本發(fā)明涉及生物檢測(cè)領(lǐng)域，尤其涉及一種分析大豆鐮孢根腐真菌多樣性的檢測(cè)。

背景技術(shù)：

大豆根腐病(Soybean root rot)是大豆生產(chǎn)中分布范圍廣、危害嚴(yán)重、防治較為困難的一種真菌性土傳病害。大豆根腐病致病菌群體復(fù)雜多樣，鐮孢菌是其重要的致病類群之一。國(guó)內(nèi)外已報(bào)道的主要有腐皮鐮孢菌(Fusarium solani)、尖孢鐮孢菌(F.oxysporum)，禾谷鐮孢菌(F.graminearum)、木賊鐮孢菌(F.equiseti)、層生鐮孢菌(F.proliferatum)、假禾谷鐮孢菌(F.pseudoproliferatum)、燕麥鐮孢菌(F.avenaceum)、半裸鐮孢菌(F.semitectum)、F.tricinctum和F.armeniacum等。我國(guó)西南地區(qū)主要以腐皮鐮孢菌(F.solani)、尖孢鐮孢菌(F.oxysporum)，禾谷鐮孢菌(F.graminearum)和木賊鐮孢菌(F.equiseti)為大豆根腐病主要致病鐮孢菌。由于引起大豆根腐病的病原菌成分復(fù)雜，尤其是鐮孢菌的種類繁多，為實(shí)現(xiàn)大豆根腐病的快速檢測(cè)和有效防治，必須首先對(duì)大豆根腐病的致病菌，尤其是主要致病鐮孢菌的多樣性進(jìn)行分析。

傳統(tǒng)的鐮孢菌鑒定主要依據(jù)其形態(tài)培養(yǎng)特征及致病性檢測(cè)，不僅費(fèi)時(shí)、費(fèi)力、成本高、準(zhǔn)確性差，而且檢測(cè)者需具備較好的植物病理學(xué)專業(yè)背景?；贒NA序列的PCR擴(kuò)增技術(shù)為鐮孢菌的鑒定提供了較大幫助。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，PCR-RFLP、LAMP技術(shù)、RFLP-DGGP等PCR技術(shù)先后被應(yīng)用于大豆根腐病病原菌的檢測(cè)。以rDNA-ITS序列為代表的多個(gè)DNA分子標(biāo)記被用到鐮孢菌檢測(cè)中，但rDNA-ITS在鐮孢菌屬內(nèi)種間或復(fù)合種間相對(duì)保守，變異位點(diǎn)較少，不能很好地將各種致病鐮孢菌分開，例如O’Donnell等(2015)在研究用于鐮孢菌屬內(nèi)種間及復(fù)合種內(nèi)群體的多種DNA分子標(biāo)記時(shí)，亦發(fā)現(xiàn)rDNA-ITS在屬內(nèi)種間相對(duì)保守，不適合鐮孢菌的群體鑒定。而且目前方法多涉及單一鐮孢菌種的鑒定或檢測(cè)，考慮到大豆根腐病致病鐮孢菌的群體多樣性，目前亟需開發(fā)一系列用于鐮孢菌多樣性檢測(cè)的分子技術(shù)。

申請(qǐng)?zhí)枮?01310353895.2公開了一種用于分析大豆鐮孢根腐真菌多樣性的特異性引物，該申請(qǐng)僅利用一個(gè)特異性引物實(shí)現(xiàn)對(duì)多種致病菌的分析和檢測(cè)，其原理是基于酵母基因組中18sRNA基因設(shè)計(jì)一對(duì)特異引物，依據(jù)擴(kuò)增片段大小不同達(dá)到區(qū)分多種真菌的目的，但是由于該基因序列相對(duì)保守，序列之間差異較小的，雖然該申請(qǐng)檢測(cè)了11個(gè)相關(guān)真菌，但是不排除環(huán)境樣本中其他真菌亦可被擴(kuò)增出相同的條帶，從而無法確定是否存在相應(yīng)的致病菌，并且，由于該體系需要進(jìn)行普通PCR和DGGE分層兩個(gè)步驟，因此其檢測(cè)過程耗時(shí)長(zhǎng)達(dá)12h左右。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

為解決現(xiàn)有技術(shù)存在的技術(shù)問題，本發(fā)明提供一種方法簡(jiǎn)單，檢測(cè)時(shí)間短的分析大豆鐮孢根腐病真菌多樣性的特異性引物組，以及將其應(yīng)用于大豆根腐病檢測(cè)的方法，利用本發(fā)明提供的特異性引物組可以準(zhǔn)確、高效的判斷由鐮孢根腐真菌引起的大豆根腐病。

