本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及3,6-二取代三唑酮并噻二唑衍生物或其鹽，及其在制備藥物中的用途。

背景技術(shù)：

心臟是生物體發(fā)育中出現(xiàn)的第一個(gè)功能性器官。心臟發(fā)育生長(zhǎng)的異常是心血管疾病的標(biāo)志事件。據(jù)美國(guó)心臟協(xié)會(huì)和我國(guó)國(guó)家心血管病中心最新統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)表明，心血管疾病是所有致死因素中占比最大的疾?。s占40%）

心力衰竭臨床上一般采用藥物、介入及手術(shù)治療改善心肌缺血等一般治療。常見(jiàn)藥物有利尿劑、血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制劑、β-受體阻滯劑、洋地黃類(lèi)藥物、醛固酮桔抗劑、血管緊張素Ⅱ受體拮抗劑、鈣拮抗劑等藥物治療?？鼓?、抗血小板治療。心梗急性發(fā)作期可以采用口服硝化甘油或安裝心臟支架緩解，嚴(yán)重者甚至需要進(jìn)行心臟移植手術(shù)。

心肌梗死和缺血性心臟疾病是由循環(huán)到心肌的血液減少所引起，其特征在于心肌細(xì)胞的缺失從而導(dǎo)致致命性心律失常和心臟衰竭的發(fā)生。盡管現(xiàn)代醫(yī)學(xué)有很大進(jìn)步，但心肌梗死和心臟衰竭的治療仍然是一個(gè)重大挑戰(zhàn)。

在心血管醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，刺激心肌細(xì)胞再生的新療法開(kāi)發(fā)處在最前沿。一些細(xì)胞療法已被采取作為治療方案，用于在患病心臟中來(lái)補(bǔ)充新生心肌。這些療法包括胚胎干細(xì)胞（ESCs），骨髓干細(xì)胞和ESC來(lái)源的心肌細(xì)胞等細(xì)胞移植，或?qū)?nèi)源的成纖維細(xì)胞重編程成心肌細(xì)胞。然而，這些研究雖然已被證明具有一定的臨床價(jià)值，但目前尚未克服了強(qiáng)大的技術(shù)障礙，如效率，安全性和輸送途徑。這些問(wèn)題都突出了開(kāi)發(fā)小分子藥物的迫切性，從而使其可刺激患病心肌內(nèi)源性再生。

3,6-二取代三唑酮并噻二唑衍生物以前被報(bào)道具有消炎、抗腫瘤、殺蟲(chóng)、抗菌降壓等生物活性【楊知昆，孫學(xué)軍、米娜、張海科、尤進(jìn)茂，范志金，三唑并噻二唑衍生物的合成及抑菌活性，應(yīng)用化學(xué),2009,26（9）：1027-30; JiahuiWua, JiannengLic, Ming-Hua Xub, Dongxiang Liua，Structure–activity relationship and interaction studies of new SIRT1 inhibitors with the scaffold of 3-(furan-2-yl)-[1,2,4]triazolo[3,4-b][1,3,4]thiadiazole, Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters,2014.24(14): 3050–56; 】。在此之前未見(jiàn)有促進(jìn)心肌細(xì)胞再生的報(bào)道。

鐘濤等人2011年首次報(bào)道了在系列三唑酮并噻二唑衍生物Cardionogen（CDNGs）作為Wnt信號(hào)通路的拮抗劑可以增加心肌祖細(xì)胞數(shù)量，被證明可以增強(qiáng)心肌分化【Terri T. Ni, Eric J. Rellinger, Amrita Mukherjee, Lauren Stephens, Cutris A Thorne, Kwangho Kim, Jiangyong Hu, ShuyingXie, Ethan Lee, Larry Marnett, Antonis K. Hatzopoulos, Tao P. Zhong，Discovering small molecules that promote cardiomyocyte generation by modulating Wnt signaling，Chem Biol. 2011 Dec 23; 18(12): 1658–1668. doi: 10.1016/j.chembiol.2011.09.015】。 CDNGs還能誘導(dǎo)小鼠胚胎干細(xì)胞分化成心肌細(xì)胞。不像其他的Wnt抑制劑，CDNG作用于斑馬魚(yú)胚胎不會(huì)導(dǎo)致可見(jiàn)的形態(tài)缺陷，例如前后軸線縮短等。其中活性最高的是3位為呋喃環(huán)取代的衍生物（CDNG1），活性均有待進(jìn)一步提高，且心肌損傷動(dòng)物模型實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證未深入開(kāi)展。

