本發(fā)明涉及動(dòng)物生物醫(yī)藥工程技術(shù)領(lǐng)域，更具體地，涉及一種可以裂解大腸桿菌及沙門(mén)氏菌的噬菌體裂解酶的制備方法。

背景技術(shù)：

大腸桿菌（Escherichia coli）既是人和動(dòng)物腸道中的一種正常棲息菌，同時(shí)也是一種重要的致病菌。大腸桿菌大致可分為腸道非致病性共生菌株、腸道致病性菌株和腸道外致病性菌株三大類。作為一種人和動(dòng)物常見(jiàn)的致病菌，它可導(dǎo)致腸道感染、尿道感染、全身性感染和其它臨床感染等。其中腸道外致病性菌株可引起嚴(yán)重的腸道外感染，尤其是尿道感染，并且在抗生素耐藥性傳播中扮演重要角色。在大腸桿菌多重耐藥性菌株中，腸道外致病性菌株比例居多。多重耐藥性問(wèn)題的出現(xiàn)，給大腸桿菌感染的防控增添了不少難題。

沙門(mén)氏菌（Salmonella）是革蘭氏陰性腸道菌，是一種重要的食源性疾病的病原，已經(jīng)在世界范圍內(nèi)造成重大的經(jīng)濟(jì)損失并嚴(yán)重威脅到公共衛(wèi)生安全。由沙門(mén)氏菌感染導(dǎo)致的沙門(mén)氏菌病是一種食源性人畜共患病，臨床癥狀包括腸胃炎、菌血癥、傷寒癥和病灶感染等；腸胃炎癥狀可從溫和型腹部不適到嘔吐脫水，甚至出現(xiàn)死亡。人經(jīng)常因?yàn)閿z入被污染的動(dòng)物源食品而感染沙門(mén)氏菌，如攝入被沙門(mén)氏菌污染的雞蛋。在全球范圍內(nèi)，每年由沙門(mén)氏菌感染導(dǎo)致的腸胃炎案例估計(jì)可達(dá)93,800,000例，死亡人數(shù)達(dá)155,000人之多，其中由食物傳播引起的案例占85%左右。

在大腸桿菌耐藥現(xiàn)狀中，β-內(nèi)酰胺類抗生素耐藥問(wèn)題尤為嚴(yán)重。這類菌株的耐藥機(jī)制主要是因?yàn)棣?內(nèi)酰胺酶的存在，該酶能夠降解β-內(nèi)酰胺類抗生素。近年來(lái)，在腸道外致病性菌株中出現(xiàn)了新的β-內(nèi)酰胺酶，如質(zhì)粒介導(dǎo)的AmpC β-內(nèi)酰胺酶、廣譜β-內(nèi)酰胺酶和碳青霉烯酶等。最出名的新型β-內(nèi)酰胺酶于1983年首次被報(bào)道，并被命名為廣譜β-內(nèi)酰胺酶。這類酶能夠降解青霉素類、頭孢菌素類和單環(huán)β-內(nèi)酰胺類抗生素，但不能降解頭霉素和碳青霉烯類抗生素，其活性可被典型的β-內(nèi)酰胺酶抑制劑所抑制。碳青霉烯抗性是最近出現(xiàn)的新問(wèn)題，主要是由質(zhì)粒編碼的碳青霉烯酶所導(dǎo)致的，且目前碳青霉烯抗性主要出現(xiàn)在醫(yī)院的大腸桿菌菌株，給大腸桿菌感染的防治造成不小的難題。

