本發(fā)明涉及生物學(xué)領(lǐng)域中敏感細(xì)胞亞克隆的制備技術(shù)，特別涉及一種用于增強(qiáng)PPRV復(fù)制的敏感細(xì)胞亞克隆Vero/Slam/V的制備方法。

背景技術(shù)：

小反芻獸疫(Peste des petits ruminants,PPR)由小反芻獸疫病毒(Peste des petits ruminants virus，PPRV)引起，以高熱(40℃以上)、結(jié)膜炎、眼、鼻黏液性或膿性分泌物、口腔潰瘍、咳嗽、惡臭的腹瀉為主要臨床特征，肺炎和出血性腸炎為主要病理變化的急性、熱性、高度接觸性傳染病。該病屬于副黏病毒科(Paramyxo-viridae)麻疹病毒屬(Morbillivirus)的成員，同屬的還有牛瘟病毒(Rinderpestvirus,RPV)、犬瘟熱病毒(Canine distemper virus,CDV)、海豹瘟病毒(Porpoise distemper，PDV)、海豚瘟病毒(Dolphin distemper，DDV)和麻疹病毒(Measles Virus,MV)。病毒分離和鑒定是當(dāng)前流行PPRV毒株生物學(xué)特性研究的基礎(chǔ)，但PPRV在Vero、BHK-21、PK-15等常用的細(xì)胞系上或不易適應(yīng)，或不產(chǎn)生典型細(xì)胞病變(CPE)，或傳代幾次后病毒丟失，分離率較低，影響和限制了對PPRV野毒株的分離、生物學(xué)特性和致病機(jī)制的研究。因此，建立易于PPRV培養(yǎng)增殖的敏感細(xì)胞，對開展PPRV的深入研究和疫苗毒生產(chǎn)都具有重要的應(yīng)用價(jià)值。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是克服現(xiàn)有技術(shù)難以分離到高滴度小反芻獸疫病毒的不足，構(gòu)建靶向小反芻獸疫病毒特定細(xì)胞受體的慢病毒載體介導(dǎo)穩(wěn)定整合的一種用于增強(qiáng)PPRV復(fù)制的敏感細(xì)胞亞克隆Vero/Slam/V的制備方法。

為解決上述問題，本發(fā)明采用了下述技術(shù)方案：

一種用于增強(qiáng)PPRV復(fù)制的敏感細(xì)胞亞克隆Vero/Slam/V的制備方法，包括山羊信號淋巴細(xì)胞激活分子Slam/V引物序列，通過構(gòu)建山羊Slam/V慢病毒表達(dá)載體，獲得Slam/V復(fù)制缺陷型慢病毒樣粒子，以獲得的Slam/V慢病毒樣粒子感染Vero靶標(biāo)細(xì)胞，篩選穩(wěn)定表達(dá)Slam/V的Vero陽性細(xì)胞亞克隆，驗(yàn)證陽性細(xì)胞亞克隆Vero/Slam/V表達(dá)的Slam活性、遺傳穩(wěn)定性及其對PPRV復(fù)制的增殖效果。

所述序列SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:2包括：

SEQ ID NO.1:GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTTAATGCTAGATCTGCGGAAAGGTGACT,

SEQ ID NO.2:GGGGACAACTTTTGTATACAAAGTTGTGGCATGCTGAGGGCCAAGAGTGAG。

所述Slam/V慢病毒表達(dá)載體構(gòu)建，包括Slam/V與pDONR^TM221供體載體進(jìn)行B、P位點(diǎn)重組獲得入門載體pDONR/Slam/V，以及pDONR/Slam/V與pLenti6.2/V5-DEST^TMVector表達(dá)載體進(jìn)行L、R位點(diǎn)重組獲得表達(dá)克隆pDEST/Slam/V。

所述Slam/V完整慢病毒的獲得，是將pDEST/Slam/V質(zhì)粒與包裝混合物pLP1、pLP2及VSV-G共同轉(zhuǎn)染人胚腎細(xì)胞株293-FT，收獲細(xì)胞上清，獲得具有感染性的Slam/V復(fù)制缺陷型慢病毒樣粒子。

所述Vero/Slam/V陽性敏感細(xì)胞亞克隆，以獲得的Slam/V慢病毒樣粒子感染Vero細(xì)胞，并采用殺稻瘟菌素blasticidin進(jìn)行抗性篩選，獲得穩(wěn)定表達(dá)Slam/V的Vero陽性細(xì)胞亞克隆。

