本發(fā)明屬于生物學領域，涉及一種動物病原微生物，具體來說是一種用于檢測致病性鉤端螺旋體的熒光PCR引物、探針和試劑盒。

背景技術：

鉤端螺旋體屬于螺旋體門，包括腐生鉤端螺旋體和致病性鉤端螺旋體。由致病性鉤端螺旋體引起的病叫做鉤端螺旋體病，是一種常見的人畜共患傳染病。鉤端螺旋體分為18個血清群，160多個血清型，其中波摩拿群、犬群、黃疸出血群、七日熱群、流感傷寒群和塔拉索夫群是家畜常見的病原菌。我國是受鉤體病危害嚴重的國家之一，自1955年被列入法定報告?zhèn)魅静∫詠恚覈灿媹蟾姘l(fā)病多達240多萬例，其中死亡病例達2萬多例。鉤端螺旋體的宿主范圍很廣，其中對人有潛在危害的包括犬、鼠、豬和牛等。因此，加強對易感動物鉤端螺旋體病的檢測對防治該病十分重要。

鉤端螺旋體病的診斷主要包括臨床診斷和實驗室診斷，但由于鉤體病早期不具有特異性臨床表現(xiàn)且癥狀復雜多樣，極易誤診，因此該病要依靠實驗室診斷。在實驗室檢測方法中分離培養(yǎng)和顯微鏡凝集試驗是金標準，但是培養(yǎng)法時間較長（7-10天），凝集試驗有一定的安全隱患。而酶聯(lián)免疫吸附法在檢測患病動物早期血清中的抗體時，由于抗體滴度較低，不易檢測。隨著分子生物學的發(fā)展，許多新的技術（如 PCR 技術）因其靈敏性高、特異性強、操作簡便且迅速而被廣泛應用于病原菌檢測領域。

技術實現(xiàn)要素：

針對現(xiàn)有技術中的上述技術問題，本發(fā)明提供了一種用于檢測致病性鉤端螺旋體的熒光PCR引物、探針和試劑盒，所述的這種用于檢測致病性鉤端螺旋體的熒光PCR引物、探針和試劑盒要解決現(xiàn)有技術中診斷鉤端螺旋體病時間長和準確度不高的技術問題。

本發(fā)明提供了一種用于檢測致病性鉤端螺旋體的熒光PCR引物，其上游引物的核苷酸序列如SEQ ID No:1、或者SEQ ID No:2 、或者SEQ ID No:3、或者SEQ ID No:4所示；下游引物的核苷酸序列如SEQ ID No:5所示。

本發(fā)明還提供了一種用于檢測致病性鉤端螺旋體的探針，其核苷酸序列如SEQ ID No:6所示。

本發(fā)明還提供了一種用于檢測致病性鉤端螺旋體的試劑盒，其含有EQ ID No:1、或者SEQ ID No:2 、或者SEQ ID No:3、或者SEQ ID No:4所示上游引物序列，核苷酸序列如SEQ ID No:5所示的下游引物序列，還含有核苷酸序列如SEQ ID No:6所示的探針。

進一步的，所述的試劑盒中，還含有熒光定量PCR預混液、ROX 參比染料、去離子水、陽性對照和陰性對照。

進一步的，在采用上述的試劑盒擴增的過程中，其反應體系為：熒光定量PCR預混液10μl，ROX 參比染料 0.2μl，上游引物（10μM）0.4μl，下游引物（10μM）0.4μl，探針（20μM）0.8μl，DNA 2μl，去離子水 6.2μl；反應條件為：95℃ 15秒→（94℃ 5秒→58℃ 10秒→72℃ 15秒）×40。

本發(fā)明對所述試劑盒的反應體系和反應條件進行了優(yōu)化，使得所述引物和探針能夠最大程度的實現(xiàn)對致病性鉤端螺旋體的檢測。

本發(fā)明的方法具有較高的靈敏度，當模板濃度為58個拷貝/μl以上時，均可擴增出特異性產(chǎn)物。

本發(fā)明的方法可對致病性鉤端螺旋體進行特異性檢測。選擇標準菌株黃疸出血56601，犬56603，波摩那56608，七日熱56610，流感傷寒56609，塔拉索夫56635，非致病性鉤體566505和空白對照對本方法進行特異性檢測，結果顯示僅與致病性鉤端螺旋體的核酸有特異性擴增。