沙門(mén)氏菌耐藥性問(wèn)題也日益嚴(yán)重，多重耐藥菌株層出不窮，對(duì)紅霉素、氨芐青霉素、復(fù)方新諾明、環(huán)丙沙星等的耐藥性均見(jiàn)報(bào)道。規(guī)?；i場(chǎng)的沙門(mén)氏菌耐藥性問(wèn)題也比較嚴(yán)峻，某研究者對(duì)分離自豬場(chǎng)糞樣的沙門(mén)氏菌進(jìn)行耐藥性分析，發(fā)現(xiàn)分離菌株對(duì)四環(huán)素、環(huán)丙沙星、恩諾沙星、阿莫西林、卡那霉素、氟苯尼考和氨芐西林等表現(xiàn)出高度耐藥。目前，多重耐藥菌株的廣泛流行，以及流行菌株不斷產(chǎn)生的對(duì)喹諾酮類、第三代頭孢菌素類等臨床重要抗生素的耐藥性，成為世界范圍內(nèi)新興的棘手問(wèn)題。因此，新型抗菌制劑的研發(fā)顯得極為迫切。

噬菌體廣泛存在于環(huán)境中，是以真菌、細(xì)菌等微生物為宿主的病毒，烈性噬菌體具有高效的殺菌能力。噬菌體在侵染周期的末期合成一種噬菌體裂解酶，裂解酶破壞宿主的細(xì)胞壁，使得宿主細(xì)胞滲透壓失衡并最終破裂而達(dá)到釋放子代噬菌體的目的。噬菌體及其裂解酶對(duì)抗生素耐藥菌同樣具有殺滅作用，通過(guò)基因工程技術(shù)，可以大量地人工合成噬菌體裂解酶。因此，噬菌體及其裂解酶具有巨大的應(yīng)用前景。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是尋求新的可同時(shí)抑制大腸桿菌和沙門(mén)氏菌的抗菌制劑，以期減少和替代抗生素的使用，提供表達(dá)能裂解大腸桿菌及沙門(mén)氏菌的噬菌體重組裂解酶TrxA-lysin的重組大腸桿菌BL21 /pET-32a-lysin的制備方法。

本發(fā)明的第二個(gè)目的是提供上述方法制備得到的重組裂解酶TrxA-lysin。

本發(fā)明的第三個(gè)目的是提供所述重組裂解酶TrxA-lysin用于裂解大腸桿菌和沙門(mén)氏菌。

本發(fā)明的目的是通過(guò)以下技術(shù)方案予以實(shí)現(xiàn)的：

一種可以裂解大腸桿菌及沙門(mén)氏菌的噬菌體裂解酶的制備方法，包括以下步驟：

S1. 擴(kuò)增噬菌體ECGD1的裂解酶lysin基因；與質(zhì)粒相連，并轉(zhuǎn)入基因工程菌獲得含lysin重組質(zhì)粒的基因工程菌；

S2. 培養(yǎng)所述含lysin重組質(zhì)粒的基因工程菌至菌液的OD值為0.6～0.8，用IPTG誘導(dǎo)含lysin重組質(zhì)粒的基因工程菌，獲得可溶性重組蛋白TrxA-lysin；所述裂解酶lysin基因的序列如SEQ ID NO：1所示。

優(yōu)選地，S1所述裂解酶lysin基因由引物P1和P2擴(kuò)增獲得，所述引物P1和P2的序列如SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3所示。

pET-32a表達(dá)系統(tǒng)具有以下優(yōu)點(diǎn)：屬于原核表達(dá)系統(tǒng)，適用于噬菌體裂解酶基因的表達(dá)，自帶硫氧還原蛋白TrxA基因，可增加外源蛋白的二硫鍵形成，增加目的蛋白的可溶性表達(dá)。

作為一種具體的實(shí)施方式，本發(fā)明設(shè)計(jì)引物，采用PCR的方法獲得可裂解大腸桿菌及沙門(mén)氏菌的噬菌體裂解酶lysin基因。將該基因連接于pET-32a表達(dá)質(zhì)粒中構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒pET-32a-lysin，以ITPG誘導(dǎo)表達(dá)重組蛋白TrxA-lysin。