為實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的技術(shù)目的，本發(fā)明第一方面提供一種用于分析大豆鐮孢根腐真菌多樣性的特異性引物組，所述引物組包括：

具有如SEQ ID NO.1所示的第一正向引物；

具有如SEQ ID NO.2所示的第二正向引物；

具有如SEQ ID NO.3所示的第三正向引物；

具有如SEQ ID NO.4所示的第四正向引物中的一種或多種，以及

具有如SEQ ID NO.5所示的共用反向引物組成。

尤其是，本發(fā)明提供的特異性引物是基于EF-1α為目標(biāo)基因進(jìn)行設(shè)計(jì)得到的。

特別是，所述第一正向引物、第二正向引物、第三正向引物、第四正向引物可以分別擴(kuò)增出不同大小的條帶，每個(gè)條帶對(duì)應(yīng)不同的病原菌。

特別是，所述特異性引物組應(yīng)用于多重PCR檢測(cè)大豆根腐病的反應(yīng)體系為：體系總量10～50μL，包括待測(cè)樣本的DNA溶液2.0～4.0μL、正向引物1.5～4.0μL、反向引物1.5～4.0μL、Tap Master Mix聚合酶混合液5.0～25.0μL、超純水0～13.0μL。

優(yōu)選地，所述應(yīng)體系為：體系總量25μL，待測(cè)樣本的DNA溶液4.0μL、正向引物4.0μL、反向引物4.0μL、Tap Master Mix聚合酶混合液12.5μL、超純水0.5μL。

特別是，所述特異性引物應(yīng)用于多重PCR檢測(cè)大豆根腐病的反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性3min；94℃變性30s，52～56℃退火30s，72℃延伸30s，循環(huán)25～40次；72℃終延伸5min。

優(yōu)選地，所述反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性3min；94℃變性30s，54℃退火30s，72℃延伸30s，循環(huán)30次；72℃終延伸5min。

為實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的技術(shù)目的，本發(fā)明第二方面提供一種檢測(cè)大豆鐮孢根腐真菌的試劑盒，其具有第一方面所述特異性引物組。

其中，所述試劑盒的體系總量為10～50μL，包括待測(cè)樣本的DNA溶液2.0～4.0μL、正向引物1.5～4.0μL、反向引物1.5～4.0μL、Tap Master Mix聚合酶混合液5.0～25.0μL、超純水0～13.0μL。

優(yōu)選的，所述試劑盒的體系總量為25μL，待測(cè)樣本的DNA溶液4.0μL、正向引物4.0μL、反向引物4.0μL、Tap Master Mix聚合酶混合液12.5μL、超純水0.5μL。

其中，使用所述試劑盒的反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性3min；94℃變性30s，52～56℃退火30s，72℃延伸30s，循環(huán)25～40次；72℃終延伸5min。

優(yōu)選地，所述使用試劑盒的反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性3min；94℃變性30s，54℃退火30s，72℃延伸30s，循環(huán)30次；72℃終延伸5min。

特別是，所述試劑盒不但可以根據(jù)反應(yīng)結(jié)果得到的條帶確定大豆發(fā)生鏈孢根腐病，還可以根據(jù)條帶數(shù)量和條帶大小可以判斷大豆鐮孢根腐真菌的數(shù)量和種類。

例如，當(dāng)條帶大小為172bp時(shí)，可以判斷大豆感染腐皮鐮孢菌(F.solani)；當(dāng)條帶大小為269bp時(shí)，可以確定大豆感染木賊鐮孢菌(F.equiseti)；當(dāng)條帶大小為376bp時(shí)，可以判斷大豆染有禾谷鐮孢菌(F.graminearum)；當(dāng)條帶大小為570bp時(shí)，可以判斷大豆感染尖孢鐮孢菌(F.oxysporum)。

為實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的技術(shù)目的，本發(fā)明第三方面提供一種檢測(cè)大豆根腐病的方法，使用第一方面所述的特異性引物組對(duì)待測(cè)樣本的DNA進(jìn)行多重PCR檢測(cè)，若瓊脂凝膠電泳出現(xiàn)條帶，則判斷待測(cè)樣本發(fā)生了根腐病。

