本發(fā)明涉及一種干細(xì)胞培養(yǎng)的方法，尤其涉及一種臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的培養(yǎng)方法，以實(shí)現(xiàn)體外規(guī)?；囵B(yǎng)。

背景技術(shù)：

根據(jù)美國(guó)國(guó)立衛(wèi)生研究院管理的臨床研究登記系統(tǒng)(Clinicaltrials.gov)數(shù)據(jù)顯示，截止至2016年5月，全球已登記的間充質(zhì)干細(xì)胞臨床研究項(xiàng)目已有612項(xiàng)，其中中國(guó)有125項(xiàng)。世界已注冊(cè)MSCs的臨床試驗(yàn)分析567項(xiàng)，除了用來(lái)促進(jìn)恢復(fù)造血，與造血干細(xì)胞共移植提高白血病和難治性貧血等以外，還用于心腦血管疾病、肝硬化、骨和肌肉衰退性疾病、腦和脊髓神經(jīng)損傷、老年癡呆及紅斑狼瘡和硬皮病等自身免疫性疾病的治療研究，已經(jīng)取得的部分臨床試驗(yàn)結(jié)果令人鼓舞。臍帶制備的間充質(zhì)干細(xì)胞的臨床研究在國(guó)內(nèi)外也已經(jīng)廣泛開(kāi)展，為了獲得足量高效的間充質(zhì)干細(xì)胞滿足即將到來(lái)的臨床治療，臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞規(guī)模化生產(chǎn)已經(jīng)勢(shì)在必行，但受到技術(shù)和科技水平的限制，從臍帶提取的間充質(zhì)干細(xì)胞數(shù)量較少，提取后由于雜細(xì)胞含量高、細(xì)胞的數(shù)量級(jí)小等問(wèn)題無(wú)法直接用于臨床和大量研究，對(duì)于臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的安全高效擴(kuò)增已經(jīng)成為干細(xì)胞行業(yè)的研究熱點(diǎn)。

臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞具有免疫調(diào)控、造血支持、連續(xù)傳代和長(zhǎng)期凍存后仍有自我復(fù)制和多向分化潛能等特點(diǎn)。在特定誘導(dǎo)條件下，可分化為多種組織細(xì)胞，可作為種子細(xì)胞用于組織器官損傷修復(fù)和抗衰老。但有關(guān)間充質(zhì)干細(xì)胞的安全性存在一定的爭(zhēng)議，因此臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞是否具有致瘤型也是目前研究的熱點(diǎn)。

細(xì)胞離體后，失去了神經(jīng)體液的調(diào)節(jié)和細(xì)胞間的相互影響，生活在缺乏動(dòng)態(tài)平衡相對(duì)穩(wěn)定的環(huán)境中，易發(fā)生分化現(xiàn)象減弱；形態(tài)功能趨于單一化或生存一定時(shí)間后凋亡；或發(fā)生轉(zhuǎn)化獲得不死性，可無(wú)限生長(zhǎng)的連續(xù)細(xì)胞系或惡性細(xì)胞系。因此，培養(yǎng)中的細(xì)胞可視為一種在特定的條件下的細(xì)胞群體，它們既保持與體內(nèi)細(xì)胞相同的基本結(jié)構(gòu)和功能，也有一些不同于體內(nèi)細(xì)胞的性狀。實(shí)際上從細(xì)胞一旦被置于體外培養(yǎng)后，這種差異就開(kāi)始發(fā)生，為了減少體外培養(yǎng)的臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞分化、衰退、死亡和癌變等差異的影響，在培養(yǎng)的過(guò)程中應(yīng)當(dāng)嚴(yán)格控制時(shí)間。

根據(jù)國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)報(bào)道臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞體外傳代培養(yǎng)染色體核型正常穩(wěn)定，但也報(bào)道了最早發(fā)生變異的一例為第8代(中國(guó)優(yōu)生與遺傳雜志，2012(10)：42～44)。其制備方法是將臍帶無(wú)菌條件下用PBS沖洗干凈，用剪刀剪細(xì)，放入培養(yǎng)瓶中，加入完全培養(yǎng)基(DMEM/F-12)培養(yǎng)，4天～5天后全量換液，棄去非貼壁細(xì)胞后每3天～4天半量換液，觀察細(xì)胞到80％融合時(shí)，胰酶消化傳代。

