本發(fā)明涉及分子生物學(xué)及基因檢測領(lǐng)域，尤其涉及一種I型神經(jīng)纖維瘤病致病基因突變及基于此基因突變的病因?qū)W診斷試劑。

背景技術(shù)：

I型神經(jīng)纖維瘤病(Neurofibromatosis type I,NF1)由von Recklinghausen于1882年首次報(bào)道，故又稱為von Recklinghausen病。I型神經(jīng)纖維瘤病一般為常染色體顯性遺傳，部分為散發(fā)。臨床上主要表現(xiàn)為皮膚咖啡斑、多發(fā)性皮膚軟纖維瘤；非暴露部位(如腋窩、腹股溝)出現(xiàn)的雀斑和虹膜黑色素錯構(gòu)瘤；也可累及多個器官和系統(tǒng)，如眼、骨骼、血管、內(nèi)分泌系統(tǒng)、中樞及外周神經(jīng)系統(tǒng)等，并可伴有智力發(fā)育障礙、先天性發(fā)育不良、極罕見惡變者。

該病由NF1基因發(fā)生突變引起。NF1基因定位于染色體17q11.2，包含57個組成性外顯子和3個可變剪接外顯子，全長283kb，有3個大小為11～13kb的成熟轉(zhuǎn)錄本，編碼相對分子質(zhì)量為327000、由2818個氨基酸組成的神經(jīng)纖維(Neurofibromin)蛋白，大量表達(dá)于神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細(xì)胞、少突膠質(zhì)細(xì)胞、腎上腺細(xì)胞、性腺細(xì)胞和白細(xì)胞。NF1基因是腫瘤抑制基因，不少研究表明NF1基因突變可通過干擾Ras循環(huán)的cAMP信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路從而引發(fā)腫瘤。NF1基因自發(fā)突變率約為1/10000，是人類基因突變率最高的基因位點(diǎn)之一，約50％患者為新突變，至今仍有未明確的突變點(diǎn)，但發(fā)現(xiàn)了一些突變集中區(qū)域。其中外顯子4b、7、10b、13、15、20、28，29，31可能為突變熱點(diǎn)，而32號外顯子突變可能是中國人NF1基因突變熱點(diǎn)區(qū)域之一。目前發(fā)現(xiàn)的基因突變已超過700多種，包括堿基的轉(zhuǎn)換、顛換、插入、缺失、移碼突變、拼接突變及染色體平衡易位等。在這些突變中，約有82％突變造成神經(jīng)纖維蛋白的截短，蛋白的截短對蛋白的功能結(jié)構(gòu)產(chǎn)生重要的影響。

目前，針對I型神經(jīng)纖維瘤病高發(fā)病率檢測的需求日益增加，設(shè)計(jì)研究科學(xué)合理且精準(zhǔn)的檢測試劑盒十分必要。由于NF1基因片段較大，突變情況復(fù)雜，易造成漏檢。而該病不同患者的臨床表現(xiàn)不同，且同一家族的不同患者臨床表現(xiàn)也不同，大大增加了臨床診斷的難度，因此建立快速且準(zhǔn)確的診斷技術(shù)、攻克I型神經(jīng)纖維瘤病的診斷難題，對其臨床治療和科學(xué)研究都具有重要的價值。

但目前所發(fā)現(xiàn)的突變熱點(diǎn)不足以解決臨床上I型神經(jīng)纖維瘤病基因篩查、診斷的難題。尋找新的致病突變，豐富NF1神經(jīng)纖維瘤病突變譜，將為臨床上方便快捷的篩查和診斷I型神經(jīng)纖維瘤病患者提供重要的靶點(diǎn)及理論依據(jù)，這一直是本領(lǐng)域研究人員孜孜不倦的探究領(lǐng)域。

由于NF1基因包含58個組成性外顯子和3個可變剪接外顯子，傳統(tǒng)的針對每一個外顯子的測序分析方法耗時長，每個測序樣本完成檢測一般需六、七天。而其他檢測方法如NGS、FISH或MLPA等，需配備價格昂貴的大型儀器設(shè)備，實(shí)驗(yàn)條件要求高，導(dǎo)致檢測成本大大升高。

另外，NF1基因的突變類型除點(diǎn)突變外，還存在大片斷缺失、一個或多個外顯子的重復(fù)/缺失等多種類型。通過單一方法檢測NF1基因突變易漏檢，這也是目前NF1致病基因突變檢測困擾臨床遺傳診斷人員的一個難題。

綜上所述，尋找對診斷有效的新致病突變，并研制省時、精準(zhǔn)、且實(shí)驗(yàn)條件要求較低的診斷試劑對NF1基因突變?nèi)鏅z測，是解決I型神經(jīng)纖維瘤病診斷難題的根本方法。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

有鑒于此，為攻克現(xiàn)有技術(shù)中的難題，本發(fā)明人經(jīng)過艱辛研究，發(fā)現(xiàn)一種可有效診斷I型神經(jīng)纖維瘤病致病基因的突變，并研制出基于此基因突變的病因?qū)W診斷試劑。該試劑可在短時間內(nèi)獲得診斷結(jié)果，實(shí)驗(yàn)條件要求低，診斷結(jié)果準(zhǔn)確。

本發(fā)明公開一種I型神經(jīng)纖維瘤病致病基因突變，所述突變位于NF1基因第48號外顯子區(qū)域，其編碼第7106位的鳥嘌呤替換為腺嘌呤從而引起第2369位的色氨酸突變?yōu)榻K止密碼子(c.7106G>A，p.W2369X)。