經(jīng)典Wnt途徑一般由分泌的Wnt蛋白與Frizzled受體復(fù)合物相結(jié)合來(lái)介導(dǎo)，這導(dǎo)致β-catenin蛋白由細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)移至細(xì)胞核中，從而激活T細(xì)胞因子（TCF）和淋巴增強(qiáng)因子（LEF）介導(dǎo)的基因表達(dá)。雖然CDNG抑制Wnt信號(hào)途徑中TCF / LEF介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)錄，但CDNG在Wnt信號(hào)通路中的關(guān)鍵靶標(biāo)仍為未知。

本發(fā)明在2011年公開(kāi)發(fā)表CDNGs工作的基礎(chǔ)上，通過(guò)結(jié)構(gòu)修飾/改造，引入對(duì)位-吡啶取代基，活性和成藥性能得到進(jìn)一步提升, 并發(fā)現(xiàn)beta-catenin 是CDNGs 作用的關(guān)鍵靶標(biāo)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供具有促心肌細(xì)胞再生的活性小分子3,6-二取代三唑酮并噻二唑衍生物或其鹽，及其在制備藥物的用途。

本發(fā)明提供的3,6-二取代三唑酮并噻二唑衍生物，具有以下結(jié)構(gòu)：

；

其中R為具有5~6碳元的環(huán)烷基；如：

或

具體為2種：

（1）化學(xué)結(jié)構(gòu)式為C₁₄H₁₅N₅S，平均分子量為285.37 g/Mol；英文名：

6-cyclohexyl-3-(pyridin-4-yl)-[1,2,4]triazolo[3,4-b][1,3,4]thiadiazole；

中文名：6-環(huán)己基-3-(吡啶-4-基)-[1,2,4]三唑[3,4-b][1,3,4]噻二唑，簡(jiǎn)稱CDNG1A；

（2）化學(xué)結(jié)構(gòu)式為C13H13N5S, 平均分子量為271.37g/mol；英文名：

6-cyclopentyl-3-(pyridin-4-yl)-[1,2,4]triazolo[3,4-b][1,3,4]thiadiazole；

中文名：6-環(huán)戊基-3-(吡啶-4-基)-[1,2,4]三唑[3,4-b][1,3,4]噻二唑，簡(jiǎn)稱CDNG1B。

本發(fā)明的CDNG1A或CDNG1B作為Wnt/β-catenin通路阻滯劑，高內(nèi)涵活性測(cè)試、在分子、細(xì)胞及整體動(dòng)物水平具有比文獻(xiàn)報(bào)道的CDNG具有更高的活性和更低的毒性，因此成藥性更高，可以用于制備預(yù)防或治療心肌梗死、心肌壞死和心肌衰竭等疾病的藥物，如心衰、心梗、心律失常和/或心肌細(xì)胞損傷修復(fù)藥物等。

本發(fā)明中，所述衍生物的鹽為藥學(xué)上可接受的鹽。

本發(fā)明中，所述的“藥學(xué)上可接受的鹽”可具體地列舉為與鹽酸、氫溴酸、磷酸、硫酸或硝酸等無(wú)機(jī)酸形成的鹽，或與甲酸、乙酸、甲磺酸、乙磺酸或檸檬酸等有機(jī)酸形成的鹽。