優(yōu)選地，S2所述IPTG誘導(dǎo)的條件為：IPTG的終濃度為1mM，誘導(dǎo)時(shí)間為2h，誘導(dǎo)溫度為37℃。

作為一種更優(yōu)選地實(shí)施方式，本發(fā)明所述噬菌體裂解酶的制備方法的S1，包括以下步驟：

（1）設(shè)計(jì)引物，利用PCR技術(shù)對(duì)能裂解大腸桿菌及沙門(mén)氏菌的噬菌體ECGD1的裂解酶lysin基因進(jìn)行擴(kuò)增。

（2）將獲得的lysin基因連接至pET-32a并篩選得到重組質(zhì)粒pET-32a-lysin；采用熱激轉(zhuǎn)化法將pET-32a-lysin重組質(zhì)粒導(dǎo)入大腸桿菌BL21中，獲得重組大腸桿菌BL21 /pET-32a-lysin。

優(yōu)選地，（1）所述PCR的反應(yīng)程序?yàn)椋?8℃預(yù)變性3 min；98℃變性10 s，55℃退火10 s，72℃延伸10 s，完成30循環(huán)；72℃后延伸5 min。

優(yōu)選地，（2）所述熱激轉(zhuǎn)化法為：取大腸桿菌BL21感受態(tài)細(xì)胞，加入pET-32a-lysin重組質(zhì)粒，混勻冰浴30 min，于42℃熱激轉(zhuǎn)化90 s后，冰浴2 min，加入LB液體培養(yǎng)基復(fù)蘇30 min，平板篩選陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子。

優(yōu)選地，本發(fā)明所述噬菌體裂解酶的制備方法還包括純化可溶性重組蛋白TrxA-lysin的步驟。

更優(yōu)選地，所述純化可溶性重組蛋白TrxA-lysin的步驟為：離心收集誘導(dǎo)表達(dá)后的BL21/pET-32a-lysin菌體細(xì)胞，洗滌，重懸后過(guò)濾，用Ni NTA Beads裝入層析柱純化重組蛋白TrxA-lysin。

本發(fā)明還提供上述方法獲得的噬菌體裂解酶重組蛋白TrxA-lysin。

本發(fā)明還提供所述噬菌體裂解酶重組蛋白TrxA-lysin在裂解細(xì)菌方面的應(yīng)用。

本發(fā)明還提供所述噬菌體裂解酶重組蛋白TrxA-lysin在制備預(yù)防和/或治療細(xì)菌感染的藥物方面的應(yīng)用。

優(yōu)選地，上述應(yīng)用中，所述細(xì)菌為大腸桿菌和/或沙門(mén)氏菌。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下有益效果：

本發(fā)明提供了一種表達(dá)噬菌體ECGD1裂解酶lysin基因的重組大腸桿菌的制備方法。即采用E.coli BL21/pET-32a大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)，對(duì)噬菌體ECGD1裂解酶lysin基因進(jìn)行了重組表達(dá)，通過(guò)硫鐵還原蛋白TrxA增加目的蛋白二硫鍵的形成和表達(dá)條件的優(yōu)化，成功獲得高活性的可溶性蛋白，蛋白純化無(wú)需經(jīng)過(guò)復(fù)雜的變性復(fù)性過(guò)程。同時(shí)，將誘導(dǎo)后大腸桿菌BL21/pET-32a-lysin重懸液于-80℃和室溫之間凍融3次后，細(xì)菌重懸液變得澄清、粘稠，即通過(guò)簡(jiǎn)單的凍融，可使細(xì)胞破裂并將大部分目的蛋白釋放出來(lái)。本發(fā)明中重組裂解酶粗提物的制備可通過(guò)簡(jiǎn)單的凍融獲得，不僅操作簡(jiǎn)便、成本低廉，而且不易導(dǎo)致目的蛋白變性，適合用于裂解酶的大量制備。