本發(fā)明公開的I型神經(jīng)纖維瘤病致病基因突變與I型神經(jīng)纖維瘤病高度相關(guān)，該突變(c.7106G>A，p.W2369X)使神經(jīng)纖維蛋白截短而失去正常功能，造成常染色體顯性遺傳病的I型神經(jīng)纖維瘤病。

本發(fā)明還提供基于上述I型神經(jīng)纖維瘤病致病基因突變的神經(jīng)纖維瘤病因?qū)W診斷試劑，所述診斷試劑包括點(diǎn)突變分析試劑盒，所述試劑盒包括1)總RNA提取體系試劑盒：被測個體外周靜脈血總RNA提??；2)RNA反轉(zhuǎn)錄及cDNA擴(kuò)增體系試劑盒；3)cDNA測序體系試劑盒；所述cDNA測序體系試劑盒：對反轉(zhuǎn)錄獲得的cDNA以SEQ ID NO.7-16所示五個引物對進(jìn)行PCR擴(kuò)增，再對擴(kuò)增得到的cDNA五個大片段以SEQ ID NO.17-60所示引物對同時進(jìn)行巢式PCR擴(kuò)增并測序，并與原NF1基因編碼DNA序列比對，當(dāng)擴(kuò)增產(chǎn)物中c.7106G>A，p.W2369X突變存在時為I型神經(jīng)纖維瘤病患者。

進(jìn)一步，所述診斷試劑還包括NF1基因外顯子缺失分析試劑盒：以所述反轉(zhuǎn)錄獲得的NF1基因cDNA為模板，以SEQ ID NO.61-70所示引物對分別對NF1的外顯子3、11、25、34、58進(jìn)行實(shí)時熒光定量PCR擴(kuò)增，以2^-ΔΔCt法進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)算得到五個外顯子的相對基因含量，當(dāng)五個外顯子的相對基因含量均在0.5左右時為外顯子缺失攜帶者，并提示NF1基因缺失或部分缺失。

進(jìn)一步，所述診斷試劑還包括NF1全基因大片段缺失分析試劑盒，所述試劑盒包括1)DNA提取體系試劑盒：被測個體外周靜脈血基因組DNA提??；2)基因內(nèi)微衛(wèi)星多態(tài)標(biāo)志分析試劑盒：以所述基因組DNA為模板，以SEQ ID NO.1-6所示的三對引物對27AC28.4、27CAGT、38TG53.0三個多態(tài)性位點(diǎn)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物，當(dāng)PCR產(chǎn)物中三個引物對擴(kuò)增的片段均為純合子時NFI基因存在全基因大片段缺失的可能性。

進(jìn)一步，所述對cDNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增獲得五個大片段時，引物退火溫度為60℃；對五個大片段進(jìn)行巢式PCR擴(kuò)增時，引物退火溫度為62℃。

進(jìn)一步，所述實(shí)時熒光定量PCR擴(kuò)增合成引物片段不超過350bp。

進(jìn)一步，所述27CAGT擴(kuò)增片段的大小為201bp左右，27AC28.4擴(kuò)增片段的大小為214bp左右，38TG53.0擴(kuò)增片段的大小為479bp左右。

本發(fā)明還提供上述病因?qū)W診斷試劑的使用方法，包括如下步驟：1)以被測個體外周靜脈血為樣本，以所述點(diǎn)突變分析試劑盒分析樣本中包括c.7106G>A，p.W2369X突變的點(diǎn)突變是否存在，如存在為I型神經(jīng)纖維瘤病患者，如不存在進(jìn)行下述步驟；2)以NF1全基因大片段缺失分析試劑盒分析樣本中全基因大片段缺失存在的可能性，如存在雜合子，則排除全基因大片段缺失的可能性；如均為純合子，則疑為全基因大片段缺失突變患者，進(jìn)行下述步驟；3)以NF1基因外顯子缺失分析試劑盒分析是否為外顯子缺失攜帶者，如是缺失攜帶者則診斷為患者，如不是則為其他基因突變或正常個體。

本發(fā)明還提供病因?qū)W診斷試劑中用于檢測NF1基因突變的引物對組，包括用于檢測NF1基因大片段缺失的引物對，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1-6所示；用于擴(kuò)增cDNA獲得五個大片段的引物對，其核苷酸序列如SEQ ID NO.7-16所示；用于對cDNA的五個大片段進(jìn)行巢式PCR擴(kuò)增的引物對，其核苷酸序列如SEQ ID NO.17-60所示；用于檢測NF1基因外顯子缺失的引物對，其核苷酸序列如SEQ ID NO.61-70所示。

上述病因?qū)W診斷試劑的制備方法，包括如下步驟：將所述引物對組中的70條單鏈DNA分別單獨(dú)包裝后，與下述物質(zhì)中的至少一種包裝在同一試劑盒內(nèi)：PCR反應(yīng)緩沖液、DNA聚合酶和4種dNTP。

實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的具體實(shí)驗(yàn)方法與步驟如下：

1.擴(kuò)增引物的設(shè)計(jì)與合成

從NCBI數(shù)據(jù)庫獲得NF1基因核酸序列，應(yīng)用Primer-BLAST軟件(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/)設(shè)計(jì)cDNA外套引物、cDNA巢式引物、STR標(biāo)志引物、Real time PCR引物共計(jì)35對，所有序列見附表1。所有序列從上海生物工程公司訂購，PAGE純化。

2.樣品前處理(核酸提取)