本發(fā)明公開(kāi)的CDNG1A、CDNG1B或其鹽可以釆用各種常規(guī)的制備方法制備。例如, 釆用人工化學(xué)合成的方法。

本發(fā)明公開(kāi)的CDNG1A、CDNG1B或其鹽在治療上進(jìn)行施用(給藥)時(shí), 可提供不同的效果。通常，可將這些物質(zhì)配制于無(wú)毒的、惰性的和藥學(xué)上可接受的水性載體介質(zhì)中，其中pH通常約為5-8,較佳地pH約為6-8，盡管 pH值可隨被配制物質(zhì)的性質(zhì)以及待治療的病癥而有所變化。配制好的藥物組合物可以通過(guò)常規(guī)途徑進(jìn)行給藥,其中包括(但并不限于):肌內(nèi)、腹膜內(nèi)、皮下、皮內(nèi)、局部給藥或口服。

以本發(fā)明公開(kāi)的CDNG1A、CDNG1B或其鹽可以將其與合適的藥學(xué)上可接受的載體聯(lián)用，組成藥物組合物。這類(lèi)藥物組合物含有治療有效量的化合物和藥學(xué)上可接受的載體或賦形劑。這類(lèi)載體包括(但并不限于):鹽水、緩沖液、葡萄糖、水、甘油、乙醇等，或其中幾種的組合。

本發(fā)明的CDNG1A、CDNG1B制備的藥物組合物, 可以是針劑、片劑、顆粒沖劑、膠囊、泡騰片或新型納米緩釋劑。

藥物制劑應(yīng)與給藥方式相匹配。本發(fā)明公開(kāi)的小分子化合物可以被制成針劑形式, 例如用生理鹽水或含有葡萄糖和其他輔劑的水溶液通過(guò)常規(guī)方法進(jìn)行制備。諸如片劑和膠囊之類(lèi)的藥物組合物, 可通過(guò)常規(guī)方法進(jìn)行制備。藥物組合物如針劑、溶液、片劑和膠囊宜在無(wú)菌條件下制造?；钚猿煞值慕o藥量是治療有效劑量，例如，每天給藥約1-3mg/千克體重；或隔天給藥約3-10mg/千克體重。當(dāng)然，具體劑量還應(yīng)考慮給藥途徑、病人健康狀況等因素，這些都是熟練醫(yī)師技能范圍之內(nèi)的。

此外,本發(fā)明的CDNG1A、CDNG1B還可與其他治療劑一起使用。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下優(yōu)點(diǎn)和有益效果：

本發(fā)明化合物通過(guò)體內(nèi)構(gòu)效關(guān)系實(shí)驗(yàn)進(jìn)行了結(jié)構(gòu)改造與修飾，結(jié)構(gòu)新穎且活性得到提高；

本發(fā)明化合物進(jìn)一步闡明了調(diào)控Wnt信號(hào)通路的分子機(jī)制是作為Wnt阻滯劑通過(guò)下調(diào)β-catenin表達(dá)量抑制Wnt/β-catenin；

本發(fā)明化合物進(jìn)一步在小鼠心梗模型中得到實(shí)驗(yàn)證實(shí)。制備預(yù)防或治療心肌壞死、心肌梗死、心肌衰竭等病的藥物，但不僅限于此。

附圖說(shuō)明

圖1為空白對(duì)照（CTL）、CDNG1、CDNG1A、CDNG1B給藥組心肌細(xì)胞計(jì)數(shù)圖。

圖2：C-L為免疫熒光法測(cè)定的C184小鼠精源干細(xì)胞用不同藥物處理的beta-catenin蛋白表達(dá)水平。其中，H-L為DAPI疊合beta-catenin蛋白熒光免疫染色圖像。

圖3在不同CDNG類(lèi)化合物給藥下PCNA-、Edu-標(biāo)記的斑馬魚(yú)心肌細(xì)胞增殖指數(shù)，Ctrl為空白對(duì)照。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合附圖和實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)一步說(shuō)明。但不應(yīng)理解為對(duì)本發(fā)明的限制。在不背離本發(fā)明精神和實(shí)質(zhì)的情況下，對(duì)本發(fā)明方法、步驟或條件所作的修改或替換，均屬于本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的試驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件或者按照試劑供貨商提供的條件。所采用的原料或試劑、細(xì)胞株或動(dòng)物模型為商業(yè)上可購(gòu)得的或本領(lǐng)域技術(shù)人員根據(jù)已知文獻(xiàn)制得的。