特別是，該方法還可以根據(jù)根據(jù)條帶數(shù)量和條帶大小可以判斷大豆鐮孢根腐真菌的數(shù)量和種類。當(dāng)條帶大小為172bp時(shí)，可以判斷大豆感染腐皮鐮孢菌(F.solani)；當(dāng)條帶大小為269bp時(shí)，可以確定大豆感染木賊鐮孢菌(F.equiseti)；當(dāng)條帶大小為376bp時(shí)，可以判斷大豆染有禾谷鐮孢菌(F.graminearum)；當(dāng)條帶大小為570bp時(shí)，可以判斷大豆感染尖孢鐮孢菌(F.oxysporum)。

其中，所述第一方面的特異性引物組對(duì)待測(cè)樣本的DNA進(jìn)行多重PCR檢測(cè)的反應(yīng)體系為：

其中，所述試劑盒的體系總量為10～50μL，待測(cè)樣本的DNA溶液2.0～4.0μL、正向引物1.5～4.0μL、反向引物1.5～4.0μL、Tap Master Mix聚合酶混合液5.0～25.0μL、超純水0～13.0μL。

優(yōu)選的，所述試劑盒的體系總量為25μL，待測(cè)樣本的DNA溶液4.0μL、正向引物4.0μL、反向引物4.0μL、Tap Master Mix聚合酶混合液12.5μL、超純水0.5μL。

其中，使用所述試劑盒的反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性3min；94℃變性30s，52～56℃退火30s，72℃延伸30s，循環(huán)25～40次；72℃終延伸5min。

優(yōu)選地，所述使用試劑盒的反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性3min；94℃變性30s，54℃退火30s，72℃延伸30s，循環(huán)30次；72℃終延伸5min。

為實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的技術(shù)目的，本發(fā)明第四方面提供一種檢測(cè)大豆鏈孢根腐病的方法，使用第二方面所述的試劑盒對(duì)待測(cè)樣本的DNA進(jìn)行檢測(cè)，若瓊脂凝膠電泳出現(xiàn)條帶，則判斷待測(cè)樣本發(fā)生了大豆鏈孢根腐病。

本發(fā)明的有益效果：

1、由于本發(fā)明提供的特異性引物組是根據(jù)多種大豆根腐病鐮孢菌的延伸因子EF-1α基因序列比對(duì)后得到的，特異性強(qiáng)，靈敏度高，最高檢測(cè)濃度可達(dá)10^-8，因此可以準(zhǔn)確、高效的判斷由鐮孢根腐真菌引起的大豆根腐病。

2、本發(fā)明提供的特異性引物組不但可以準(zhǔn)確高效的判斷由鐮孢菌引起大豆根腐病，還可以直觀的判斷病原菌的數(shù)量與種類。

3、利用本發(fā)明方法對(duì)由鐮孢菌引起的大豆根腐病進(jìn)行檢測(cè)，僅需要1.92h，為現(xiàn)有技術(shù)的1/10倍。

4、本發(fā)明方法檢測(cè)步驟簡(jiǎn)單，成本低廉，普適性廣。

附圖說明

圖1是本發(fā)明進(jìn)行單重PCR檢測(cè)四種大豆根腐病致病鐮孢菌引物的特異性電泳結(jié)果；

圖2是本發(fā)明利用混合體系檢測(cè)鐮孢菌引物的特異性及多重PCR建立的電泳結(jié)果；

圖3是多重PCR體系對(duì)單一待測(cè)樣本的靈敏度檢測(cè)的電泳結(jié)果；

圖4是多重PCR體系對(duì)多個(gè)待測(cè)樣本的靈敏度檢測(cè)的電泳結(jié)果；

圖5是模擬大豆鐮孢根腐病環(huán)境樣本的多重PCR驗(yàn)證的電泳結(jié)果；

圖6是其他非大豆致病鐮孢菌環(huán)境樣本的多重PCR驗(yàn)證的電泳結(jié)果。

具體實(shí)施方式

為了能夠更清楚地理解本發(fā)明的上述目的、特征和優(yōu)點(diǎn)，下面結(jié)合附圖和具體實(shí)施方式對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步的詳細(xì)描述。

在下面的描述中闡述了很多具體的細(xì)節(jié)以便于充分理解本發(fā)明，但是，本發(fā)明還可以采用其他不同于在此描述的其他方式來實(shí)施，因此，本發(fā)明并不限于下面公開的具體實(shí)施例的限制。