2.1總RNA的提取(RNAisoTMPlus，日本TaKaRa)

2.1.1抽取外周血，取100μl外周血于1.5ml EP管中。

2.1.2加入1ml RNAiso Plus，反復(fù)吹打胞至細(xì)胞徹底裂解。

2.1.3加入200μl氯仿，充分振蕩15sec使溶液充分乳化，室溫靜置5min。

2.1.4 12000rpm 4℃離心15min后，將上清液轉(zhuǎn)移至新1.5ml離心管中(分為三層，切勿吸入中下兩層)。

2.1.5加入等體積的異丙醇，充分混合后，室溫靜置10min。

2.1.6 12000rpm，4℃離心10min后，棄去上清液，留沉淀。

2.1.7加入1ml 75％乙醇溶液，洗滌沉淀。12000rpm，4℃離心5min。

2.1.8吸凈上清后，室溫干燥30min(在超凈工作臺中進(jìn)行)。

2.1.9加入20μl DEPC水，55-60℃水浴10min溶解RNA。

2.1.10測定RNA濃度，保存于-80℃冰箱內(nèi)備用。

2.2全血DNA抽提(天根血液基因組DNA提取試劑盒-離心柱法)

2.2.1取300μl的抗凝全血，在樣品中加入600μl細(xì)胞裂解液CL，顛倒混勻，10000rpm離心1min，吸去上清，留下細(xì)胞核沉淀。

2.2.2重復(fù)上述步驟一次。

2.2.3向離心收集到的細(xì)胞核沉淀中加200μl緩沖液GS，振蕩至徹底混勻。

2.2.4加入20μl Proteinase K溶液，混勻。

2.2.5加入200μl緩沖液GB，充分顛倒混勻，56℃放置10min，其間顛倒混勻數(shù)次，直至溶液應(yīng)清亮。

2.2.6加200μl無水乙醇，充分顛倒混勻，此時可能會出現(xiàn)絮狀沉淀。

2.2.7將上一步所得溶液和絮狀沉淀都加入一個吸附柱CB3中(吸附柱CB3放入2ml收集管中)，12,000rpm離心30sec，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱CB3放入新的2ml收集管中。

2.2.8向吸附柱CB3中加入500μl緩沖液GD，12,000rpm離心30sec，倒掉收集管中的廢液，再將吸附柱CB3放入新的2ml收集管中。

2.2.9向吸附柱CB3中加入600μl漂洗液PW，12,000rpm離心30sec，倒掉收集管中的廢液，再將吸附柱CB3放入新的2ml收集管中。

2.2.10重復(fù)操作步驟9。

2.2.11 12,000rpm離心2min，倒掉廢液。將吸附柱CB3置于室溫放置數(shù)分鐘，以徹底晾干吸附材料中殘余的漂洗液。

2.2.12將吸附柱CB3轉(zhuǎn)入1.5ml離心管中，向吸附膜中間位置懸空滴加100μl洗脫緩沖液TB，室溫放置2-5min，12,000rpm離心2min，將溶液收集到離心管中。

2.2.13取1μl DNA于Nanodrop紫外分光光度計(jì)測定OD260nm/280nm比值，其余DNA保存于4℃冰箱內(nèi)，用于后續(xù)研究。

3.核酸擴(kuò)增

3.1利用三個基因內(nèi)微衛(wèi)星多態(tài)標(biāo)志分析(27AC28.4，38TG53.0，27CAGT)，排查全基因大片段缺失的可能性。

3.1.1聚丙烯酰胺凝膠(8％)130ml配制：

3.1.2將以上配制的液體倒入制膠板，待凝膠聚合后，以1×TBE作為電泳緩沖液，預(yù)電泳半小時后將PCR產(chǎn)物小心加到相應(yīng)的凝膠孔中，100V電泳約4-5h。

3.1.3用銀染的方法來檢測DNA分子是一種靈敏而簡單的手段。利用銀離子可與核酸結(jié)合的特性，在甲醛作用下銀離子還原使凝膠中DNA條帶顯色。其操作過程如下：

①電泳完的聚丙烯酰胺凝膠用10％的酒精浸泡5分鐘。

②棄酒精，加入1％HNO₃，3分鐘。

③棄HNO₃，用清水清洗兩次。

④加入AgNO₃，染色20分鐘。

⑤用ddH₂O清洗一次。

⑥加入顯影液，至可見清淅的DNA電泳條帶為止。

⑦棄顯影液，加入10％的乙酸定影5分鐘。

⑧棄乙酸，在清水中浸泡5分鐘以上。

⑨用玻璃紙包膠干燥，觀察分析及掃描存檔。

3.2RNA反轉(zhuǎn)錄及cDNA擴(kuò)增，RT-PCR

3.2.1反轉(zhuǎn)錄PCR

反轉(zhuǎn)錄PCR反應(yīng)體系如下(PrimeScriptTM RT reagent Kit，日本TaKaRa)：

反轉(zhuǎn)錄PCR反應(yīng)條件如下：

37℃ 15min

85℃ 5s

產(chǎn)物-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

3.2.2cDNA測序：

先擴(kuò)增NF1基因cDNA1、2、3、4、5共5個大片段，這些大片段覆蓋了基因的全長。

反應(yīng)體系：30ul

PCR反應(yīng)循環(huán)條件：

巢式測序:

cDNA1-1、1-2、1-3、1-4；cDNA2-1、2-2、2-3、2-4、2-5；cDNA3-1、3-2、3-3、3-4、3-5；cDNA4-1、4-2、4-3、4-4；cDNA5-1、5-2、5-3、5-4共22對引物。