實(shí)施例1： CDNG1A以及CDNG1B的合成。

采用兩步合成法：

中間體：4-amino-5-(pyridin-4-yl)-4H-1,2,4-triazole-3-thiol(III）4-氨基-5-（吡啶-4-基）-4H-1,24,-三唑-4-巰基合成，參照文獻(xiàn)JMC 2009，52(14), 4200-4209（其中化合物16的合成方法）：

二硫化碳（3.3ml，5.5mmol）滴加到含KOH（3.0g，5.5mmol）和吡啶異煙肼（3.6mmol）的乙醇（70ml）溶液中?；旌衔镌谑覝叵聰嚢璺磻?yīng)過(guò)夜，然后冰水浴冷卻并用二乙醚稀釋。過(guò)濾出沉淀物并用二乙醚洗滌并干燥。所的產(chǎn)物（1.6mmol）用水（2ml）溶解，加入水合肼（2.4mmol），混合物在攪拌下回流反應(yīng)6hr。然后向反應(yīng)混合物中加水80ml并用濃鹽酸中和，沉淀物用水過(guò)濾后干燥。中間體III收率為72%. 1H NMR (200 MHz, DMSO-d6): δ [ppm] = 5.86 (s, 2H, -NH2), 8.00-8.03 (d, 2H, 3J = 6.13 Hz, 20,60-H), 8.74-8.77 (d, 2H, 3J = 6.13 Hz,30,50-H), 13.89 (s, 1H,-SH)。

合成：所有溶劑和化學(xué)試劑都從Sigma-Aldrich公司購(gòu)置。干燥微波反應(yīng)管中加入中間體III（150mg，1077mmol），POCl₃ (3 ml) ，環(huán)己基甲酸（108mg，0.85mmol）。反應(yīng)混合物150℃下充分反應(yīng)15min。冷卻至室溫后，將反應(yīng)混合物倒進(jìn)冰水中，用飽和碳酸氫鈉溶液中和。沉淀物過(guò)濾后真空干燥，再采用二氯甲烷甲醇快速色譜純化（0-10% for 10 min），收率85%.¹H-NMR ( 400MHz，DMSO) δ 8.82 (d, J= 6 Hz, 2H) 8.15(d, J=6 Hz, 2H), 3.25-3.21 (m, 1H), 2.16-2.12 (m, 2H), 1.85-1.80 (m, 2H), 1.71-1.66 (m, 3H), 1.48-1.42 (m, 2H), 1.40-1.38 (m, 1H); ¹³C-NMR (DMSO) δ 177.0, 156.5, 151.1, 143.8, 132.8, 119.7, 41.0, 32.1, 29.0, 25.4; C14H15N5S(M+H)+m/z: 286.1。

合成：干燥微波反應(yīng)管中加入中間體III（150mg，1077mmol），POCl₃ (3 ml) ，環(huán)戊基甲酸（97mg，0.85mmol）。反應(yīng)混合物150℃下充分反應(yīng)15min。冷卻至室溫后，將反應(yīng)混合物倒進(jìn)冰水中，用飽和碳酸氫鈉溶液中和。沉淀物過(guò)濾后真空干燥，再采用二氯甲烷甲醇快速色譜純化（0-10% for 10 min），收率80%.¹H-NMR ( 400MHz，DMSO) δ 8.80 (d, J= 6.0 Hz, 2H) 8.12 (d, J= 6 Hz, 2H), 3.62 (m, 1H), 2.20-2.18 (m, 2H), 1.92-1.87 (m, 2H), 1.81-1.74 (m, 2H), 1.74-1.68 (m, 2H); ¹³C-NMR (DMSO) δ 176.7, 156.0, 151.1, 143.5, 132.7, 119.6, 42.5, 32.9, 25.4;LRMS calculated for C13H13N5S(M+H)+m/z: 272.1, measured 272.0。

該合成路線步驟簡(jiǎn)單，中間體及相關(guān)物質(zhì)明確，易于鑒定，且原料易得，易于大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)。