將制備得到的重組蛋白TrxA-lysin用于裂解氯仿預(yù)處理過(guò)的大腸桿菌和沙門(mén)氏菌菌株，發(fā)現(xiàn)TrxA-lysin對(duì)多株大腸桿菌和沙門(mén)氏菌菌株具有裂解作用，即證實(shí)了TrxA-lysin可同時(shí)裂解大腸桿菌和沙門(mén)氏菌。同時(shí)TrxA-lysin的寬裂解譜揭示其在大腸桿菌和沙門(mén)氏菌感染的防控上具有潛在的應(yīng)用價(jià)值。

附圖說(shuō)明

圖1為噬菌體ECGD1電鏡照片（放大49,000倍）。

圖2為噬菌體ECGD1裂解酶lysin基因的PCR擴(kuò)增結(jié)果：M為DL 2 000 DNA Marker；1為陰性對(duì)照；2和3為裂解酶lysin基因的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。

圖3為重組質(zhì)粒pET-32a-lysin的雙酶切鑒定結(jié)果：M1為DL10000 DNA Marker；M2為DL 5 000 DNA Marker；1為重組質(zhì)粒pET-32a-lysin；2為重組質(zhì)粒pET-32a-lysin經(jīng)過(guò)Nco I、Hind III進(jìn)行雙酶切鑒定結(jié)果。

圖4為裂解酶重組蛋白TrxA-lysin的純化結(jié)果：M為蛋白標(biāo)準(zhǔn)分子量；1為BL21/pET-32a誘導(dǎo)4 h的細(xì)菌總蛋白；2和3分別為BL21/pET-32a-lysin誘導(dǎo)2 h的細(xì)菌總蛋白及其菌體凍融上清經(jīng)0.22 μm過(guò)濾后的樣品；4為鎳柱純化后的裂解酶重組蛋白。

圖5為裂解酶重組蛋白TrxA-lysin對(duì)氯仿預(yù)處理過(guò)的DH5α細(xì)胞的裂解效果。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合說(shuō)明書(shū)附圖和具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。這些實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下例實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照本領(lǐng)域常規(guī)條件或按照制造廠商建議的條件。除非另行定義，文中所使用的所有專業(yè)與科學(xué)用語(yǔ)與本領(lǐng)域技術(shù)人員熟悉的意義相同。

實(shí)施例1 含lysin基因的大腸桿菌BL21表達(dá)菌株的構(gòu)建

包括以下步驟：

S1. 重組質(zhì)粒pET-32a-lysin的構(gòu)建

S11. lysin基因的獲得：從生活污水中分離得到了一株可同時(shí)裂解大腸桿菌及沙門(mén)氏菌的噬菌體（命名為ECGD1，其電鏡照片見(jiàn)圖1），大量培養(yǎng)噬菌體后提取該噬菌體的基因組，并進(jìn)行高通量測(cè)序和測(cè)序結(jié)果的拼接和分析。

噬菌體ECGD1基因組的提?。喝?00 μl過(guò)濾除菌后的噬菌體濃縮液，加入DNase I與RNase A至終濃度均為1 μg/ml，37℃消化過(guò)夜（徹底去除宿主菌核酸），80℃滅活15 min（注意：該溫度不能滅活RNase A）；向濃縮液中分別加入24 μl的0.5 mol/L EDTA（終濃度20 mmol/L），1.5 μl的20 mg/mL蛋白酶K（終濃度50 μg/mL），30 μl的10%SDS（終濃度0.5%），56℃水浴1 h；加等體積平衡酚，溫和震蕩1 min，12 000 rpm離心5 min，轉(zhuǎn)移上層水相于新的離心管中；加等體積酚—氯仿—異戊醇（25：24：1），溫和震蕩1 min，12 000 rpm離心5 min，轉(zhuǎn)移上層水相于新離心管中；加等體積異丙醇，-70℃放置3 h；4℃，13 000 rpm離心20 min，緩慢倒掉上清；加入等體積75%冰乙醇，靜置1 min，7 000 g離心1 min，緩慢倒掉乙醇，室溫開(kāi)蓋放置10 min，使乙醇完全揮發(fā)，用適量的去離子水溶解DNA，-20℃保存。