所述Vero/Slam/V陽性細(xì)胞亞克隆提高小反芻獸疫病毒復(fù)制效果的驗(yàn)證方法，采用靶標(biāo)基因擴(kuò)增、間接免疫熒光、western-blot免疫印跡檢測技術(shù)及致細(xì)胞病變效應(yīng)等技術(shù)分別驗(yàn)證slam/V基因組整合、轉(zhuǎn)錄，slam/V蛋白表達(dá)、反應(yīng)活性以及PPRV在表達(dá)slam/V陽性細(xì)胞亞克隆上的增殖效果。

本發(fā)明Vero/slam/V功能區(qū)敏感細(xì)胞亞克隆的制備及驗(yàn)證方法的具體步驟如下：

a.設(shè)計(jì)并合成針對Slam/V功能區(qū)的引物，該引物帶有與載體P位點(diǎn)匹配的B位點(diǎn)同源臂；

b.分離山羊外周血淋巴細(xì)胞，提取其總RNA；

c.擴(kuò)增Slam/V功能區(qū)，并與pDONR^TM221供體載體利用BP ⅡEnzyme Mix酶進(jìn)行B、P位點(diǎn)同源重組，重組物轉(zhuǎn)化One Mach1^TM T1^R Chemically Competent Cells感受態(tài)細(xì)胞，挑選陽性克隆，測序檢驗(yàn)序列的保真性，獲得入門載體pDONR/Slam/V；

d.將上述pDONR/Slam/V與pLenti6.2/V5-DEST^TMVector表達(dá)載體通過LRⅡplus Enzyme Mix酶進(jìn)行L、R位點(diǎn)同源重組，獲得表達(dá)骨架pDEST/Slam/V；

e.獲得的表達(dá)骨架pDEST/Slam/V質(zhì)粒與Packaging Mix pLP1、pLP2及VSV-G共轉(zhuǎn)染293-FT細(xì)胞，獲得Slam/V復(fù)制缺陷型慢病毒樣粒子；

f.用上述獲得的Slam/V復(fù)制缺陷型慢病毒樣粒子感染Vero細(xì)胞；

g.blasticidin抗性篩選，獲得表達(dá)Slam/V功能區(qū)的Vero陽性細(xì)胞亞克??；

h.分別用靶標(biāo)基因擴(kuò)增、間接免疫熒光、western-blot免疫印跡檢測技術(shù)及致細(xì)胞病變效應(yīng)等技術(shù)分別驗(yàn)證slam/V基因組整合、轉(zhuǎn)錄，slam/V蛋白表達(dá)、反應(yīng)活性以及PPRV在表達(dá)slam/V陽性細(xì)胞亞克隆上的增殖效果。

淋巴細(xì)胞信號活化因子(Signaling lymphocyte activation molecule，SLAM，又稱CD150)是PPRV感染的細(xì)胞受體，具有免疫球蛋白超家族的兩個(gè)特征性結(jié)構(gòu)域：N端的V結(jié)構(gòu)域和C端的C2結(jié)構(gòu)域，其中V結(jié)構(gòu)域是與病毒蛋白結(jié)合的功能區(qū)，包含與病毒蛋白特異性結(jié)合的關(guān)鍵氨基酸位點(diǎn)。因此，表達(dá)Slam/V功能區(qū)的受體的確可以提高細(xì)胞分離病毒的敏感性，但是國內(nèi)目前沒有可以提高小反芻獸疫分離的敏感細(xì)胞。故選用Slam/V結(jié)構(gòu)域作為靶標(biāo)建立PPRV敏感細(xì)胞。

鑒于此，本發(fā)明借助慢病毒表達(dá)系統(tǒng)，采用Gateway技術(shù)將山羊Slam/V功能區(qū)基因穩(wěn)定整合在Vero細(xì)胞基因組染色體上，通過殺稻瘟菌素blasticidin抗性篩選獲得永久表達(dá)Slam/V功能區(qū)的穩(wěn)定細(xì)胞亞克隆，為小反芻獸疫病毒分離、鑒定提供可靠工具，也為PPRV感染過程、致病機(jī)制等研究奠定基礎(chǔ)，對開展PPRV的深入研究和疫苗毒生產(chǎn)都具有重要的應(yīng)用價(jià)值。具體體現(xiàn)如下：

第一、使用BP和LR兩個(gè)反應(yīng)構(gòu)成的Gateway技術(shù)快速、準(zhǔn)確、高效構(gòu)建pDEST/Slam/V表達(dá)載體。該技術(shù)大大地簡化了基因克隆和亞克隆的步驟，保證了正確的方向和閱讀框,便于功能基因的分析和蛋白質(zhì)的表達(dá)。靶標(biāo)DNA片段可以通過位點(diǎn)特異的重組在載體之間轉(zhuǎn)移。