實(shí)施例2：免疫印跡immunoblotting方法進(jìn)一步驗(yàn)證CDNGs對(duì)Wnt通路影響是通過(guò)抑制β-catenin實(shí)現(xiàn)的（圖2）。

步驟一

細(xì)胞：鼠源CGR8胚胎干細(xì)胞

試劑：已知Wnt通路激動(dòng)劑Chir99021，CDNG1/CDNG1A/CDNG1B；DMEM（Sigma），10%FBS，100單位/ml LIF，2mM L-谷氨酰胺，50μM β-巰基乙醇，脂質(zhì)體3000（Life Tech），蛋白酶抑制劑，RIPA細(xì)胞裂解液，聚丙烯酰胺凝膠，硝酸纖維素薄膜，脫脂奶粉，β-catenin一抗 (Santa Cruz Biotechnology)，GAPDH一抗 (Santa Cruz Biotechnology)，HRP二抗。

實(shí)驗(yàn)步驟：將鼠源CGR8胚胎干細(xì)胞單層平鋪在無(wú)血清的DMEM中并加入10％FBS，100單位/mlLIF，2mM L-谷氨酰胺和50μM β-巰基乙醇等，置于37℃含有5%CO₂的潮濕培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。細(xì)胞處于亞匯合狀態(tài)時(shí)消化接種到24孔板中。將5M Chir99021，10M CDNG1, 10M CDNG1A或10M CDNG1B分別單獨(dú)或組合加入不同孔中處理細(xì)胞。經(jīng)過(guò)3小時(shí)處理后，分別收集不同孔中的細(xì)胞并用含有蛋白酶抑制劑的RIPA細(xì)胞裂解液孵育10分鐘。用滅菌槍頭吹打裂解混合物若干次后，將混合液置于低溫離心機(jī)以21000rpm的速度離心10min，取上清待用。用Bradford法進(jìn)行蛋白定量，標(biāo)記蛋白濃度。分別取同樣量的不同組蛋白，將其進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳分離并轉(zhuǎn)至硝酸纖維素薄膜上。將含有蛋白的薄膜放入含有5%脫脂奶粉的1XPBSTx中，同時(shí)加入β-catenin一抗（1：200）和GAPDH一抗（1：500），4℃過(guò)夜孵育。第二天將液體吸干，隨后用1XPBSTx洗3次，每次5min。然后換入含有HRP二抗（1：1000）的1XPBSTx中，在室溫下孵育1小時(shí)。接著同樣用1XPBSTx洗3次，每次5min。最后將清洗后的薄膜置于蛋白凝膠成像儀中進(jìn)行拍照分析。根據(jù)蛋白marker的大小確定相應(yīng)目標(biāo)蛋白位置并用合適的曝光時(shí)間進(jìn)行拍照。

結(jié)果：加入Wnt通路激動(dòng)劑Chir99021后，以GAPDH作為參照物，細(xì)胞的β-catenin量明顯上升；但同時(shí)再加入CDNG1、CDNG1A或CDNG1B后β-catenin表達(dá)量又下降。其中CDNG1A的抑制作用最為顯著。

步驟二：免疫熒光定位β-catenin細(xì)胞內(nèi)分布（fig2C-K）

細(xì)胞：C184精源干細(xì)胞系

試劑：已知Wnt通路激動(dòng)劑Chir99021，CDNG1/CDNG1A/CDNG1B；DMEM（Sigma），10%FBS，100單位/ml LIF，2mM L-谷氨酰胺，50μM β-巰基乙醇，脂質(zhì)體3000（Life Tech），β-catenin一抗 (Santa Cruz Biotechnology)，羊血清（Invitrogen），AlexaFluor 488熒光二抗（Thermo）。