將噬菌體ECGD1全基因序列上傳至GenBank（序列號(hào)為：KU522583.1），通過(guò)序列注釋和比對(duì)獲得了lysin基因，大小為501 bp。根據(jù)該基因序列設(shè)計(jì)引物P1、P2，在上游引物P1中插入限制性內(nèi)切酶Nco I酶切位點(diǎn)，Nco I為含有起始密碼子ATG的融合表達(dá)酶切位點(diǎn)，在其5’端加上4個(gè)保護(hù)堿基CATG。在下游引物P2中插入限制性內(nèi)切酶Hind III的酶切位點(diǎn)，在下游引物5’端加入3個(gè)保護(hù)堿基CCC。lysin基因序列如SEQ ID NO：1所示；合成的P1、P2引物序列如SEQ ID NO：2～3所示；以1 μL噬菌體ECGD1的基因組為模板，加入高保真DNA聚合酶Prime STAR Max（2×） 25 μL，10 μM的引物P1、P2各1 μL，用ddH₂O補(bǔ)至50 μL，反應(yīng)程序?yàn)?8℃預(yù)變性3 min；98℃變性10 s，55℃退火10 s，72℃延伸10 s，完成30循環(huán)；72℃后延伸5 min。PCR反應(yīng)完成，將產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠觀察與回收，可見(jiàn)大小約500 bp的擴(kuò)增條帶，與預(yù)期結(jié)果一致（如圖2）。

S12. 重組質(zhì)粒pET-32a-lysin的構(gòu)建：將S11中回收的PCR產(chǎn)物用Nco I、Hind III進(jìn)行雙酶切處理，膠回收大小約500 bp的條帶；以同樣的方法對(duì)pET-32a空質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切，膠回收大小約5900 bp的條帶。分別取4 μL雙酶切后膠回收的lysin基因完整修飾片段和1 μL雙酶切后膠回收的pET-32a空質(zhì)粒，加入1 μL的T4 DNA連接酶和1 μL 的10 × buffer，用ddH₂O補(bǔ)至10 μL，混勻后置于16℃條件下連接過(guò)夜，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化E.coli DH5α感受態(tài)細(xì)胞，在含有100 μg/mL 氨芐青霉素（Ampicillin）的LB瓊脂培養(yǎng)板中，37℃培養(yǎng)過(guò)夜，然后挑取單個(gè)菌落。將菌落接種于含100 μg/mL 氨芐青霉素（Ampicillin）的LB液體培養(yǎng)基中過(guò)夜培養(yǎng)。PCR鑒定以待檢菌液為模板，加入DNA聚合酶2×EsTaq Master Mix 10 μL，引物P1、P2各0.5 μL，模板0.5 μL，用ddH₂O補(bǔ)至20 μL，PCR反應(yīng)程序?yàn)?5℃預(yù)變性5 min，95℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸1 min，30個(gè)循環(huán)；72℃后延伸10 min。PCR產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)，可見(jiàn)大小約500 bp的擴(kuò)增條帶，與預(yù)期結(jié)果一致（如圖1）。對(duì)檢測(cè)陽(yáng)性的菌液用質(zhì)粒DNA抽提試劑盒進(jìn)行質(zhì)粒抽提，并進(jìn)行雙酶切鑒定和序列測(cè)定，雙酶切后電泳出現(xiàn)約500 bp和5900 bp兩條目的條帶（如圖3），并且測(cè)序鑒定結(jié)果與預(yù)期一致，即獲得了重組質(zhì)粒pET-32a-lysin。