本發(fā)明選擇Lip32基因作為檢測對象，僅對致病性鉤端螺旋體有特異性擴增。所提供的引物、探針和試劑盒可用于鉤端螺旋體病的早期診斷，組裝的致病性鉤端螺旋體熒光定量PCR試劑盒的檢測靈敏度為58 copies/μl，可滿足檢測需求。

本發(fā)明在所述引物的存在下，加入上述探針，能夠在熒光PCR儀上進行致病性鉤端螺旋體的熒光定量PCR檢測。

本發(fā)明以構建的陽性重組質(zhì)粒為模板，將模板進行10倍倍比稀釋，進行熒光定量PCR反應，建立熒光定量PCR標準曲線。通過PCR擴增致病性鉤端螺旋體特有的LipL32基因上的片段，可快速、特異地對鉤端螺旋體病進行排查和確診。

本發(fā)明和已有技術相比，其技術進步是顯著的。本發(fā)明提供一種時效性強、靈敏度高、特異性好的檢測致病性鉤端螺旋體的熒光定量PCR檢測方法，包括引物、探針和試劑盒。本發(fā)明選擇了致病性鉤端螺旋體所特有的LipL32基因作為檢測對象，針對該基因設計了特異性的引物和探針，僅能高效擴增致病性鉤端螺旋體，不擴增非致病性鉤端螺旋體。

附圖說明

圖1是致病性鉤端螺旋體熒光定量PCR標準曲線，其中每一條曲線對應一定濃度的DNA模板，從左至右，曲線代表的DNA模板濃度依次為5.75×10⁶，5.75×10⁵，5.75×10⁴，5.75×10³，5.75×10²，5.75×10¹copies/μl。

圖2是致病性鉤端螺旋體熒光定量PCR方法靈敏性實驗，其中每一條曲線對應一定濃度的DNA模板，從左至右，曲線代表的DNA模板濃度依次為5.75×10⁶，5.75×10⁵，5.75×10⁴，5.75×10³，5.75×10²，5.75×10¹copies/μl。

圖3是致病性鉤端螺旋體熒光定量PCR方法特異性實驗，從左至右，曲線代表的樣品依次為致病性鉤端螺旋體波摩那56608，犬56603，黃疸出血56601，塔拉索夫56635，七日熱56610和流感傷寒56609。非致病性鉤體566505和空白對照無擴增曲線。

具體實施方式

以下實施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的保護范圍。

實施例 1引物設計與合成

從GenBank中下載已發(fā)表的Lip32基因序列32個，通過DNAstar軟件進行序列比對，找出鉤端螺旋體保守區(qū)域共6段，結合熒光定量PCR引物和探針設計要求，應用Primer Premier 5.0軟件設計得到1對引物和1條探針，擴增長度150bp。篩選得到的引物通過NCBI中的BLAST進行特異性鑒定，引物、探針如下所示：

上游引物：RCCAGGCGAYGGAGACT

下游引物：GGTTTTGCTTTCGCAGCTTT

探針序列：ATGCCACATTGGTTTGA

R代表A或者G，Y代表C或者T。

實施例2標準質(zhì)粒的構建和制備

本發(fā)明以我國鉤端螺旋體參考標準株黃疸出血群賴型賴株56601（黃疸出血56601購自中國醫(yī)學細菌保藏管理中心，保藏編號為56601，食地址：北京市崇文區(qū)天壇西里2# 郵編：100050電話：010-67095325傳真：010-67057246)

采用Takara細菌DNA提取試劑盒提取DNA。用上述引物擴增Lip32基因，反應體系為50μl，包括：PCR預混液 25μl，上游引物2μl，下游引物2μl，去離子水 19μl，DNA 2μl。反應參數(shù)為：94℃加熱解鏈30s，然后58℃退火30s，72℃延伸 30s，以上步驟共30個循環(huán)，再于72℃延伸10min。

1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增產(chǎn)物，切膠，使用Takara 膠回收試劑盒回收目的片段。用TA克隆試劑盒，將所擴增的目的基因克隆至pMD18-T載體，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α株，篩選陽性克隆并進行PCR鑒定，鑒定為陽性的菌落送上海英駿生物技術有限公司進行測序驗證，將測序驗證正確的單克隆菌擴大培養(yǎng)。

采用Takara質(zhì)粒提取試劑盒對菌液進行質(zhì)粒的抽提與純化，使用紫外分光光度計測定質(zhì)粒濃度，質(zhì)粒拷貝數(shù)=(6.02×10²³)×(ng/ul×10^-9) / (DNA length ×660) = copies/μl。