國(guó)家863計(jì)劃資助項(xiàng)目有研究采用膠原酶II消化法體外擴(kuò)增3個(gè)代次(P3、P5、P7)臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞，通過(guò)三個(gè)代次細(xì)胞生長(zhǎng)形態(tài)、染色體核型、免疫表型和誘導(dǎo)分化觀察體外連續(xù)傳代培養(yǎng)臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞染色體核型的穩(wěn)定性(軍事醫(yī)學(xué)，2012，36(8)：599～602)。結(jié)果顯示，此法在體外擴(kuò)增P7代內(nèi)的間充質(zhì)干細(xì)胞未發(fā)生染色體結(jié)構(gòu)的異常改變，保持了正常人體二倍體核型，為臨床應(yīng)用臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞提供了遺傳學(xué)的試驗(yàn)依據(jù)。

康寧公司推出HYPERFlask^TM高密度細(xì)胞培養(yǎng)容器，其包括10層大小相同的培養(yǎng)片，每個(gè)培養(yǎng)片都經(jīng)過(guò)康寧CellBIND^TM表層處理，細(xì)胞附著度和生長(zhǎng)速度得到提升，每片還設(shè)有一個(gè)透氣良好的細(xì)胞生長(zhǎng)層，各層空間設(shè)有空氣分隔帶，以達(dá)到最佳的氣體交換效果。10個(gè)生產(chǎn)層被連載一起，組成一個(gè)多層培養(yǎng)容器。該產(chǎn)品尺寸與標(biāo)準(zhǔn)T175培養(yǎng)瓶無(wú)異，采用新型多層設(shè)計(jì)使得培養(yǎng)細(xì)胞的數(shù)量是T175培養(yǎng)瓶的10倍。選用康寧新一代細(xì)胞培養(yǎng)容器，可顯著減少加工和處理耗時(shí)并降低對(duì)空間和廢棄處理的要求。

通過(guò)采用康寧HYPERFlask細(xì)胞培養(yǎng)瓶，能夠擴(kuò)增生產(chǎn)大量用于研究的脂肪干細(xì)胞。脂肪干細(xì)胞在HYPERFlask細(xì)胞培養(yǎng)瓶中很容易擴(kuò)增，并且具有類似成纖維細(xì)胞的形態(tài)，這一點(diǎn)和帶通氣蓋的T175培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)的脂肪干細(xì)胞一樣。培養(yǎng)以后的脂肪干細(xì)胞流式細(xì)胞儀鑒定證明擴(kuò)增后的間充質(zhì)特征和多向分化潛能(中國(guó)醫(yī)藥生物技術(shù)，2015，V10(5)：466～468)。此報(bào)道讓臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞利用HYPERFlask多層培養(yǎng)瓶規(guī)?；瘮U(kuò)增成為一種可能。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種培養(yǎng)臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的方法，以實(shí)現(xiàn)在體外對(duì)間充質(zhì)干細(xì)胞進(jìn)行規(guī)模化培養(yǎng)。

一種體外規(guī)?；囵B(yǎng)臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的方法，包括如下步驟：

步驟一，清洗去大部分臍帶的殘留血液，并保留10v/v％～20v/v％的殘留未凝固血液；

步驟二，將臍帶制成2mm³～5mm³大小組織碎塊，并用0.2w/v％膠原酶II37℃消化，如：2小時(shí)；

步驟三，去除消化后的組織塊，加入洗脫液進(jìn)行離心，離心采用四步法，分別為：首先10分鐘300r/min，然后15分鐘1800r/min，接著10分鐘1000r/min，以及最后10分鐘1000r/min，分離出未提純初代臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞；

步驟四，將5.0×10⁴/cm²～1.0×10⁵/cm²獲得的初代臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞接種于生長(zhǎng)面積為55cm²的培養(yǎng)容器，培養(yǎng)體系為含有10w/v％胎牛血清(FBS)的LG-DMEM培養(yǎng)基；

步驟五，待底層貼壁細(xì)胞融合80％以上后，利用含有胰蛋白酶和EDTA·4Na的Trypsin-EDTA溶液消化，消化分散后的細(xì)胞按2.0×10⁴/cm²～3.0×10⁴/cm²密度傳代接種于生長(zhǎng)面積148cm²培養(yǎng)容器，重復(fù)步驟四和步驟五傳代步驟4次直至獲得第4代細(xì)胞(記為：P4代)將第4代細(xì)胞按0.8×10⁷～1.2×10⁷個(gè)/瓶的濃度接種于HYPERFlask培養(yǎng)容器(康寧公司，美國(guó))中，生長(zhǎng)面積為1720cm²；直至第五代細(xì)胞(記為：P5代)或者第六代細(xì)胞(記為：P6代)數(shù)量級(jí)達(dá)到10⁸以上終止培養(yǎng)；