第二、Vero/Slam/V敏感細(xì)胞亞克隆采用慢病毒表達(dá)系統(tǒng)將Slam基因穩(wěn)定整合在Vero細(xì)胞基因組染色體上，使其具有良好的遺傳穩(wěn)定性，即傳代不丟失，瞬時(shí)轉(zhuǎn)染雖然也具有一定功效，但僅僅停留在驗(yàn)證階段，并沒有建立真正具有穩(wěn)定增強(qiáng)PPRV復(fù)制的陽性細(xì)胞亞克隆。

第三、構(gòu)建的Vero/Slam/V敏感細(xì)胞亞克隆與正常Vero細(xì)胞相比，形態(tài)上稍有改變，經(jīng)細(xì)胞生長曲線、細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)等一系列實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，其生物學(xué)特性沒有異常，所以無論科學(xué)研究還是生產(chǎn)疫苗，該Vero/Slam/V敏感細(xì)胞亞克隆完全可以用于小批量或大規(guī)模生產(chǎn)使用。

第四、與正常Vero細(xì)胞相比，構(gòu)建的Vero/Slam/V敏感細(xì)胞亞克隆能夠明顯提高PPRV分離率，其一PPRV致Vero/Slam/V敏感細(xì)胞亞克隆的病變時(shí)間比致正常Vero細(xì)胞病變時(shí)間明顯縮短，其二Vero/Slam/V敏感細(xì)胞亞克隆分離病毒的拷貝數(shù)比正常Vero細(xì)胞提高100倍以上。

本發(fā)明采用慢病毒表達(dá)系統(tǒng)制備的Vero/slam/V敏感細(xì)胞亞克隆無論從基因水平、轉(zhuǎn)錄水平或蛋白水平進(jìn)行驗(yàn)證時(shí)，均表現(xiàn)出良好的活性。Vero/slam/V與正常Vero生長特性無顯著差異,說明表達(dá)的蛋白對細(xì)胞沒有明顯毒性。Vero/slam/V與正常Vero細(xì)胞相比，接種PPRV后細(xì)胞病變時(shí)間明顯縮短，可見，Vero/slam/V敏感細(xì)胞亞克隆表達(dá)的slam/V能夠明顯提高PPRV的分離率。

附圖說明

圖1為基因組擴(kuò)增驗(yàn)證Vero/slam/V功能區(qū)敏感細(xì)胞中slam/V基因整合及其遺傳穩(wěn)定性核酸電泳圖；

圖2為間接免疫熒光從蛋白水平驗(yàn)證Vero/slam/V功能區(qū)敏感細(xì)胞中slam基因表達(dá)熒光圖；

圖3為Vero/slam/V功能區(qū)敏感細(xì)胞表達(dá)slam/V功能區(qū)后活性分析的western-blot結(jié)果蛋白電泳圖；

圖4為PPRV對Vero/slam/V功能區(qū)敏感細(xì)胞的易感性細(xì)胞圖；

圖5為real-time RT-PCR驗(yàn)證PPRV在vero/slam/V功能區(qū)敏感細(xì)胞上的增殖效果柱狀圖。

圖1中A為Vero/slam/V功能區(qū)細(xì)胞篩選擴(kuò)大培養(yǎng)后擴(kuò)增slam/V基因；B為Vero/slam/V功能區(qū)細(xì)胞傳30代后擴(kuò)增slam/V基因；M為DL2000分子量Marker；

圖2中A為正常vero細(xì)胞；B為vero/slam/V功能區(qū)細(xì)胞；C為免疫熒光檢測slam/V基因在vero細(xì)胞中的表達(dá)；D為免疫熒光檢測slam/V基因在vero/slam/V功能區(qū)細(xì)胞中的表達(dá)；

圖4中A為PPRV致vero細(xì)胞病變效應(yīng)；B為PPRV致vero/slam/V功能區(qū)細(xì)胞病變效應(yīng)。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合附圖及實(shí)施例對本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步詳細(xì)敘述。

實(shí)施例1

1、設(shè)計(jì)并合成針對山羊的信號淋巴細(xì)胞激活分子Slam/V功能區(qū)的引物，該引物與載體P位點(diǎn)匹配可以進(jìn)行同源重組，即帶有B位點(diǎn)同源臂，序列如下：