PCR反應(yīng)循環(huán)條件：30ul

*Exon31為可變剪切，所以cDNA3-2、3-3有兩個條帶。

3.2.3Real time PCR

已合成的引物中選擇符合條件片段大小不超過350bp(最適宜片段大小在300bp以下)和退火溫度60℃的有exons 3、11、25、34、58進(jìn)行Real time PCR。反應(yīng)在ABI 7500real-time PCR system(Applied Biosystem,Foster City,CA)儀器上進(jìn)行，DNA樣品濃度稀釋至5ng/μl，反應(yīng)體系參照下述配制，每份樣品每次反應(yīng)做3個復(fù)孔。

反應(yīng)體系及條件：

反應(yīng)條件如下：

數(shù)據(jù)分析：

實(shí)驗(yàn)所用的數(shù)據(jù)分析方法為2^-ΔΔCt法。Ct值就是在熒光PCR擴(kuò)增過程中，當(dāng)擴(kuò)增產(chǎn)物的熒光信號達(dá)到設(shè)定的閾值時所經(jīng)過的擴(kuò)增循環(huán)次數(shù)。它與模版的拷貝數(shù)存在著線性關(guān)系，起始拷貝數(shù)越多，經(jīng)過的循環(huán)數(shù)就越少，Ct值也就越小，反之亦然。平均Ct(mCt)為每份樣品三個復(fù)孔Ct值的平均值。ΔCt為NF1基因外顯子與內(nèi)參基因(β-globin)Ct值的差值。ΔΔCt的計(jì)算公式為:ΔΔCt＝[mCt_NF1exon(待測)–mCt_β-globin(待測)]–[mCt_{NF1 exon}(對照)–mCt_β-globin(對照)]。每對引物選取3個正常女性作為對照。根據(jù)此方法計(jì)算得到每個待測樣本的相對基因含量，0.5左右為缺失攜帶者，1左右表示正常個體。

目前用于檢測基因的方法有Sanger測序法、二代測序法、多重連接探針擴(kuò)增MLPA(multiple ligation-dependent probe amplification,MLPA)法、熒光原位雜交FISH(Fluorescence in situ hybridization,FISH)法等，然而這檢測方法要么耗時過多，要么需配備價格昂貴的大型儀器設(shè)備，導(dǎo)致檢測成本大大升高。本發(fā)明采用巢式擴(kuò)增后的測序以及聚丙烯酰胺凝膠電泳技術(shù)使檢測時間大大縮短，檢測成本大大降低。

傳統(tǒng)Sanger測序方法僅能檢出點(diǎn)突變、小片段插入和缺失，不能檢出外顯子缺失和整個NF1基因的缺失或重復(fù)等。本發(fā)明在巢式測序的點(diǎn)突變檢測后，更進(jìn)一步采用STR標(biāo)志分析和Real time PCR聯(lián)合對NF1基因全片段缺失進(jìn)行快速且準(zhǔn)確的全面檢測。實(shí)踐證明STR標(biāo)志分析法可有效地運(yùn)用于NF1整個基因的缺失的檢測。Real time PCR的高靈敏、高特異性和精確定量的特點(diǎn)，可對NF1整個基因的缺失或重復(fù)進(jìn)行準(zhǔn)確診斷。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果在于：

1.本發(fā)明公開的I型神經(jīng)纖維瘤病致病基因突變與I型神經(jīng)纖維瘤病高度相關(guān)，運(yùn)用此方法已經(jīng)成功檢出十幾例患者。其中突變(c.7106G>A，p.W2369X)使神經(jīng)纖維蛋白截短而失去正常功能，造成常染色體顯性遺傳病的I型神經(jīng)纖維瘤病。

2.本發(fā)明采用巢式擴(kuò)增后的測序使檢測時間大大縮短，檢測成本大大降低。

3.本發(fā)明采用STR標(biāo)志分析與Real time PCR分析相互佐證的方法來判斷基因大片段缺失的存在，其結(jié)果更加精準(zhǔn)。

4.本發(fā)明結(jié)合Sanger測序，Real time PCR和STR標(biāo)志分析法等多種技術(shù)的各自優(yōu)點(diǎn)，針對NF1基因的點(diǎn)突變、移碼突變、拼接突變、大片段缺失和重復(fù)進(jìn)行快速且準(zhǔn)確的全面檢測。

5.本發(fā)明試劑盒所提供的引物對組，采用價格低廉的普通DNA聚合酶即可快速、準(zhǔn)確、高效的鑒定神經(jīng)纖維瘤遺傳缺陷，獲得檢測結(jié)果。

6.本發(fā)明診斷試劑基于核酸擴(kuò)增技術(shù)而開發(fā)設(shè)計(jì)，具有設(shè)備要求低、檢測時間短、準(zhǔn)確率高、漏檢率極低，方便快捷等特點(diǎn)。

7.本發(fā)明NF1基因突變的準(zhǔn)確檢出，為產(chǎn)前診斷和后續(xù)輔助生殖提供可能，可進(jìn)一步預(yù)防出生缺陷，提高出生人口質(zhì)量。