試劑及儀器：核酸染料、瓊脂糖、蛋白酶K、Taq PCR Master Mix、DNA Marker 600等購自生工生物工程(上海)股份有限公司；臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)(Eppendorf，5424R，上海)、PCR擴(kuò)增儀(ThermaL Cy-cLer，1000TM，Bio-Rad)、電泳儀(DYY-6C型，北京六一儀器廠)、凝膠成像儀(ΜniversaL Hood II，Bio-Rad)、超微量分光光度計(jì)(Thermo Scientific，Nanodrop2000，美國(guó))；其余常規(guī)試劑均為分析純，購自成都博大泰克生物公司。

實(shí)施例1特異性引物

1、特異性引物的獲得

利用延伸因子EF-1α基因序列的通用引物EF1/EF2對(duì)不同的大豆根腐病的致病鐮孢菌進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得多種大豆根腐病致病鐮孢菌的EF-1α基因序列并提交GenBank，基因登錄號(hào)分別為KX966232、KX966220、KX966207和KX966200。根據(jù)鐮孢菌的EF-1α基因序列，采用引物設(shè)計(jì)軟件如Vector NTI 11.0software(Invitrogen，USA)或NCBI在線平臺(tái)(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)進(jìn)行序列比對(duì)，尋找差異位點(diǎn)，根據(jù)差異位點(diǎn)分別設(shè)計(jì)4種病原菌的擴(kuò)增片段大小存在明顯差異的特異引物，得到SEQ ID NO.1～4的所示特異引物序列，反向引物設(shè)計(jì)在保守區(qū)段，得到SEQ ID NO.5所示的共用反向引物。利用NCBI Blast對(duì)各引物進(jìn)行參數(shù)檢測(cè)，由生物公司合成，合成的引物用ddH₂O溶解為10μmol/L用于PCR擴(kuò)增。其中，本發(fā)明所用的大豆根腐病的致病鐮孢菌為大豆根腐病的主要致病菌，即木賊鐮孢菌(F.equiseti)、尖孢鐮孢菌(F.oxysporum)、腐皮鐮孢菌(F.solani)、禾谷鐮孢菌(F.graminearum)，其EF-1α基因序列可從GenBank獲得，也可以由實(shí)驗(yàn)室自行分離鑒定獲得，其中，經(jīng)實(shí)驗(yàn)室自行分離獲得的菌株經(jīng)形態(tài)觀察致病性檢測(cè)、以及基于rDNA-ITS、EF1-α和RPB1基因序列的分子鑒定，均與公開的木賊鐮孢菌(F.equiseti)、尖孢鐮孢菌(F.oxysporum)、腐皮鐮孢菌(F.solani)、禾谷鐮孢菌(F.graminearum)一致。

其中，獲得的特異引物如表1所示。

注：SEQ ID NO.1-4為各鐮孢菌正向特異引物；SEQ ID NO.5為各鐮孢菌通用反向引物。

經(jīng)鑒定，如SEQ ID NO.1-4所示的正向特異引物分別鑒定不同的鐮孢菌真菌，其所對(duì)應(yīng)的鐮孢菌真菌如表2所示，根據(jù)其所鑒定的不同真菌將其定義：

表2不同正向特異引物及其特性

在多重PCR擴(kuò)增體系的建立過程中，目的片段的選擇和引物設(shè)計(jì)是首要的、關(guān)鍵性的步驟。多重PCR技術(shù)要實(shí)現(xiàn)在同一反應(yīng)體系中擴(kuò)增多個(gè)目的條帶，其擴(kuò)增引物除對(duì)引物長(zhǎng)度、G+C％、二級(jí)結(jié)構(gòu)及二聚體等一般PCR引物設(shè)計(jì)的要求外，還須滿足特異性強(qiáng)、相容性好、擴(kuò)增獲得的目的片段大小差異較大，電泳結(jié)果肉眼容易區(qū)分等特點(diǎn)。本實(shí)驗(yàn)為建立4種大豆根腐病致病鐮孢菌的多重PCR擴(kuò)增體系，前期分別選擇鐮孢菌的核糖體轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)序rDNA-ITS和翻譯延長(zhǎng)因子EF-1α序列進(jìn)行分析比對(duì)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)4種鐮孢菌的rDNA-ITS無較多可變區(qū)域，引物設(shè)計(jì)較困難，而EF-1α序列則變異位點(diǎn)區(qū)域較多。因此，本發(fā)明人基于大量的實(shí)驗(yàn)論證發(fā)現(xiàn)，以EF-1α為目標(biāo)基因用于引物設(shè)計(jì)，可以實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的技術(shù)目的。發(fā)明人通過對(duì)4種致病鐮孢菌及其他非致病鐮孢菌的翻譯延伸因子EF-1α基因序列進(jìn)行比對(duì)，選擇變異位點(diǎn)較多的區(qū)段作為4種鐮孢菌的各自正向引物設(shè)計(jì)位點(diǎn)，選擇與其他非致病鐮孢菌有差異的位點(diǎn)區(qū)段用作共用反向引物，既兼顧了4種鐮孢菌引物特異性，又避免了今后用于環(huán)境樣品檢測(cè)過程中其他非致病鐮孢菌的干擾，結(jié)果表明，所涉及的引物特異性好，相互間無干擾，適合多重PCR體系對(duì)引物的要求。