步驟六，將P5或P6代按照慢凍的規(guī)則降溫并保存(如：ZENOAQ CELLBANKER 2使用手冊(cè)，置氣相液氮MVE罐中)，從制備到凍存時(shí)間嚴(yán)格控制在15天～25天之間；

步驟七，對(duì)生產(chǎn)出的間充質(zhì)干細(xì)胞進(jìn)行流式檢測(cè)CD34、CD45、CD73、CD90、CD105、無(wú)菌檢測(cè)、支原體檢測(cè)和傳染病檢測(cè)，篩選出合格的臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞，建立可供檢索的干細(xì)胞細(xì)胞信息檔案，以備臨床和研究使用。

本發(fā)明的方法，步驟一中，使用緩沖液清洗去大部分臍帶的殘留血液，該緩沖液如：但不僅限于磷酸緩沖鹽溶液(PBS)，含有青霉素10萬(wàn)單位/L和鏈霉素100mg/L。

本發(fā)明技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的有益效果：

與現(xiàn)有臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的小規(guī)模培養(yǎng)方法相比，本發(fā)明提供的體外規(guī)模化培養(yǎng)臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的方法：

按0.8×10⁷～1.2×10⁷個(gè)/瓶的濃度傳代到HYPERFlask細(xì)胞培養(yǎng)容器，根據(jù)細(xì)胞增殖特點(diǎn)、細(xì)胞生長(zhǎng)體積提供生長(zhǎng)最佳濃度，使試劑耗材可控制和臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞制備生產(chǎn)標(biāo)準(zhǔn)化。

臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞從進(jìn)入制備周期到凍存時(shí)間嚴(yán)格控制在15天～25天，保證了臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的生物原性和安全性，可控地獲得優(yōu)質(zhì)的產(chǎn)品。

在臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞P5、P6代終止培養(yǎng)，P5代、P6代細(xì)胞較完整地保存了干細(xì)胞的生物特性，同時(shí)將臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的數(shù)量擴(kuò)增至億以上，臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞在體外連續(xù)傳代培養(yǎng)控制在6代以內(nèi)，以保證擴(kuò)增細(xì)胞的染色體結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，降低分化、衰退、死亡和癌變等的概率。

在臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞P5代、P6代采用康寧公司推出的多層細(xì)胞培養(yǎng)容器，培養(yǎng)面積可達(dá)1720cm²，多層的細(xì)胞培養(yǎng)容器具有透氣性的材料上在維持細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)的同時(shí)可進(jìn)行氣體交換。所有的液體操作可通過(guò)瓶頸連接至所有的培養(yǎng)層，理想的生長(zhǎng)表面采用康寧獨(dú)特的CeIIBIND培養(yǎng)表面，大大的提高了細(xì)胞的吸附性和生長(zhǎng)速度，提高了細(xì)胞的產(chǎn)率。

附圖說(shuō)明

圖1A為實(shí)施例1獲得P1代臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞規(guī)模培養(yǎng)細(xì)胞圖，圖中單個(gè)細(xì)胞呈纖維樣，視野明顯可見(jiàn)雜細(xì)胞；

圖1B為實(shí)施例1獲得P3代臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞規(guī)模培養(yǎng)細(xì)胞圖，圖中單個(gè)細(xì)胞呈纖維樣，整體呈流線型，細(xì)胞體積較P1代有所增大；

圖1C為實(shí)施例1獲得P5代臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞規(guī)模培養(yǎng)細(xì)胞圖，圖中單個(gè)細(xì)胞呈纖維樣，整體呈流線型，細(xì)胞體積較P3代有所增大；

圖2為實(shí)施例4獲得P1、P2、P3、P4和P5代臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的增殖曲線圖，圖中橫軸為細(xì)胞代數(shù)，縱軸為細(xì)胞數(shù)量；樣本1、樣本2和樣本3為三個(gè)平行細(xì)胞數(shù)量樣本隨著傳代變化；