SEQ ID NO.1:GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTTAATGCTAGATCTGCGGAAAGGTGACT,

SEQ ID NO.2:GGGGACAACTTTTGTATACAAAGTTGTGGCATGCTGAGGGCCAAGAGTGAG。

2、制備山羊信號淋巴細(xì)胞激活分子RNA模板

采集并分離健康山羊外周血淋巴細(xì)胞，提取其總RNA。

3、制備Slam/V功能區(qū)的DNA

擴(kuò)增Slam/V功能區(qū)，建立50ul擴(kuò)增體系，如下：

上述點(diǎn)擊混勻，進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增，反應(yīng)條件為：

4、Slam/V入門載體構(gòu)建

凝膠回收并純化上述PCR產(chǎn)物，并與pDONR^TM221供體載體利用BPⅡEnzyme Mix酶進(jìn)行B、P同源重組，BP重組反應(yīng)體系為：

點(diǎn)擊混勻，25℃進(jìn)行重組反應(yīng)，2h后，體系中加入proteinase k，37℃反應(yīng)10min后產(chǎn)物轉(zhuǎn)化OneMach1^TM T1^R Chemically Competent Cells感受態(tài)細(xì)胞，挑選陽性克隆，測序檢驗(yàn)序列的保真性，獲得入門載體，命名為pDONR/slam/V。

5、pDONOR/slam/V表達(dá)載體的構(gòu)建

將上述pDONR/slam/V功能區(qū)與pLenti6.2/V5-DEST^TMVector表達(dá)載體通過LRⅡplus Enzyme Mix酶進(jìn)行L、R位點(diǎn)同源重組，LR重組反應(yīng)體系為：

點(diǎn)擊混勻，25℃進(jìn)行重組反應(yīng)，16h后，體系中加入proteinase k，37℃反應(yīng)10min后產(chǎn)物入50uL在冰上融化的OneMach1^TM T1^R Chemically Competent Cells感受態(tài)細(xì)胞中混勻，冰浴30min，42℃熱擊60s(切勿振蕩)，冰浴2～3min，加入450uL預(yù)熱的SOC培養(yǎng)基，封口膜封口，混勻，37℃水平轉(zhuǎn)速225rpm，振蕩1h，4000rpm離心2min，吸棄約350uL，剩余100uL菌液涂布于氨芐抗性的LB平板，正立平板吸收液體10min后，37℃倒置培養(yǎng)14h至單菌落出現(xiàn)。隨機(jī)挑取生長于LB(氨芐抗性)上的數(shù)個(gè)單菌落，增菌培養(yǎng)后小量提取質(zhì)粒，經(jīng)PCR鑒定為陽性的測序驗(yàn)證其保真性，驗(yàn)證合適的為獲得的表達(dá)骨架，命名為pDEST/slam/V。

6、slam/V復(fù)制缺陷型慢病毒樣粒子的獲得

pDEST/slam/V功能區(qū)與已經(jīng)優(yōu)化的ViraPower^TM Packaging Mix(pLP1、pLP2及VSV-G)共轉(zhuǎn)染人胚腎細(xì)胞293-FT(脂質(zhì)體3000法轉(zhuǎn)染)，48h收獲無復(fù)制能力的slam/V慢病毒上清液。4℃3500rpm，離心5min以去除細(xì)胞碎片，收集上清，即為slam/V復(fù)制缺陷型慢病毒樣粒子，-70℃保存?zhèn)溆谩?/p>

7、slam/V復(fù)制缺陷型慢病毒樣粒子感染Vero細(xì)胞以及陽性細(xì)胞亞克隆的篩選

吸棄Vero細(xì)胞培養(yǎng)液，加入3ml slam/V復(fù)制缺陷型慢病毒液，37℃孵育2h，補(bǔ)加7ml正常細(xì)胞培養(yǎng)液，2d后更換含有blasticidin的新鮮DMEM培養(yǎng)液，進(jìn)行抗性篩選。當(dāng)出現(xiàn)blasticidin抗性的細(xì)胞克隆時(shí)，胰酶消化轉(zhuǎn)至新的培養(yǎng)瓶，待細(xì)胞長滿后繼續(xù)抗性篩選。直至細(xì)胞不再死亡時(shí)，進(jìn)行有限稀釋，找細(xì)胞亞克隆島，并擴(kuò)大培養(yǎng)、連續(xù)傳代，進(jìn)行一系列后續(xù)驗(yàn)證、分析。