2、多重PCR反應(yīng)體系

10μL體系如下：

25μLl體系如下：

50μL體系如下：

3、反應(yīng)體系的反應(yīng)條件

94℃預(yù)變性3min；94℃變性30s，54℃退火30s，72℃延伸30s，30個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸5min。

其中，退火溫度在52～56℃范圍內(nèi)都可以實(shí)現(xiàn)PCR的擴(kuò)增，例如將退火溫度分別設(shè)定為52℃、53℃、55℃、56℃；

其中，反應(yīng)程序中循環(huán)次數(shù)在25～40次均可以實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的目的，例如將循環(huán)次數(shù)設(shè)為25次、35次和40次。

實(shí)施例2特異性引物的特異性檢測(cè)

1、待測(cè)樣本的獲得與培養(yǎng)

選取本實(shí)驗(yàn)室從大豆根腐病病株根部經(jīng)分離和鑒定獲得的尖孢鐮孢菌(F.oxysporum)、腐皮鐮孢菌(F.solani)、木賊鐮孢菌(F.eqμiseti)和禾谷鐮孢菌(F.graminearum)四種致病菌的純化菌株作為待試樣本。

將上述4種供試鐮孢菌的單孢純化菌株，分別接種到馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(馬鈴薯200g、葡萄糖10g、瓊脂粉20g，PDA)PDA培養(yǎng)基上，置于25～28℃溫箱中培養(yǎng)3～5天，并保存待用。

2、DNA的提取

采用CTAB法提取鐮孢菌DNA。具體步驟如下：刮取PDA培養(yǎng)基上菌絲于研缽中，在液氮中研磨至粉末狀放入2mL離心管，加入1mL 65℃預(yù)熱的CTAB和2μLβ-巰基乙醇，充分混勻后，65℃，水浴45min；取出離心管冷卻后，加入等體積的氯仿:異戊醇(24:1，V/V)，溫和搖勻10min后，10 000r/min離心10min；取上清液，加入等體積氯仿:異戊醇(24:1，V/V)，重復(fù)1～2次；收集上清液至離心管后，迅速加入預(yù)先冷凍的異丙醇至滿管，置于-20℃冰箱中冷凍2h后，10 000r/min離心10min；棄上清液，加入1mL 75％乙醇，8000r/min離心5min；棄上清液，加入1mL無水乙醇，8000r/min離心5min，棄上清液，重復(fù)1～2次；將離心管打開，在超凈工作臺(tái)中晾干，加入40μL ddH₂O溶解DNA，放入-20℃冰箱中保存待用。

3、單一PCR擴(kuò)增的特異性檢測(cè)

分別利用SEQ ID NO.1所示的正向引物和SEQ ID NO.5所示的反向引物對(duì)木賊鐮孢菌(F.equiseti)病原菌進(jìn)行PCR擴(kuò)增、利用SEQ ID NO.2所示的正向引物和SEQ ID NO.5所示的反向引物對(duì)禾谷鐮孢菌(F.graminearum)病原菌進(jìn)行PCR擴(kuò)增、利用SEQ ID NO.3所示的正向引物和SEQ ID NO.5所示的反向引物對(duì)尖孢鐮孢菌(F.oxysorum)病原菌進(jìn)行PCR擴(kuò)增、利用SEQ ID NO.4所示的正向引物和SEQ ID NO.5所示的反向引物對(duì)腐皮鐮孢菌(F.solani)病原菌進(jìn)行PCR擴(kuò)增。

反應(yīng)體系為25μL：12.5μL Taq PCR Master Mix，1.0μL鐮孢菌DNA，1.0μL正向引物，1.0μL反向引物，補(bǔ)ddH₂O至25μL，以ddH₂O為模版作為陰性對(duì)照。

PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性3min；94℃變性30s，54℃退火30s，72℃延伸30s，30個(gè)循環(huán)；72℃延伸5min。采用2％瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，依據(jù)條帶大小確定鐮孢菌的種，從而驗(yàn)證引物的特異性，電泳結(jié)果如圖1所示。

從圖1中可以看出，利用本申請(qǐng)的不同特異性引物對(duì)分別對(duì)木賊鐮孢菌(F.equiseti)、尖孢鐮孢菌(F.oxysporum)、腐皮鐮孢菌(F.solani)、禾谷鐮孢菌(F.graminearum)進(jìn)行檢測(cè)，分別獲得F.solani為172bp、F.equiseti為269bp、F.graminearum為376bp和F.oxysorum為570bp，擴(kuò)增條帶唯一均較亮，無雜帶干擾，而且各片段大小適中容易區(qū)分，表明基于EF-1α基因序列設(shè)計(jì)獲得引物特異性好。

4、多重PCR擴(kuò)增的特異性檢測(cè)

將如SEQ ID NO.1-4所示的正向引物以體積比1:1:1:1混合，以及SEQ ID NO.5所示的反向引物作為共用反向引物，建立混合擴(kuò)增體系，分別將1種、2種、3種、4種病原菌DNA混合后作為模板，其中混合比例為1:1或1:1:1或1:1:1:1，檢測(cè)本申請(qǐng)?zhí)峁┑囊锏奶禺愋浴?/p>

其中，PCR反應(yīng)體系為25μL：12.5μL Taq PCR Master Mix，DNA依據(jù)上述設(shè)計(jì)的模板加入，DNA模板的總用量為4.0μL，4.0μL混合正向引物，4.0μL通用反向引物SEQ ID NO.5，用ddH₂O至25μL。

其中，反應(yīng)條件是：反應(yīng)程序94℃預(yù)變性3min；94℃變性30s，54℃退火30s，72℃延伸30s，30個(gè)循環(huán)；72℃延伸5min。采用2％瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，得到如圖2所示的檢測(cè)結(jié)果。

根據(jù)圖2中2-1圖的檢測(cè)結(jié)果可知，2-1圖中的泳道1～4分別與泳道N(即ddH₂O對(duì)照)相比，以單一鐮孢菌DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增(1～4泳道)均能擴(kuò)增出對(duì)應(yīng)鐮孢菌的特異條帶，且無雜帶出現(xiàn)，表明混合引物體系對(duì)各鐮孢菌PCR擴(kuò)增無影響，在該體系下的引物特異性好。

根據(jù)圖2中2-2圖的檢測(cè)結(jié)果可知，在混合引物體系下，分別加入1種、2種、3種、4種病原菌的DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增(編號(hào)6～9)，均擴(kuò)增出了相應(yīng)的鐮孢菌目的條帶，各條帶較亮，且無其他雜帶干擾，由此說明4對(duì)引物特異性較好，DNA和引物之間均不存在交叉和相互干擾。同時(shí)，以4對(duì)特異引物和4種DNA混合(編號(hào)5和9)，所擴(kuò)增條帶清晰，無雜帶，符合多重PCR體系要求，可見混合的特性引物組的特異性和靈敏度均不受影響，依然可以檢測(cè)到不同的鐮孢根腐真菌。

實(shí)施例3特異性引物的靈敏度檢測(cè)

將單一鐮孢菌的DNA(100ng/μL)，用Nanodrop 2000超微量分光光度計(jì)檢測(cè)其濃度，將混合DNA濃度調(diào)整至100ng/μL，然后10梯度稀釋為10^-1、10^-2、10^-3、10^-4、10^-5、10^-6、10⁷、10^-8、10^-9、10^-10、10^-11、10^-12、10^-13不同濃度梯度，利用本發(fā)明提供的如SEQ ID NO.1～4所示的正向引物以體積比1:1:1:1混合，以及SEQ ID NO.5所示的反向引物作為共用反向引物，以及建立的多重PCR體系進(jìn)行擴(kuò)增及電泳檢測(cè)，得到如圖3所示的電泳結(jié)果，根據(jù)圖3所示的電泳圖可知，當(dāng)DNA稀釋為10^-8倍時(shí)，依然可以見到的鐮孢菌?？梢姡鄬?duì)于現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明的特異性引物的靈敏度遠(yuǎn)高于常用的引物測(cè)定的100倍。