圖3為實(shí)施例5的P5代臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞傳代后生長(zhǎng)曲線，圖中橫軸為時(shí)間，縱軸為細(xì)胞計(jì)數(shù)；

圖4A為實(shí)施例1獲得P5代細(xì)胞制成細(xì)胞懸液進(jìn)行流式細(xì)胞儀檢測(cè)，而得陰性對(duì)照散點(diǎn)圖；

圖4B為實(shí)施例1獲得P5代細(xì)胞制成細(xì)胞懸液進(jìn)行流式細(xì)胞儀檢測(cè)，而得強(qiáng)表達(dá)散點(diǎn)圖；

圖5A為實(shí)施例1獲得P5代細(xì)胞制成細(xì)胞懸液，進(jìn)行流式細(xì)胞儀檢測(cè)而得的CD34、CD45、CD73、CD90和CD105陰性對(duì)照?qǐng)D；

圖5B為實(shí)施例1獲得P5代細(xì)胞制成細(xì)胞懸液，進(jìn)行流式細(xì)胞儀檢測(cè)而得的CD34、CD45、CD73、CD90和CD105強(qiáng)表達(dá)曲線圖。

具體實(shí)施方式

以下結(jié)合附圖詳細(xì)描述本發(fā)明的技術(shù)方案。本發(fā)明實(shí)施例僅用以說(shuō)明本發(fā)明的技術(shù)方案而非限制，盡管參照較佳實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行了詳細(xì)說(shuō)明，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，可以對(duì)發(fā)明的技術(shù)方案進(jìn)行修改或者等同替換，而不脫離本發(fā)明技術(shù)方案的精神和范圍，其均應(yīng)涵蓋在本發(fā)明的權(quán)利要求范圍中。

本發(fā)明以下實(shí)施例所用實(shí)際和儀器詳見(jiàn)如下表1，其它所用的試劑若未經(jīng)說(shuō)明，均購(gòu)自康寧(Corning)公司。

表1

實(shí)施例1

(1)按照國(guó)家規(guī)范采集足月嬰兒臍帶及臍帶血，酒精對(duì)臍帶進(jìn)行消毒；

(2)用新鮮緩沖液(含有1.00v/v％青霉素/鏈霉素)清洗掉大部分殘留血液，保留10v/v％以上的殘留未凝固血液。利用儀器裝置進(jìn)行碎化處理臍帶，獲得1mm³大小組織碎塊在低濃度膠原酶II環(huán)境下消化足夠時(shí)間；

(3)棄消化后殘剩組織塊，加入洗脫液采用四步離心法，分離出未提純?cè)殠чg充質(zhì)干細(xì)胞，離心分離的參數(shù)分別為：300r/min10分鐘、1800r/min15分鐘、1000r/min10分鐘、1000r/min10分鐘；

(4)將獲得的初代臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞計(jì)數(shù)后按5.0×10⁴/cm²～1.0×10⁵/cm²種于生長(zhǎng)面積為55cm²的塑料培養(yǎng)容器，培養(yǎng)體系為含有10％FBS的LG-DMEM；

(5)待底層貼壁細(xì)胞融合80％以上，利用含有胰蛋白酶和EDTA·4Na的Trypsin-EDTA消化，消化分散后的細(xì)胞按2.0×10⁴/cm²-3.0×10⁴/cm密度傳代接種于生長(zhǎng)面積148cm²培養(yǎng)容器，重復(fù)上述10％FBS的LG-DMEM體系培養(yǎng)步驟4次傳代直至P4代；

(6)將P4代細(xì)胞按1.0×10⁷/瓶的濃度接種于HYPERFlask培養(yǎng)容器中，HYPERFlask培養(yǎng)容器生長(zhǎng)面積為1720cm²，直至P5代臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞數(shù)量級(jí)達(dá)到億以上終止培養(yǎng)；

(7)將P5代或者P6代臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞按照慢凍的規(guī)則降溫，置氣態(tài)液氮中保存，從制備到凍存時(shí)間嚴(yán)格控制在15～25天之間；

(8)對(duì)生產(chǎn)出的間充質(zhì)干細(xì)胞進(jìn)行流式檢測(cè)CD34，CD45，CD73，CD90，CD105、無(wú)菌檢測(cè)、支原體檢測(cè)、傳染病檢測(cè)；

(9)篩選出合格臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞，建立可供檢索的干細(xì)胞細(xì)胞信息檔案(參見(jiàn)表2)，以備臨床和研究使用。