實(shí)驗(yàn)步驟：將鼠源CGR8胚胎干細(xì)胞單層平鋪在無(wú)血清的DMEM中并加入10％FBS，100單位/mlLIF，2mM L-谷氨酰胺和50μM β-巰基乙醇等，置于37℃含有5%CO₂的潮濕培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。細(xì)胞處于亞匯合狀態(tài)時(shí)消化接種到24孔板中。將5 M Chir99021，10 M CDNG1, 10M CDNG1A或10M CDNG1B分別單獨(dú)或組合加入不同孔中處理細(xì)胞。經(jīng)過(guò)3小時(shí)處理后，將細(xì)胞培養(yǎng)基吸干，加入4% PFA室溫固定30分鐘。用1XPBST洗3次，每次5min，換入新鮮配制的5%山羊血清封閉1小時(shí)。向孔中再分別加入β-catenin一抗（1：200）置于4℃過(guò)夜孵育。第二天將液體吸干，隨后用1XPBST洗3次，每次5min。然后換入新鮮配制的5%山羊血清并分別加入AlexaFluor 488熒光二抗（1：1000），在室溫下孵育1小時(shí)。接著同樣用1XPBST洗3次，每次5min。如需DAPI染色則滴加DAPI封片劑處理。最后將細(xì)胞置于熒光顯微鏡下觀察并拍照分析。

結(jié)果：與DMSO空白對(duì)照相比，加入Chir99021，細(xì)胞內(nèi)核仁和胞漿內(nèi)的β-catenin均明顯增加，再往含有Chir99021的細(xì)胞培養(yǎng)孔中加入CDNG1，核仁和胞漿內(nèi)的β-catenin顯著減少，而類(lèi)似地，共孵育CDNG1A則導(dǎo)致核仁和胞漿內(nèi)的β-catenin幾乎消失，更進(jìn)一步說(shuō)明CDNG1A對(duì)Wnt/β-catenin通路活性抑制活性更強(qiáng)。

實(shí)施例3：免疫組化方法分析CDNG1A促進(jìn)斑馬魚(yú)心肌細(xì)胞增值和再生。

動(dòng)物：4-12月齡的AB野生品系和轉(zhuǎn)基因斑馬魚(yú)Tg（cmlc2：nDsRed-nuc）。

試劑：一抗：兔anti-Mef2c（Santa Cruz）；小鼠anti-PCNA（Sigma）；Click-iT? EdU Alexa-Fluor-488試劑盒 (Invirogen)；二抗山羊抗小鼠Alexa-Fluor-488，Alexa-Fluor-555山羊抗兔Alexa-Fluor-488，Alexa-Fluor-555（均購(gòu)自Invitrogen）；含5%醋酸、9%甲醛、0.9%苦酸（Sigma）的Bouin溶液（配制）；不溶性苯胺藍(lán)染料（Fisher）；G橙色染料（Sigma）；酸性品紅染料。

實(shí)驗(yàn)步驟：用手術(shù)剪將4-12月齡斑馬魚(yú)用麻醉劑麻醉2分鐘，在體視顯微鏡下將魚(yú)腹面朝上，在心臟部位剪開(kāi)腹部，使心臟露出。仔細(xì)快速切除心尖約20%后放入水中使其蘇醒。將手術(shù)后的斑馬魚(yú)平均分成若干組，每組加入不同的化合物處理。

對(duì)于AFOG實(shí)驗(yàn)，需從第2天開(kāi)始每天更換新鮮的化合物處理至術(shù)后第21天。對(duì)于PCNA/Mef2C免疫組化實(shí)驗(yàn)，需從第4天開(kāi)始每天更換新鮮的化合物處理至術(shù)后第7天。對(duì)于EdU/DsRed免疫組化實(shí)驗(yàn)，需從第2天開(kāi)始每天更換新鮮的化合物處理至術(shù)后第21天，并在術(shù)后第6/12/18天分別給斑馬魚(yú)注射20mMEdU。化合物處理完畢將斑馬魚(yú)麻醉，分離出相應(yīng)的心臟。4%多聚甲醛室溫固定心臟1小時(shí)后用1XPBST洗3次，每次5min。隨后將心臟置于30%蔗糖溶液4℃過(guò)夜平衡。待心臟沉入管底后取出，吸干表面水分放入包埋模塊中加入OCT包埋劑，放入-80℃冷凍過(guò)夜。取出包埋組織，將冰凍的心臟切成10μm的組織切片。