8.本發(fā)明為神經(jīng)纖維瘤遺傳缺陷基因的分子篩查提供參考和借鑒。

附圖說明

圖1：利用核苷酸序列如SEQ ID NO.3-4所示的引物對進(jìn)行DNA的擴(kuò)增結(jié)果；

圖中字母A代表27CAGT標(biāo)記名稱，后面的數(shù)字表示該STR標(biāo)記的每個等位基因型，按照擴(kuò)增片段大小遞增排列。出現(xiàn)A1、A2或者A3其中一個片段即為純合子，出現(xiàn)其中任意二個片段的組合A1/A2、A1/A3、A2/A3為雜合子。

膠圖中A1為CA重復(fù)數(shù)14個，如檢出A2或者A3其中一個片段即為純合子。

圖2：利用核苷酸序列如SEQ ID NO.1-2所示的引物對進(jìn)行DNA的擴(kuò)增結(jié)果；

圖中字母D代表27AC28.4標(biāo)記名稱，后面的數(shù)字表示該STR標(biāo)記的每個等位基因型，按照擴(kuò)增片段大小遞增排列。出現(xiàn)D1、D2或者D3其中一個片段即為純合子，出現(xiàn)其中任意二個片段的組合D1/D2、D1/D3、D2/D3為雜合子。

膠圖中D1為AC重復(fù)數(shù)15個，如檢出D3一個片段即為純合子。

圖3：利用核苷酸序列如SEQ ID NO.5-6所示的引物對進(jìn)行DNA的擴(kuò)增結(jié)果；

圖中字母C代表38TG53.0標(biāo)記名稱，后面的數(shù)字表示該STR標(biāo)記的每個等位基因型，按照擴(kuò)增片段大小遞增排列。出現(xiàn)C1、C2或者C3其中一個片段即為純合子，出現(xiàn)其中任意二個片段的組合C1/C2、C1/C3、C2/C3為雜合子。

膠圖中C1為9個重復(fù)數(shù)，如檢出C2一個片段即為純合子。

圖4：利用核苷酸序列如SEQ ID NO.7-16所示的引物對進(jìn)行擴(kuò)增cDNA五個大片段的擴(kuò)增結(jié)果；

圖5：利用核苷酸序列如SEQ ID NO.17-60所示的引物對進(jìn)行巢式PCR的擴(kuò)增結(jié)果；

圖6：Sanger測序結(jié)果；

圖7：本發(fā)明診斷試劑檢測流程圖。

具體實(shí)施方式

實(shí)施例1

I型神經(jīng)纖維瘤病NF1基因突變的發(fā)現(xiàn)

發(fā)明人對13例患者進(jìn)行了基因突變分析，詳細(xì)步驟如下：

1)采用突變分析試劑進(jìn)行檢測：所述試劑包括1)總RNA提取體系試劑；2)RNA反轉(zhuǎn)錄及cDNA擴(kuò)增體系試劑；3)cDNA測序體系試劑。

2)抽取疑似患者和正常對照樣本EDTA抗凝外周血樣本各2ml，進(jìn)行總RNA的提取，反轉(zhuǎn)錄PCR，cDNA擴(kuò)增獲得cDNA1、2、3、4、5共5個大片段(結(jié)果見圖4)；對5段cDNA大片段進(jìn)行巢式PCR，共22對引物，PCR產(chǎn)物瓊脂糖電泳結(jié)果(圖5)和測序結(jié)果(圖6)。

I型神經(jīng)纖維瘤病為常染色體顯性遺傳，本研究結(jié)合家系實(shí)際情況以及NF1基因高自發(fā)突變率的特點(diǎn)，發(fā)現(xiàn)13位患者中有1位存在NF1基因c.7106G>A，p.W2369X突變(圖6)。預(yù)期該突變使蛋白截短而失去正常功能，該結(jié)果均與臨床診斷相符(患者乙樣本來自某三甲醫(yī)院，8個以上皮膚咖啡牛奶斑，有腋窩或腹股溝雀斑，有3個神經(jīng)纖維瘤，初步診斷為1型神經(jīng)纖維瘤)。3例表型正常人均未發(fā)現(xiàn)上述突變。由此，可初步推斷上述基因突變?yōu)樵摶颊咧虏⊥蛔?。其余患者為其他類型突變，具體如下：

1)NF1基因檢測結(jié)果為c.2835delT，p.Phe945Leufsx10突變陽性

2)NF1基因雜合性缺失(測序以外的其他檢測方法檢測的結(jié)果)

3)NF1基因測序檢測結(jié)果為c.2447G>A p.R816Q和c.7352delC p.Pro2451Leufs*17雜合突變陽性

4)NF1基因檢測結(jié)果為c.6772C>T p.R2258X雜合突變陽性

5)NF1基因檢測結(jié)果為p.T1923K雜合突變陽性

6)NF1基因檢測結(jié)果為c.989C>T P.A330V突變陽性

7)NF1基因檢測結(jié)果為c.4786C>T P.Q1596X雜合突變陽性

8)NF1基因exon28檢測為c.3826C>T P.R1276X雜合突變陽性

9)NF1基因檢測結(jié)果為exon28c.3721C>T，p.R1241X雜合突變陽性

10)NF1基因檢測結(jié)果為c.1019_1020delCT，p.Ser340Cysfsx12雜合突變陽性

11)NF1基因檢測結(jié)果為c.989C-T p.A330V雜合突變陽性

12)患者甲基因檢測結(jié)果為基因大片段缺失(測序以外的其他檢測方法檢測的結(jié)果)