表2

實(shí)施例2，將實(shí)施例1中步驟(6)按1.0×10⁷/瓶的濃度接種于HYPERFlask培養(yǎng)容器對(duì)照成按1.25×10⁷/瓶、1.0×10⁷/瓶、0.75×10⁷/瓶、0.5×10⁷/瓶的濃度接種于HYPERFlask培養(yǎng)容器。

實(shí)施例3，將實(shí)施例1中步驟(6)接種于HYPERFlask培養(yǎng)容器對(duì)照成接種于HYPERFlask培養(yǎng)容器和普通細(xì)胞培養(yǎng)容器。

實(shí)施例4，將實(shí)施例1中步驟實(shí)驗(yàn)于三個(gè)臍帶樣本，擴(kuò)增至P5代。

實(shí)施例5，將實(shí)施例1中步驟實(shí)驗(yàn)于三個(gè)臍帶樣本，取P5代細(xì)胞接種，每8小時(shí)計(jì)數(shù)，直至細(xì)胞完全融合后24小時(shí)。

取實(shí)施例1P1代、P3代和P5代細(xì)胞進(jìn)行拍照，各代的細(xì)胞形態(tài)分別參見(jiàn)圖1A、圖1B和圖1C。

取實(shí)施例4的P1、P2、P3、P4和P5代臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的增殖情況進(jìn)行驗(yàn)證(參見(jiàn)圖2)，由圖2可見(jiàn)，隨著傳代代數(shù)的增加，細(xì)胞數(shù)量呈倍數(shù)增加。

取實(shí)施例5的臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞繪制生長(zhǎng)曲線，由圖3可見(jiàn)，細(xì)胞按照2.0×10⁴/cm²～3.0×10⁴/cm傳代，經(jīng)過(guò)短暫的懸浮然后貼壁，隨后度過(guò)24小時(shí)左右的潛伏期，即進(jìn)入大量分裂的指數(shù)生長(zhǎng)期，在細(xì)胞48小時(shí)左右完全融合，進(jìn)入平定期細(xì)胞基本不再分裂。細(xì)胞經(jīng)過(guò)了虛弱潛伏期和旺盛指數(shù)生長(zhǎng)期，在平頂期初消化傳代，無(wú)需額外進(jìn)行更換完全培養(yǎng)基，節(jié)約了培養(yǎng)基。

不同傳代濃度接種于HYPERFlask培養(yǎng)容器性狀對(duì)比

實(shí)施例2細(xì)胞分別按1.25×10⁷/瓶、1.0×10⁷/瓶、0.75×10⁷/瓶、0.5×10⁷/瓶四種濃度進(jìn)行傳代，倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞的貼壁時(shí)間，細(xì)胞形態(tài)，折光性，融合時(shí)間和細(xì)胞活率的差別等詳見(jiàn)表3，接種密度越小，融合時(shí)間越長(zhǎng)，過(guò)長(zhǎng)的融合時(shí)間會(huì)出現(xiàn)邊緣模糊、白色絮狀物、空泡等老化現(xiàn)象。

表3

普通細(xì)胞培養(yǎng)容器與HYPERFlask培養(yǎng)容器特性比較

實(shí)施例3細(xì)胞1.0×10⁷個(gè)分別接種到HYPERFlask培養(yǎng)容器和普通細(xì)胞培養(yǎng)容器(148cm²細(xì)胞培養(yǎng)皿)，普通細(xì)胞培養(yǎng)容器相對(duì)HYPERFlask培養(yǎng)容器需要消耗更多的數(shù)量，消化時(shí)間更長(zhǎng)，酶消耗增加，空間占據(jù)大，均一較性較差，結(jié)果詳見(jiàn)表4。

表4

臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞表面標(biāo)志性抗原檢測(cè)

取實(shí)例一HYPERFlask細(xì)胞培養(yǎng)容器內(nèi)P5代細(xì)胞，制成細(xì)胞懸液，流式細(xì)胞儀檢測(cè)CD34、CD45、CD73、CD90和CD105等5個(gè)表面標(biāo)記物(參見(jiàn)圖4A和圖4B)。用流式分析軟件Flow Jo進(jìn)行分析，P5或P6收獲時(shí)，強(qiáng)表達(dá)標(biāo)記細(xì)胞達(dá)95％以上，不表達(dá)細(xì)胞小于2％(參見(jiàn)圖5A和圖5B)。