對(duì)于AFOG實(shí)驗(yàn)，將Bouin’s液放于60℃預(yù)熱30分鐘，取不同實(shí)驗(yàn)組的各一張切片用去離子水洗 10分鐘后放入預(yù)熱的Bouin’s 液于 60℃孵育2小時(shí)。接著用自來(lái)水沖洗切片30分鐘，再用1% Phosphomolybdic acid洗5分鐘。再用去離子水洗5分鐘后將切片加入AFOG染色液染色5分鐘。最后用去離子水洗5分鐘后酒精脫水，中性樹(shù)脂封片。將AFOG染色后的組織切片置于體式顯微鏡下觀察心臟受損后的出血、疤痕及心肌增殖再生情況，其中心肌層、血液和纖維蛋白分別呈現(xiàn)橙色、紅色、藍(lán)色。

對(duì)于PCNA/Mef2C免疫組化實(shí)驗(yàn)，將切片用免疫組化筆將心臟組織圈出，在圈中加入4% PFA室溫固定1小時(shí)。用1XPBST洗3次，每次5min，換入新鮮配制的5%山羊血清室溫封閉1小時(shí)。再向切片上同時(shí)加入PCNA一抗（1：100）和Mef2C一抗（1：100），置于4℃過(guò)夜孵育。第二天用1XPBST洗3次，每次5min。然后換入新鮮配制的5%山羊血清，并同時(shí)加入AlexaFluor 488熒光二抗（1：1000）和AlexaFluor555熒光二抗（1：1000）共同在室溫下孵育1小時(shí)。接著用1XPBST洗3次，每次5min。向切片滴加封片劑后用蓋玻片進(jìn)行封片，最后將封好的切片置于Zeiss LSM 710共聚焦熒光顯微鏡下觀察并拍照分析。每顆心臟需取處于不同位置的三張切片進(jìn)行拍照，用ImageJ2x軟件分別計(jì)數(shù)PCNA+Mef2c+雙陽(yáng)性和Mef2c+單陽(yáng)性的細(xì)胞數(shù)，并用前者除以后者算出相應(yīng)的心肌細(xì)胞增殖再生分?jǐn)?shù)，用統(tǒng)計(jì)學(xué)計(jì)算不同實(shí)驗(yàn)組間的差異性。

對(duì)于EdU/DsRed免疫組化實(shí)驗(yàn)，將切片用免疫組化筆將心臟組織圈出，在圈中加入4% PFA室溫固定1小時(shí)。根據(jù)EDU染色試劑盒說(shuō)明操作進(jìn)行，染色后以下步驟均需避光操作。將切片用1XPBST洗3次，每次5min，換入新鮮配制的5%山羊血清室溫封閉1小時(shí)。再向切片上同時(shí)加入DsRed一抗（1：100）置于4℃過(guò)夜孵育。第二天用1XPBST洗3次，每次5min。然后換入新鮮配制的5%山羊血清，并同時(shí)加入AlexaFluor555熒光二抗（1：1000）在室溫下孵育1小時(shí)。接著同樣用1XPBST洗3次，每次5min。向切片滴加封片劑后用蓋玻片進(jìn)行封片，最后將封好的切片置于Zeiss LSM 710共聚焦熒光顯微鏡下觀察并拍照分析。每顆心臟需取處于不同位置的三張切片進(jìn)行拍照，用ImageJ2x軟件分別計(jì)數(shù)EDU+DsRed+雙陽(yáng)性和DsRed+單陽(yáng)性的細(xì)胞數(shù)，并用前者除以后者算出相應(yīng)的心肌細(xì)胞增殖再生分?jǐn)?shù)，用統(tǒng)計(jì)學(xué)計(jì)算不同實(shí)驗(yàn)組間的差異性（如圖3所示）。