將鐮孢菌混合DNA(100ng/μL)，用Nanodrop 2000超微量分光光度計(jì)檢測(cè)其濃度，將混合DNA濃度調(diào)整至100ng/μL，然后10梯度稀釋為10^-1、10^-2、10^-3、10^-4共5個(gè)濃度梯度，利用本發(fā)明提供的如SEQ ID NO.1～4所示的正向引物以體積比1:1:1:1混合、SEQ ID NO.5所示的反向引物作為共用反向引物，以及建立的多重PCR體系進(jìn)行擴(kuò)增及電泳檢測(cè)，得到如圖4所示的電泳結(jié)果，根據(jù)圖4所示的電泳圖可知，當(dāng)混合DNA稀釋為10^-1和10^-2倍時(shí)，可同時(shí)檢測(cè)到4種病原菌，但稀釋至10^-3和10^-4倍時(shí)，不能同時(shí)檢測(cè)到4種病原菌，因此該多重PCR的靈敏度可達(dá)到10^-2，即混合DNA的最低濃度為0.1ng/μL。

可見，本發(fā)明的特異性引物組對(duì)于單獨(dú)的還是混合的樣品都可以準(zhǔn)確的檢測(cè)出不同的鐮孢菌，特異性強(qiáng)、相容性好、而且對(duì)于混合樣品進(jìn)行的多重PCR擴(kuò)增獲得的目的片段大小差異較大，電泳結(jié)果肉眼容易區(qū)分，將本發(fā)明的特異性引物應(yīng)用于由鐮孢菌引起的大豆根腐病的檢測(cè)可以快速分辨出引起大豆根腐病的菌株，并根據(jù)檢測(cè)結(jié)果所顯示的條帶大小就可以確定病原菌種類，從而為大豆根腐病的綜合防治提供依據(jù)。

對(duì)照例1

模擬大豆根腐病接種的環(huán)境樣本進(jìn)行多重PCR體系驗(yàn)證，分別提取木賊鐮孢菌(F.equiseti)與大豆苗的混合后的DNA，木賊鐮孢菌DNA，禾谷鐮孢菌(F.graminearum)和大豆苗的混合后的DNA、禾谷鐮孢菌DNA、尖孢鐮孢菌(F.oxysporum)和大豆苗的混合后的DNA、尖孢鐮孢菌DNA、腐皮鐮孢菌(F.solani)和大豆苗混合后的DNA，腐皮鐮孢菌DNA，四個(gè)菌(木賊鐮孢菌、禾谷鐮孢菌、尖孢鐮孢菌、腐皮鐮孢菌)和大豆苗的混合后的DNA，木賊鐮孢菌、禾谷鐮孢菌、尖孢鐮孢菌和腐皮鐮孢菌的混合后的DNA作為待測(cè)樣本，并設(shè)置大豆豆苗的DNA作為對(duì)照，以ddH₂O為陰性對(duì)照，利用本發(fā)明提供的特異性引物組以及多重PCR反應(yīng)體系、多重PCR反應(yīng)條件進(jìn)行檢測(cè)，得到如圖5所示的檢測(cè)結(jié)果。

圖中，M：DNA Marker；1～10：各樣品混合后再提DNA進(jìn)行PCR驗(yàn)證，并分別以鐮孢菌為對(duì)照，依次為木賊鐮孢菌(F.equiseti)+大豆苗，木賊鐮孢菌，禾谷鐮孢菌(F.graminearum)+大豆苗，禾谷鐮孢菌，尖孢鐮孢菌(F.oxysporum)+大豆苗，尖孢鐮孢菌，腐皮鐮孢菌(F.solani)+大豆苗，腐皮鐮孢菌，木賊鐮孢菌+禾谷鐮孢菌+尖孢鐮孢菌+腐皮鐮孢菌+大豆苗，木賊鐮孢菌+禾谷鐮孢菌+尖孢鐮孢菌+腐皮鐮孢菌；CK：大豆豆苗DNA作為對(duì)照；N：陰性對(duì)照ddH2O。

根據(jù)檢測(cè)結(jié)果可知，與鐮孢菌DNA相比，大豆黃花苗和各鐮孢菌菌絲混合后提取的DNA樣品經(jīng)多重PCR擴(kuò)增后，均能擴(kuò)增出各鐮孢菌的特異條帶，且4種鐮孢菌菌絲與大豆豆苗混合DNA亦清晰地?cái)U(kuò)增出了4條鐮孢菌條帶。同時(shí)，考慮到大豆黃花苗與鐮孢菌混合提取DNA過程中，可能存在大量的大豆蛋白質(zhì)影響多重PCR體系對(duì)鐮孢菌的特異性擴(kuò)增，本實(shí)驗(yàn)還設(shè)置了大豆DNA和鐮孢菌DNA的混合DNA樣本用作對(duì)照，結(jié)果表明，經(jīng)優(yōu)化的CTAB法提取獲得的混合材料DNA質(zhì)量較好，無蛋白污染，表明該多重PCR體系可特異性地鑒定出環(huán)境樣本中的致病鐮孢菌。