S2. 含lysin基因的大腸桿菌BL21表達(dá)菌株的構(gòu)建

S21. 大腸桿菌BL21感受態(tài)細(xì)胞的制備：將凍存的E.coli BL21于LB平板培養(yǎng)基上劃線復(fù)蘇，挑取單菌落于LB液體培養(yǎng)基中過(guò)夜擴(kuò)大培養(yǎng)。按照1：100的比例將過(guò)夜培養(yǎng)的BL21接種于25 ml新鮮LB液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期，OD_600nm值約為0.6。將培養(yǎng)液轉(zhuǎn)入離心管中，冰上放置10 min，于4℃下3000 g離心10 min。棄去上清，用預(yù)冷的0.05 mol/L的CaCl₂ 溶液10 mL輕輕懸浮細(xì)胞，冰上放置15-30 min后，4℃下3000 g離心10 min。棄去上清，加入4 mL預(yù)冷含15%甘油的0.05 mol/L的CaCl₂ 溶液，輕輕懸浮細(xì)胞，冰上放置幾分鐘，即成感受態(tài)細(xì)胞懸液。

S22. 大腸桿菌BL21的轉(zhuǎn)化及轉(zhuǎn)化子的PCR鑒定：取50 μL大腸桿菌BL21感受態(tài)細(xì)胞，冰浴上融解，加入1 μL pET-32a-lysin重組質(zhì)粒，輕輕混勻；將以上混合物冰浴30 min后放入42℃熱激90 s，迅速將混合物冰浴3 min，加入100μL的LB液體培養(yǎng)基，于37℃，140 rpm的培養(yǎng)條件培養(yǎng)45 min。將培養(yǎng)后的菌液均勻涂布于含100 μg/mL 氨芐青霉素（Ampicillin）的LB固體培養(yǎng)基中，于37℃培養(yǎng)過(guò)夜，挑取單菌落。將菌落接種于含100 μg/mL 氨芐青霉素（Ampicillin）的LB液體培養(yǎng)基中過(guò)夜培養(yǎng)。PCR鑒定以待檢菌液為模板，加入DNA聚合酶2×EsTaq Master Mix 10 μL，引物P1、P2各0.5 μL，模板0.5 μL，用ddH₂O補(bǔ)至20 μL，PCR反應(yīng)程序?yàn)?5℃預(yù)變性5 min，95℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸1 min，30個(gè)循環(huán)；72℃后延伸10 min。。PCR產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)，可見(jiàn)大小約500 bp的擴(kuò)增條帶。

S3. 含lysin基因的E.coli BL21/pET-32a-lysin重組表達(dá)菌誘導(dǎo)表達(dá)過(guò)程：

首先是最佳誘導(dǎo)時(shí)間的確定，將PCR鑒定為陽(yáng)性的BL21/pET-32a-lysin劃線培養(yǎng)過(guò)夜；挑取單菌落接種于3 mL LA液體培養(yǎng)基中，37℃，220 rpm培養(yǎng)10 h，取出菌液，置4℃冰箱過(guò)夜；按1%體積比例將上述菌液接種于3 mL LA液體培養(yǎng)基，37℃，220 rpm振搖培養(yǎng)；當(dāng)OD600為0.6～0.8時(shí)，加入終濃度為1 mmol/L IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。取誘導(dǎo)不同時(shí)間的菌液，12,000 rpm離心2 min，去上清，細(xì)菌沉淀中加100 μL 1×SDS上樣緩沖液，沸水中煮5 min左右，12,000 rpm離心2 min，取上清進(jìn)行SDS-PAGE電泳檢測(cè)最佳誘導(dǎo)時(shí)間。同時(shí)，設(shè)立pET-32a空質(zhì)粒在BL21中的誘導(dǎo)表達(dá)菌液作為對(duì)照。上樣前，將凝膠放進(jìn)垂直電泳槽，將電壓設(shè)置為80 V進(jìn)行預(yù)電泳30 min以消除凝膠中未聚合物質(zhì)的影響；上樣后設(shè)定電壓為80 V，待溴酚藍(lán)染料壓成一條水平的直線，即將進(jìn)入分離膠時(shí)將電壓升高至160 V；染料接近凝膠底部時(shí)停止電泳。取下凝膠，于水平搖床上用考馬斯亮藍(lán)染色液染色1 h左右，再用脫色液進(jìn)行脫色，期間更換脫色液，脫色至蛋白區(qū)帶清晰為止，用凝膠成像系統(tǒng)對(duì)凝膠進(jìn)行照相。