結(jié)果：切除斑馬魚(yú)手術(shù)21天后受傷心臟切除部位沉積大量血液和膠原蛋白；而從手術(shù)后暴露到含CDNG1或CDNG1A的水中的斑馬魚(yú)受損心臟部位僅有少量膠原沉淀，而表面大部分覆蓋心肌纖維，表明CDNGs可以加速斑馬魚(yú)心臟再生。PCNA免疫染色分析結(jié)果，與空白對(duì)照相比，CDNG1和CDNG1A治療處理過(guò)的受損心臟中心肌細(xì)胞增殖分?jǐn)?shù)分別增加57.7%和82.7%。且與CDNG1相比，CDNG1A誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞增殖指數(shù)提高了25%。EDU染色結(jié)果（圖3）顯示CDNGs通過(guò)加速心肌細(xì)胞增殖來(lái)加快心臟再生。與空白對(duì)照組相比，CDNG1和CDNG1A治療組心肌細(xì)胞增殖分?jǐn)?shù)分別增加112.5%和220.8%；而CDNG1A治療組又比CDNG1治療組促心肌細(xì)胞增值效果增高近一倍。

實(shí)施例4：CDNG1A促進(jìn)心梗小鼠心臟修復(fù)和增強(qiáng)心臟功能

小鼠：16周齡雄性C57BL/6J小鼠，平均體重25-30g/只；

步驟：20只和14只冠狀動(dòng)脈結(jié)扎手術(shù)模型小鼠分別用CDNG1A和PBS（空白對(duì)照）按照5mg/kg的劑量隔天腹腔注射給藥治療，共10次/21天為一周期。假手術(shù)組12只（空白手術(shù)對(duì)照）。采用超聲心電圖監(jiān)測(cè)技術(shù)分析心臟收縮功能。以乳突肌為參照點(diǎn)，采取隨機(jī)單盲方式對(duì)6次選定的心臟搏動(dòng)循環(huán)采集兩次獨(dú)立掃描并采集結(jié)果。末期舒張度（End-diastole）定義為左心室最大舒張尺度；末期收縮度（End-systole）定義為心臟后壁運(yùn)動(dòng)峰值。心臟縮短指數(shù)FS（Fractional shortening）以左心室尺寸計(jì)算，F(xiàn)S=（EDD-ESD）/EDD*100%，心室射血率（EF）則由二維心電圖直接計(jì)算。

結(jié)果：CDNG1A治療組左心室射血率為52.4%，PBS對(duì)照組為41.9%；CDNG1治療組心臟縮短指數(shù)縮小27.1%，對(duì)照組為20.8%。盡管相對(duì)假手術(shù)組而言，治療組心臟功能有一定程度損傷（74%射血率；68%心臟縮短指數(shù)），但CDNG1A治療組在心臟功能衡量的兩項(xiàng)指標(biāo)左心室射血率和心臟縮短指數(shù)FS上分別有25%、30%的改善。進(jìn)一步觀察末期左心室內(nèi)舒張尺寸（LVIDD）指標(biāo)發(fā)現(xiàn)，與空白組相比，CDNG1A治療組的LVIDD低出21.5%，說(shuō)明CDNG1A能阻止心梗發(fā)生后的心臟不正常肥大。一般情況下，心梗會(huì)導(dǎo)致心臟纖維化以及心臟重量增加。實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)與空白對(duì)照組相比，CDNG1A治療組心臟/體重的比值顯著降低14.3%。Masson三元染色實(shí)驗(yàn)證實(shí)在心梗模型小鼠心臟4種不同截面圖顯示，與假手術(shù)組和空白對(duì)照組相比，CDNG1A治療組心臟損傷部位疤痕和纖維化面積明顯降低。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明，本發(fā)明所述的CDNG1A能顯著改善心梗癥狀，提高受損心臟的功能，是有開(kāi)發(fā)和應(yīng)用前景的新型藥物候選物。

本發(fā)明提及的所有文獻(xiàn)都在本申請(qǐng)中引用作為參考，就如同每一篇文獻(xiàn)被單獨(dú)引用作為參考那樣。此外應(yīng)理解為，在閱讀了本發(fā)明的上述內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員基于常識(shí)有能力對(duì)本發(fā)明做各種改動(dòng)或修改，這些等價(jià)形式同樣落于本申請(qǐng)所附權(quán)利要求書(shū)所限定的范圍。