對(duì)照例2

設(shè)置木賊鐮孢菌，禾谷鐮孢菌，尖孢鐮孢菌，腐皮鐮孢菌，色二孢菌(Lasiodiplodia theobromae)，稻黑孢菌(Nigrospora oryzae)，細(xì)極鏈格孢菌(Alternaria tenuissima)，層生鐮刀菌(F.proliferatum)，大豆種腐病菌(Diaporthe longicolla)的DNA作為待測(cè)樣本利用本發(fā)明提供的特異性引物組以及多重PCR反應(yīng)體系、多重PCR反應(yīng)條件進(jìn)行檢測(cè)，得到如圖5中5-1所示的檢測(cè)結(jié)果；并設(shè)置木賊鐮孢菌，禾谷鐮孢菌，尖孢鐮孢菌，腐皮鐮孢菌，木霉屬(Trichoderma simmonsii)、腐霉菌(Pythium ultimum Trow)、疫霉菌(Phytophthora sojae)、木霉屬(Trichoderma pyramidale)、木霉屬(Trichoderma rossicum)、立枯絲核菌(Rhizoctonia solani)、炭疽菌(Colletotrichum spp.)的DNA作為待測(cè)樣本利用本發(fā)明提供的特異性引物組以及多重PCR反應(yīng)體系、多重PCR反應(yīng)條件進(jìn)行檢測(cè)，設(shè)置ddH2O為陰性對(duì)照，得到如圖5中5-2所示的檢測(cè)結(jié)果。

圖中，M：DNA Marker；1～4：木賊鐮孢菌，禾谷鐮孢菌，尖孢鐮孢菌，腐皮鐮孢菌；5～10：F.commune，色二孢菌(Lasiodiplodia theobromae)，稻黑孢菌(Nigrospora oryzae)，細(xì)極鏈格孢菌(Alternaria tenuissima)，層生鐮刀菌(F.proliferatum)，大豆種腐病菌(Diaporthe longicolla)；11～14：木賊鐮孢菌，禾谷鐮孢菌，尖孢鐮孢菌，腐皮鐮孢菌；15～18：木霉菌(Trichoderma simmonsii)；19：木霉菌(Trichoderma pyramidale)；20：木霉菌(Trichoderma rossicum)；21：腐霉菌(Pythium ultimum Trow)；22：大豆疫霉菌(Phytophthora sojae)；23：立枯絲核菌(Rhizoctonia solani)；24：炭疽菌(Colletotrichum spp.)；N：陰性對(duì)照ddH₂O。

根據(jù)圖5所示的電泳結(jié)果可知，表示木賊鐮孢菌，禾谷鐮孢菌，尖孢鐮孢菌，腐皮鐮孢菌的1-4和11-14條帶均能檢測(cè)出來，其他非鐮孢菌均無法得到明亮的條帶，可見本發(fā)明的特異性引物特異性好，進(jìn)一步表明該多重PCR體系引物的特異性，可保證后期環(huán)境樣本檢測(cè)的準(zhǔn)確性。

以上所述僅為本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例而已，并不用于限制本發(fā)明，對(duì)于本領(lǐng)域的技術(shù)人員來說，本發(fā)明可以有各種更改和變化。凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)，所作的任何修改、等同替換、改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之類。

序列表

<110> 四川農(nóng)業(yè)大學(xué)

<120>用于分析大豆鐮孢根腐真菌多樣性的特異性引物組、試劑盒及其應(yīng)用

<160> 5

<170>PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 21

<212> DNA

<213>人工序列

CTTATACCCCGCTACTCGAGT 21

<210> 2

<211> 18

<212> DNA

<213>人工序列

ATTCGAATCGCCCTCACA 18

<210> 3

<211> 22

<212> DNA

<213>人工序列

GTCGACCACATGTGAGTACTCT 22

<210> 4

<211> 19

<212> DNA

<213>人工序列

CAGACGCTAACCGGTCCA 19

<210> 5

<211> 23

<212> DNA

<213>人工序列

CAACATACCAATGACGGTGAC 23