實(shí)施例2

應(yīng)用本發(fā)明試劑盒進(jìn)行診斷的使用方法和應(yīng)用例。

一、獲取臨床樣本并設(shè)置實(shí)驗(yàn)組和對照組

1)患者甲

患者甲，男性，樣本來自某三甲醫(yī)院，6個皮膚咖啡牛奶斑，有腋窩或腹股溝雀斑，有9個神經(jīng)纖維瘤，初步診斷為1型神經(jīng)纖維瘤。

2)患者乙

患者乙樣本來自某三甲醫(yī)院，8個及以上的皮膚咖啡牛奶斑，有腋窩或腹股溝雀斑，有3個神經(jīng)纖維瘤，初步診斷為1型神經(jīng)纖維瘤。

3)對照組

選取3例正常人為對照組。

二、實(shí)驗(yàn)方案與步驟

采用本發(fā)明點(diǎn)突變分析試劑盒進(jìn)行檢測：所述試劑盒包括1)總RNA提取體系試劑盒；2)RNA反轉(zhuǎn)錄及cDNA擴(kuò)增體系試劑盒；3)cDNA測序體系試劑盒。

具體操作如下：

1.抽取疑似患者甲、患者乙和正常對照樣本EDTA抗凝外周血樣本各2ml。

2.總RNA的提?。?/p>

2.1抽取待測者新鮮血液2ml，取100μl的血液與1.5mlEP管中。

2.2加入1ml RNAiso Plus，反復(fù)吹打至徹底裂解。

2.3加入200μl氯仿，充分振蕩15sec使溶液充分乳化，室溫靜置5min。

2.4 12000rpm 4℃離心15min后，將上清液轉(zhuǎn)移至新1.5ml離心管中(分為三層，切勿吸入中下兩層)。

2.5加入等體積的異丙醇，充分混合后，室溫靜置10min。

2.6 12000rpm，4℃離心10min后，棄去上清液，留沉淀。

2.7加入1ml 75％乙醇溶液，洗滌沉淀。12000rpm，4℃離心5min。

2.8吸凈上清后，室溫干燥30min(在超凈工作臺中進(jìn)行)。

2.9加入20μl DEPC水，55-60℃水浴10min溶解RNA。

2.10測定RNA濃度，疑似患者組：133ng/μl；正常對照組：165ng/μl，保存于-80℃冰箱。

3、反轉(zhuǎn)錄PCR

取患者組和正常對照組的總RNA1μg為模板進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。

反轉(zhuǎn)錄PCR反應(yīng)體系如下：

反轉(zhuǎn)錄PCR反應(yīng)條件如下：

37℃ 15min

85℃ 5s

cDNA產(chǎn)物-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

4、cDNA擴(kuò)增(本發(fā)明試劑盒cDNA外套引物、cDNA巢式引物序列見附表1)

4.1對疑似患者組和正常對照組的cDNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增獲得NF1基因cDNA1、2、3、4、5共5個大片段。

反應(yīng)體系：30ul

PCR反應(yīng)條件：

4.2對5個大片段PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖電泳(結(jié)果見圖4)。

4.3巢式PCR：對5段cDNA大片段進(jìn)行巢式PCR。(本發(fā)明cDNA巢式引物序列見附表1cDNA1-1、1-2、1-3、1-4；cDNA2-1、2-2、2-3、2-4、2-5；cDNA3-1、3-2、3-3、3-4、3-5；cDNA4-1、4-2、4-3、4-4；cDNA5-1、5-2、5-3、5-4共22對引物)

PCR反應(yīng)循環(huán)條件：30ul

4.4PCR產(chǎn)物瓊脂糖電泳結(jié)果(圖5)和測序結(jié)果(圖6)。

結(jié)果分析：如圖所示，患者甲NF1基因58個外顯子區(qū)域的測序檢測未發(fā)現(xiàn)突變：c.7106G>A，p.W2369X?；颊咭襈F1基因58個外顯子區(qū)域的測序檢測發(fā)現(xiàn)突變：c.7106G>A，p.W2369X，預(yù)期該突變使蛋白截短而失去正常功能，該結(jié)果與臨床診斷相符。3例正常人均未發(fā)現(xiàn)上述突變?；颊咭铱纱_診為I型神經(jīng)纖維瘤病患者。

實(shí)施例3

前述步驟與實(shí)施例2基本相同，所不同之處在于，對未檢測到突變：c.7106G>A，p.W2369X的患者甲和3例正常人繼續(xù)如下檢測。

采用本發(fā)明NF1全基因大片段缺失分析試劑盒進(jìn)行檢測，所述試劑盒包括1)DNA提取體系試劑盒；2)基因內(nèi)微衛(wèi)星多態(tài)標(biāo)志分析試劑盒。

具體操作如下：

5、使用基因組DNA抽提試劑盒抽提疑似患者甲和正常對照外周血DNA(確保抽提DNA儲存濃度>50ng/μl)：

5.1取300μl的抗凝全血，在樣品中加入600μl細(xì)胞裂解液CL，顛倒混勻，10 000rpm離心1min，吸去上清，留下細(xì)胞核沉淀。

5.2重復(fù)上述步驟一次。

5.3向離心收集到的細(xì)胞核沉淀中加200μl緩沖液GS，振蕩至徹底混勻。

5.4加入20μl Proteinase K溶液，混勻。

5.5加入200μl緩沖液GB，充分顛倒混勻，56℃放置10min，其間顛倒混勻數(shù)次，直至溶液應(yīng)清亮。

5.6加200μl無水乙醇，充分顛倒混勻，此時可能會出現(xiàn)絮狀沉淀。

5.7將上一步所得溶液和絮狀沉淀都加入一個吸附柱CB3中(吸附柱CB3放入2ml收集管中)，12 000rpm離心30sec，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱CB3放入新的2ml收集管中。