結(jié)果顯示最佳誘導(dǎo)時(shí)間為2 h。利用上述確定的最佳誘導(dǎo)時(shí)間，進(jìn)行目的蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)。離心收集誘導(dǎo)后的菌體，用1 mL PBS重懸后，在-80℃和室溫之間反復(fù)凍融3次，4℃條件下10,000 rpm離心2 min，取上清液，加入等體積的2×SDS上樣緩沖液，沸水中煮5 min左右，12,000 rpm離心2 min，取上清進(jìn)行SDS-PAGE電泳檢測(cè)重組蛋白的表達(dá)形式，結(jié)果顯示目的蛋白主要為可溶性表達(dá)。

S4.重組蛋白TrxA-lysin純化過(guò)程：離心收集誘導(dǎo)表達(dá)后的BL21/pET-32a-lysin菌體細(xì)胞，用PBS洗滌兩次。按照菌體：Lysis buffer = 1：10（W/V）將菌體懸浮起來(lái)，于-80℃和室溫之間反復(fù)凍融3次，4℃條件下10,000 rpm離心20 min，取上清液，并用0.22 μm濾膜過(guò)濾，收集濾液，用于目的蛋白的純化。

將Ni NTA Beads裝入合適的層析柱，用5倍柱體積的Lysis buffer平衡柱子，使填料與目的蛋白處于相同的緩沖體系下，起到保護(hù)蛋白的作用。將樣品加到平衡好的Ni NTA Beads中（保證目的蛋白與Ni²⁺充分接觸，提高目的蛋白的回收率），收集流出液，用于SDS-PAGE分析蛋白質(zhì)的結(jié)合情況。用10～15倍柱體積的Wash buffer進(jìn)行清洗，去除非特異性吸附的雜蛋白，收集洗雜液。使用5～10倍柱體積的Elution buffer洗脫柱子，收集洗脫液，即目的蛋白組分。利用10 kDa超濾離心管對(duì)純化的蛋白進(jìn)行后續(xù)脫鹽及濃縮處理。純化結(jié)果如圖4所示。

實(shí)施例2 重組蛋白TrxA-lysin的活性檢測(cè)

包括以下步驟：

S1. 用重組蛋白TrxA-lysin裂解氯仿預(yù)處理過(guò)的DH5α：按1%比例將待測(cè)菌株接種于LB培養(yǎng)基中，過(guò)夜培養(yǎng)，菌液中加入終濃度為5%的氯仿，振蕩培養(yǎng)15 min，離心收集菌體，并用去離子水清洗兩次，-80℃保存?zhèn)溆?。測(cè)定活性之前，細(xì)菌沉淀用50 mmol/L的Tris-HCl（PH 8.2，含0.1% Triton X-100）重懸。將10 μL的裂解酶溶液（重組蛋白TrxA-lysin溶液）加入到90 μL細(xì)菌重懸液中，室溫靜置至裂解效果明顯，測(cè)定OD₄₅₀。試驗(yàn)設(shè)置三個(gè)重復(fù)，且將Tris-HCl緩沖液處理作為陰性對(duì)照。由于噬菌體ECGD1能裂解大腸桿菌基因工程菌株DH5α，因此先用DH5α作為待測(cè)菌株檢測(cè)重組裂解酶TrxA-lysin的裂解活性。利用氯仿預(yù)處理的濁度法檢測(cè)重組裂解酶TrxA-lysin的裂解活性，發(fā)現(xiàn)菌液在TrxA-lysin的作用下迅速變得澄清，OD₄₅₀在10 min內(nèi)降低了0.79（圖5），說(shuō)明本試驗(yàn)表達(dá)的TrxA-lysin具有裂解活性。