實施例3熒光定量PCR反應條件的優(yōu)化

以實施例2中所得的DNA為模板，通過對反應體系中引物濃度、探針濃度和退火溫度實驗結果的比較，選擇反應靈敏度高、本底熒光信號低、具有典型 S 型擴增熒光信號曲線、擴增效率接近1的反應體系。優(yōu)化得到的反應體系為：熒光定量PCR預混液 10μl，ROX 參比染料 0.2μl，上游引物（10μM）0.4μl，下游引物（10μM）0.4μl，探針（20μM）0.8μl，DNA 2μl，去離子水6.2μl；優(yōu)化得到的反應條件為：95℃ 15秒→（94℃ 5秒→58℃ 10秒→72℃ 15秒）×40。

實施例4熒光定量PCR標準曲線的建立

用去離子水將實施例2中獲得的定量標準質(zhì)粒進行10倍倍比稀釋，濃度為5.75×10⁶，5.75×10⁵，5.75×10⁴，5.75×10³，5.75×10²，5.75×10¹copies/μl，每個稀釋度做三個重復。用實施例3中最優(yōu)化的體系和反應條件進行。

包括如下步驟：

1）目的基因的擴增

以黃疸出血56601的基因組DNA作為模板，利用權利要求1所述的引物進行PCR擴增，對PCR產(chǎn)物進行純化回收；

2）目的基因的克隆

將步驟1）所擴增的目的基因克隆至pMD18-T載體，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α株，篩選陽性克隆，擴大培養(yǎng)，提取質(zhì)粒。

3）熒光定量PCR檢測

以陽性重組質(zhì)粒為模板，上下游引物為引物，進行熒光定量PCR反應，建立熒光定量PCR標準曲線。

繪制標準曲線（圖1），結果顯示，本檢測方法具有良好的線性關系，標準曲線的相關性參數(shù)R2達到0.997。

實施例5 靈敏度試驗

用去離子水將實施例2中獲得的定量標準質(zhì)粒進行10倍倍比稀釋，濃度為5.75×10⁶，5.75×10⁵，5.75×10⁴，5.75×10³，5.75×10²，5.75×10¹copies/μl，用實施例3中最優(yōu)化的體系和反應條件對本方法進行靈敏度檢測。通過結果可以看出，本方法的檢測靈敏度可達到58個拷貝/μl（圖2）。

實施例6特異性試驗

選擇標準菌株黃疸出血56601，犬56603，波摩那56608，七日熱56610，流感傷寒56609，塔拉索夫56635，非致病性鉤體566505和空白對照對本方法進行特異性檢測，用實施例3中最優(yōu)化的體系和反應條件對本方法進行特異性檢測。通過結果可以看出，本方法僅與致病性鉤端螺旋體的核酸有特異性擴增，圖3中的擴增曲線從左至右依次為致病性鉤端螺旋體波摩那56608，犬56603，黃疸出血56601，塔拉索夫56635，七日熱56610和流感傷寒56609。非致病性鉤體566505和空白對照無擴增曲線。

實施例7 臨床樣品的檢測

2015年10月至2016年10月，共接收上海地區(qū)寵物醫(yī)院送檢的疑似鉤端螺旋體患病犬貓血液和尿樣40份，選用DNA提取試劑盒對樣品進行核酸提取，利用上述方法進行熒光定量PCR檢測。同時，采用鉤體檢測的金標準方法顯微凝集試驗（MAT）進行檢測，對比檢出率，結果顯示，熒光定量PCR方法與MAT方法檢出的陽性樣品符合率為100%。

序列表

<110> 上海市動物疫病預防控制中心

<120> 一種用于檢測致病性鉤端螺旋體的熒光PCR引物、探針及試劑盒

<160> 6

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 17

<212> DNA

<213> 上游引物

<400> 1

accaggcgac ggagact 17

<210> 2

<211> 17

<212> DNA

<213> 上游引物

<400> 2

gccaggcgac ggagact 17

<210> 3

<211> 17

<212> DNA

<213> 上游引物

<400> 3

accaggcgat ggagact 17

<210> 4

<211> 17

<212> DNA

<213> 上游引物

<400> 4

gccaggcgat ggagact 17

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 下游引物

<400> 5

ggttttgctt tcgcagcttt 20

<210> 6

<211> 17

<212> DNA

<213> 探針

<400> 6

atgccacatt ggtttga 17