5.8向吸附柱CB3中加入500μl緩沖液GD，12 000rpm離心30sec，倒掉收集管中的廢液，再將吸附柱CB3放入新的2ml收集管中。

5.9向吸附柱CB3中加入600μl漂洗液PW，12 000rpm離心30sec，倒掉收集管中的廢液，再將吸附柱CB3放入新的2ml收集管中。

5.10重復(fù)操作步驟9。

5.11 12 000rpm離心2min，倒掉廢液。將吸附柱CB3置于室溫放置數(shù)分鐘，以徹底晾干吸附材料中殘余的漂洗液。

5.12將吸附柱CB3轉(zhuǎn)入1.5ml離心管中，向吸附膜中間位置懸空滴加100μl洗脫緩沖液TB，室溫放置2-5min，12 000rpm離心2min，將溶液收集到離心管中。

5.13測定DNA濃度，疑似患者組：117ng/μl；正常對照組：102ng/μl，保存于-80℃冰箱。

6、利用三個基因內(nèi)微衛(wèi)星多態(tài)標(biāo)志分析(本發(fā)明NF1基因STR標(biāo)志引物序列見附表1)

6.1對疑似患者組和正常對照組的30例正常對照樣本(統(tǒng)計(jì)雜合率專用)DNA進(jìn)行PCR(227AC28.4、38TG53.0、27CAGT的引物序列見附表1)。根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果27CAGT位點(diǎn)雜合子人數(shù)占總?cè)藬?shù)47.2％，27AC28.4位點(diǎn)雜合子人數(shù)占51％，38TG53.0位點(diǎn)雜合子人數(shù)占40％。利用上述27AC28.4、38TG53.0和27CAGT三對引物擴(kuò)增，當(dāng)三對引物實(shí)驗(yàn)結(jié)果均是純合子時，判斷NFI基因存在整個基因雜合性缺失的可能性。

(1)Intron36-IVS27AC28.4：

反應(yīng)條件

(2)Intron36-IVS27CAGT

反應(yīng)條件

(3)Intron47-IVS38TG53.0

反應(yīng)條件

6.2PCR產(chǎn)物進(jìn)行PAGE電泳：聚丙烯酰胺凝膠(8％)130ml配制

6.3以1×TBE作為電泳緩沖液，將PCR產(chǎn)物小心加到相應(yīng)的凝膠孔中，100V電泳約4-5h。

6.4銀染

①電泳完的聚丙烯酰胺凝膠用10％的酒精浸泡5分鐘。

②棄酒精，加入1％HNO₃，3分鐘。

③棄HNO₃，用清水清洗兩次。

④加入AgNO₃，染色20分鐘。

⑤用ddH₂O清洗一次。

⑥加入顯影液，至可見清淅的DNA電泳條帶為止。

⑦棄顯影液，加入10％的乙酸定影5分鐘。

⑧棄乙酸，在清水中浸泡5分鐘以上。

⑨保存結(jié)果(見圖1-3)。

結(jié)果分析：患者甲三個多態(tài)標(biāo)志均為純合子，其NFI基因存在整個基因雜合性缺失的可能性。3例正常人的三個多態(tài)標(biāo)志均為雜合子。判斷三個正常人未患有I型神經(jīng)纖維瘤病。

實(shí)施例4

前述步驟與實(shí)施例3基本相同，所不同之處在于，對未檢測到基因突變：c.7106G>A，p.W2369X，而存在整個基因雜合性缺失可能性的患者甲繼續(xù)如下檢測。

采用本發(fā)明NF1基因外顯子缺失分析試劑盒進(jìn)行檢測，具體操作如下：

8、Real time PCR：(本發(fā)明Real time PCR引物序列見附表1)

8.1對NF1的exons 3、11、25、34、58進(jìn)行Real time PCR，將DNA樣品濃度稀釋至5ng/μl為模板，反應(yīng)體系參照下述配制，每份樣品每次實(shí)驗(yàn)做3個復(fù)孔。

反應(yīng)體系及條件：

反應(yīng)條件如下：

8.2數(shù)據(jù)分析：分析方法為2^-ΔΔCt法，結(jié)果見附表2。

附表2：Real time PCR數(shù)據(jù)分析

*待測樣本的相對基因含量，0.5左右為缺失攜帶者，1左右表示正常個體。

結(jié)果分析：綜上所述，患者甲在exon3、11、25、34和58片段讀數(shù)均是正常對照的半數(shù)，據(jù)此判斷患者甲為全基因缺失攜帶者，這與微衛(wèi)星多態(tài)標(biāo)志分析其存在NF1基因雜合性缺失(Loss of Heterozygosity,LOH)可能性的結(jié)果相互佐證。至此，患者甲診斷為I型神經(jīng)纖維瘤病患者。

附表1：NF1基因STR標(biāo)志引物、cDNA外套引物、cDNA巢式引物序列、Real time PCR引物序列共計(jì)35對，所有序列從上海生物工程公司訂購，PAGE純化。

實(shí)施例5

300例臨床正常對照篩查未發(fā)現(xiàn)c.7106G>A，p.W2369X突變的存在，顯示該突變在正常人群中罕見。

以上實(shí)施例僅用以說明本發(fā)明的技術(shù)方案而非對其限制，盡管參照上述實(shí)施例對本發(fā)明進(jìn)行了詳細(xì)的說明，所屬領(lǐng)域的普通技術(shù)人員依然可以對本發(fā)明的具體實(shí)施方式進(jìn)行修改或者等同替換，而這些未脫離本發(fā)明精神和范圍的任何修改或者等同替換，其均在申請待批的本發(fā)明的權(quán)利要求保護(hù)范圍之內(nèi)。