S2. 多粘菌素B與重組蛋白TrxA-lysin聯(lián)用裂解活菌：該試驗(yàn)分為兩組，包括多粘菌素B與重組蛋白協(xié)同作用組和多粘菌素B對(duì)照組。協(xié)同作用組試驗(yàn)處理大致為，用2倍倍比稀釋法制備含多粘菌素B終濃度為2¹⁰、2⁹、2⁸、2⁷……2^-4、2^-5 μg/mL的LB培養(yǎng)基（每個(gè)梯度3 mL），往每個(gè)稀釋梯度添加100 μL重組蛋白TrxA-lysin溶液，再按1%比例接種大腸桿菌DH5α，37℃振蕩培養(yǎng)過(guò)夜。多粘菌素B對(duì)照組處理同上，但是不添加重組蛋白TrxA-lysin溶液。結(jié)果顯示，多粘菌素B對(duì)照組中，多粘菌素B對(duì)DH5α最低抑菌濃度為2 μg/mL；裂解酶TrxA-lysin與多粘菌素B協(xié)同作用組中，多粘菌素B對(duì)DH5α最低抑菌濃度為1 μg/mL。即裂解酶TrxA-lysin的存在降低了多粘菌素B的最低抑菌濃度，從而證明這兩者存在協(xié)同抑菌效果。

S3. 重組蛋白TrxA-lysin裂解譜的測(cè)定：利用S1所述的氯仿預(yù)處理的方法檢測(cè)裂解酶重組蛋白對(duì)測(cè)試菌株的裂解活性，觀察細(xì)菌裂解效果及其OD₄₅₀值變化。測(cè)試菌株包括大腸桿菌和沙門(mén)氏菌臨床分離菌株，以及大腸桿菌基因工程菌株。裂解酶對(duì)待測(cè)菌株的裂解值=Δ450nm（試驗(yàn)組降低值）—Δ450nm（Tris-HCl對(duì)照組降低值）。相對(duì)裂解活性=裂解酶對(duì)待測(cè)菌株的裂解值/裂解酶對(duì)DH5α的裂解值。以大腸桿菌DH5α為裂解陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)，利用氯仿預(yù)處理的濁度法檢測(cè)裂解酶對(duì)大腸桿菌及沙門(mén)氏菌的裂解活性，結(jié)果顯示，裂解酶對(duì)不同來(lái)源的大腸桿菌及沙門(mén)氏菌均有裂解活性，表現(xiàn)出對(duì)大腸桿菌及沙門(mén)氏菌的廣譜殺菌活性。由相對(duì)裂解活性測(cè)定結(jié)果得知，裂解酶對(duì)大腸桿菌的裂解活性普遍高于沙門(mén)氏菌。

SEQUENCE LISTING

<110> 華南農(nóng)業(yè)大學(xué)

<120> 一種可以裂解大腸桿菌及沙門(mén)氏菌的噬菌體裂解酶的制備方法

<130>

<160> 3

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 501

<212> DNA

<213> 裂解酶lysin基因序列

<400> 1

atggctaaag tagttgatgt gtttgatatg ttacgttttg atgaaggact aaagctaact 60

gtatatactg ataccgaagg gtattggacg gttggtattg gacaccttct gacaaaactt 120

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aaatggtatc gccaaacgcc taatcgcgca gagcgtgtaa ttcaggtgct taaaactgga 480

acattagacg cttataacta a 501

<210> 2

<211> 26

<212> DNA

<213> 引物P1序列

<400> 2

catgccatgg ctaaagtagt tgatgt 26

<210> 3

<211> 29

<212> DNA

<213> 引物P2序列

<400> 3

cccaagcttt tagttataag cgtctaatg 29