，為SPhI的限制性內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)；可直接通過(guò)SPhI對(duì)目的片段的酶切進(jìn)行基因分型。

1、RFLP-PCR引物設(shè)計(jì)

參照引物對(duì)P。

上述引物能夠擴(kuò)增湖羊、小尾寒羊PCNP基因2第外顯子686bp片段。

2、RFLP-PCR反應(yīng)條件

PCR產(chǎn)物擴(kuò)增體系和反應(yīng)條件分別如表2和表3所述，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的1％瓊脂糖凝膠電泳圖譜如圖2所示，可以看到設(shè)計(jì)的引物對(duì)P能夠擴(kuò)增686bp的片段。

3、PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的SPhI酶切

(1)酶切體系為：為sphI內(nèi)切酶0.5μL，Buffer B 2μL，ddH₂O 13μL，4μL PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，總計(jì)20μL。

(2)酶切消化條件：37℃恒溫培養(yǎng)箱中消化12～16h。

(3)SPhI消化PCR產(chǎn)物后瓊脂糖凝膠電泳分析

用1.0％的瓊脂糖凝膠，200V電壓電泳18min，核酸染料染色檢測(cè)酶切結(jié)果，用UVP凝膠成像系統(tǒng)(GelDoc-It TS Imaging System)照相分析，并判型、記錄其基因型；

由于PCR-RFLP擴(kuò)增的686bp片段中不包含其它的SPhI酶切識(shí)別位點(diǎn)，當(dāng)PCNP基因第5019位未發(fā)生G>A突變時(shí)，PCR擴(kuò)增的PCNP基因產(chǎn)物被限制性內(nèi)切酶SPhI識(shí)別后，在GCATGC/CGTACG對(duì)擴(kuò)增片段酶切，將擴(kuò)增片段切為2段；而當(dāng)PCNP基因第5019位發(fā)生突變，不能形成新的限制性內(nèi)切酶SPhI酶切識(shí)別位點(diǎn)，擴(kuò)增片段不能被酶切；

由于綿羊?yàn)?倍體動(dòng)物，所以當(dāng)發(fā)生G>A的突變時(shí)，可形成3種不同的基因型，分別為GG、GA、AA，其PCR-RFLP檢測(cè)的凝膠結(jié)果如圖3所示：

其中，GG基因型為野生型，它的兩條DNA鏈的SNP位點(diǎn)均不能被酶切，表現(xiàn)為686bp條帶；發(fā)生突變后的AA基因型的兩條鏈的SNP位點(diǎn)均能被SPhI酶切，表現(xiàn)為377bp和309bp條帶；雜合子GA的兩條鏈中的一條的SNP位點(diǎn)能夠被識(shí)別而另一條不能被識(shí)別，表現(xiàn)為686bp，377bp和309bp條帶，根據(jù)條帶的個(gè)數(shù)和條帶的大小，能夠很清楚的判定是否發(fā)生了點(diǎn)突變，將三種基因型區(qū)分開(kāi)，從而檢測(cè)其SNP多態(tài)性。

(4)不同基因型個(gè)體PCR產(chǎn)物的測(cè)序驗(yàn)證

利用ABI 5019和ABI 3730測(cè)序儀對(duì)不同基因型個(gè)體PCR產(chǎn)物分別進(jìn)行正反雙向測(cè)序；同時(shí)，進(jìn)行SNP位置分析，結(jié)果表明包含686bp、377bp和309bp條帶的雜合子GA基因型個(gè)體其第5019位的測(cè)序圖的確表示為G或A，如圖4c所示，自左向右第5019位為兩個(gè)峰；而GG基因型、AA基因型分別為G、A，分別如圖4a、圖4b所示。

c、不同綿羊群體中PCNP基因第5019位的SNP作為分子標(biāo)記的應(yīng)用

1、群體單核苷酸多態(tài)性的檢測(cè)

利用上述的SNP多態(tài)性檢測(cè)方法對(duì)湖羊、小尾寒羊共計(jì)604份DNA樣品，進(jìn)行SNP多態(tài)性的鑒定；統(tǒng)計(jì)其SNP位點(diǎn)的頻率分布情況。

2、SNP位點(diǎn)的頻率統(tǒng)計(jì)分析

基因型頻率是指一個(gè)群體中某一性狀的某種基因型個(gè)體數(shù)占總個(gè)體數(shù)的比率。P_AA＝N_AA/N，其中P_AA代表某一位點(diǎn)的AA基因型頻率；N_AA表示群體中具有AA基因型的個(gè)體數(shù)；N為檢測(cè)群體的總數(shù)量。

基因頻率是指一個(gè)群體中某一基因數(shù)對(duì)其等位基因總數(shù)的相對(duì)比率。計(jì)算的公式可以寫成：P_A＝(2N_AA+N_Aa1+N_Aa2+……+N_Aan)/2N。式中，P_A表示等位基因A頻率，N_AA表示群體中具有AA基因型的個(gè)體數(shù)量，N_Aai表示群體中具有Aai基因型個(gè)體數(shù)量，a1-an為等位基因A的n個(gè)不同的復(fù)等位基因；統(tǒng)計(jì)結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 湖羊、小尾寒羊PCNP基因第5019位SNP基因頻率分布表

3、基因效應(yīng)的關(guān)聯(lián)分析

基因型數(shù)據(jù)：SPhI識(shí)別的基因型(GG、GA、GA)

繁殖性狀數(shù)據(jù)：第一胎產(chǎn)羔數(shù)

關(guān)聯(lián)分析模型：

利用SAS(9.2)軟件分析基因位點(diǎn)與繁殖性狀(產(chǎn)羔數(shù))的相關(guān)性。先對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行描述性統(tǒng)計(jì)分析，確定是否存在離群值，根據(jù)數(shù)據(jù)特征，利用t分析、方差分析或是多元線性模型分析基因型效應(yīng)。在數(shù)據(jù)處理中，根據(jù)影響產(chǎn)羔數(shù)因素不同，考慮到環(huán)境效應(yīng)、年齡、基因型效應(yīng)及相關(guān)的互作效應(yīng)，采用固定模型進(jìn)行分析，同時(shí)，根據(jù)實(shí)際情況進(jìn)行取舍。完整的模型如下：

Y_ijk＝μ+G_j+E_ijk

其中：Y_ijk為個(gè)體表型記錄；μ為群體均值；G_j為各位點(diǎn)的基因型效應(yīng)；E_ijk為隨機(jī)誤差。

表5 PCNP基因單核苷酸多態(tài)性與綿羊繁殖性狀之間的方差分析

注：具有相同字母肩標(biāo)的平均值間差異不顯著(P>0.05)，具有不同字母肩標(biāo)的平均值間差異顯著(P<0.05)

結(jié)果表明，在綿羊PCNP基因組序列的第5019位單核苷酸多態(tài)位點(diǎn)上的不同基因型與綿羊產(chǎn)羔數(shù)關(guān)聯(lián)分析表明，AA基因的個(gè)體的產(chǎn)羔數(shù)顯著高于GG基因型個(gè)體，見(jiàn)表5。根據(jù)這個(gè)研究結(jié)果，可以通過(guò)選擇，建立基因型為AA純合型綿羊群體，提高其產(chǎn)羔率。

核苷酸序列表

<110> 蘭州大學(xué)

<120> 利用PCR-RFLP檢測(cè)綿羊PCNP基因單核苷酸多態(tài)性的方法及其應(yīng)用

<160> 2

<210> 1

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 1

agaatagcat gggcagaa 18

<210> 2

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 2

tcatttctgt gggacacc 18