SEQUENCE LISTING

<110> 杭州艾諾醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)所有限公司

<120> 一種I型神經(jīng)纖維瘤病致病基因突變及基于此基因突變的病因?qū)W診斷試劑

<130> 2016

<160> 70

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

gttctcaact taaatgtaag t 21

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

gaacattaac aacaagtacc 20

<210> 3

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

taacaattgt ggaactgcag caattatt 28

<210> 4

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

cccataccta gttcttaaag tctgt 25

<210> 5

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

gagaacagcc tgggcaactt gc 22

<210> 6

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

ccaaccccaa ttagatctcc atttt 25

<210> 7

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

atggccgcgc acaggccggt ggaat 25

<210> 8

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

tgacaggaac ttctatctgc ctgctta 27

<210> 9

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

atggtgaaac taattcatgc agat 24

<210> 10

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 10

tgtcaaattc tgtgccttg 19

<210> 11

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 11

atggaagcag tagtttcact t 21

<210> 12

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 12

taggactttt gttcgctctg ctga 24

<210> 13

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 13

ggagtacacc aagtatcatg ag 22

<210> 14

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 14

tatacggaga ctatctaaag tatgcag 27

<210> 15

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 15

atggaggcat gcatgagaga tattc 25

<210> 16

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 16

tctgcacttg gcttgcggat 20

<210> 17

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 17

gcgcacaggc cggtggaat 19

<210> 18

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 18

tgctgtttcc ttcaggagtc gtttt 25

<210> 19

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 19

accagcatgc agctgaactt cgg 23

<210> 20

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 20

tcctccatgg ccagcaagag ct 22

<210> 21

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 21

acgtaaagca gcagtttggc ca 22

<210> 22

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 22

tgctgggtgt gctccacaac c 21

<210> 23

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 23

tggtggccta agattgatgc tgtgt 25

<210> 24

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 24

tgacaggaac ttctatctgc ctgct 25

<210> 25

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 25

tcatgcagat ccaaagctct tgct 24

<210> 26

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 26

ccgctgcatc ctgctgcact 20

<210> 27

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 27

acggggtagg atgtgatatt ccttc 25

<210> 28

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 28

tctatggatc ctcctccact caca 24

<210> 29

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 29

gatggcactg ctgaggcgca 20

<210> 30

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 30

tgctgacagg tgtatctgcg t 21

<210> 31

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 31

gtgcccttgg gggagtgtgc 20

<210> 32

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 32

catctcttgg caaaatgaga ggtca 25

<210> 33

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 33

ggtcaggtat gttcgtgtgc ttggg 25

<210> 34

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 34

gtcaaattct gtgccttgtt gaagg 25

<210> 35

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 35

agcagtagtt tcacttctag ctggt 25

<210> 36

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 36

agagtctgca tggagtctgc ca 22

<210> 37

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 37

tgtggttcct tgttctcagt ggga 24

<210> 38

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 38

acggtgagac aatggcagga 20

<210> 39

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 39

cttcgaagtg tgtgccactg t 21

<210> 40

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 40

gtgctctgga ggacccaggt 20

<210> 41

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 41

gcaactttga tgcagcacgc agg 23

<210> 42

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 42

aagcgattgc taggcccggt 20

<210> 43

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 43

agctgggact tccaaagctg gga 23

<210> 44

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 44

aggacttttg ttcgctctgc tga 23

<210> 45

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 45

atgagcggct gctgactggc 20

<210> 46

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 46

ggcacacaga agattatagg cagct 25

<210> 47

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 47

gcccgactct atcccccaac aca 23

<210> 48

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 48

gcagtatctg ccatcacctc agc 23

<210> 49

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 49

tggggaagcc ttgggcagat 20

<210> 50

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 50

ccaggagaga atgacctgtc ccgg 24

<210> 51

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 51

acttgctgtt tggcattagc aaagt 25

<210> 52

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 52

tgcaggtttt gttcaagaag tgcgg 25

<210> 53

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 53

acgtgcaagt ggctggacca 20

<210> 54

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 54

gcaggtgaag gatgcctgta ccc 23

<210> 55

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 55

ggagtggcac tgcaagcaaa tgg 23

<210> 56

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 56

gggggtgttg tgatccctga 20

<210> 57

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 57

gcctggacat ggggcaacct 20

<210> 58

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 58

acggtcctgc aaaccgccac 20

<210> 59

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 59

accacagatg agtttgatca acgaa 25

<210> 60

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 60

ttggcttgcg gatccgtggc 20

<210> 61

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 61

tggtagcaga aagtgaaact a 21

<210> 62

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 62

ataggactgt cctcttggtc cac 23

<210> 63

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 63

cttagtgttt tttttttaaa ctttcta 27

<210> 64

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 64

atttttttag taatttagca atacc 25

<210> 65

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 65

atttgagggg aagtgaaaga ac 22

<210> 66

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 66

tggtgggggg ctttatttgc 20

<210> 67

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 67

ttaaacggag agtgttcact atc 23

<210> 68

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 68

ttaaacggag agtgttcact atc 23

<210> 69

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 69

cagtcctgga aggaaaagaa gaagt 25

<210> 70

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 70

tctggcaaca tggcaaaccg g 21