8、通過基因組擴(kuò)增從基因水平驗(yàn)證Vero/slam/V細(xì)胞亞克隆中slam/V基因整合及其遺傳穩(wěn)定性

取一瓶擴(kuò)大培養(yǎng)以及連續(xù)傳30代后的Vero/slam/V功能區(qū)細(xì)胞，吸棄培養(yǎng)液，胰酶消化后，500ul PBS重懸，利用基因組DNA提取試劑盒提取其基因組DNA，以SEQ IDNO.1，SEQ IDNO.2為引物，進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增體系及擴(kuò)增條件如上述。

9、結(jié)果

如圖1所示，Vero/slam/V功能區(qū)及其30代細(xì)胞中均成功擴(kuò)增到slam/V功能區(qū)基因，片段大小與預(yù)期一致，為429bp，測序驗(yàn)證合適，說明slam/V功能區(qū)已成功整合在Vero細(xì)胞基因組染色體上，連續(xù)傳30代不丟失，可見具有良好的遺傳穩(wěn)定性。

實(shí)施例2

1-7步驟同實(shí)施例1。

8、通過間接免疫熒光從蛋白水平驗(yàn)證Vero/slam/V功能區(qū)細(xì)胞中slam/V基因表達(dá)情況

實(shí)施案例1中步驟7篩選的陽性vero/slam/V功能區(qū)陽性細(xì)胞亞克隆接種于提前加入飛片的6孔細(xì)胞培養(yǎng)板，培養(yǎng)48h后，取出飛片，以PBS緩沖液(pH7.6)輕洗細(xì)胞面2次，瀝干液體后加入預(yù)冷的80％丙酮，放入-20℃冰箱固定25min，吸棄丙酮，以PBST緩沖液(pH7.6)洗滌單層細(xì)胞3次。室溫下用含3～5％BSA的PBS封閉液封閉45min。棄掉封閉液，用PBS洗滌細(xì)胞3次。每孔加入PBS 1:200稀釋的山羊抗Slam一抗(圣克魯斯生物技術(shù)有限公司)，37℃濕盒中作用1h，棄一抗，用PBST緩沖液洗滌單層細(xì)胞3次。每孔加入1:500稀釋的FITC異硫氰酸熒光素標(biāo)記的驢抗山羊IgG，濕盒中37℃孵育1h，吸棄熒光二抗，用PBST沖洗細(xì)胞3次，吸干沖洗液后滴加2滴50％甘油溶液，置于熒光顯微鏡下觀察染色結(jié)果并照相。

9、結(jié)果

通過免疫熒光檢測發(fā)現(xiàn)，slam/V基因在假型病毒的介導(dǎo)下得到了表達(dá)，而且表達(dá)的蛋白能被slam熒光標(biāo)記抗體所識別，而正常vero細(xì)胞中slam受體表達(dá)量非常低。進(jìn)一步從蛋白水平驗(yàn)證了構(gòu)建的vero/slam/V陽性細(xì)胞亞克隆能夠提高slam/V受體的表達(dá)量。如圖2。

實(shí)施例3

1-7步驟同實(shí)施例1。

8、Vero/slam/V陽性細(xì)胞亞克隆表達(dá)slam/V后的活性分析

用胰酶消化，PBS收集vero/slam/V陽性細(xì)胞亞克隆，細(xì)胞裂解液裂解后經(jīng)12％SDS-PAGE電泳后轉(zhuǎn)印至PVDF轉(zhuǎn)移膜，PBS洗膜3次，每次5min，滴加5％脫脂奶粉的PBS封閉過夜。PBST洗膜3次，每次5min，加入1:200稀釋的山羊抗slam一抗，37℃結(jié)合1.5h。用PBS洗膜3次，每次10min，加入1∶500稀釋的驢抗山羊酶標(biāo)二抗，室溫下輕搖孵育1h，PBST洗膜3次,每次5min，經(jīng)四氯-1-奈酚底物顯色、氨基黑染色分析結(jié)果，以檢查表達(dá)產(chǎn)物是否具有特異性免疫活性。

9、結(jié)果

經(jīng)SDS-PAGE電泳后，表達(dá)的外源蛋白在14kDa左右出現(xiàn)陽性條帶，而空白對照組未出現(xiàn)特異條帶，說明表達(dá)的外源蛋白具有活性結(jié)構(gòu)，轉(zhuǎn)印至PVDF轉(zhuǎn)移膜后，分別與山羊抗slam一抗和驢抗山羊IgG/HRP作用，結(jié)果表明在目的條帶位置上出現(xiàn)特異顯色條帶(如圖3)，正常vero對照細(xì)胞未出現(xiàn)條帶，說明目的蛋白slam/V功能區(qū)可被slam抗體所識別，具有免疫學(xué)活性。

實(shí)施例4

1-7步驟同實(shí)施例1。

8、接種PPRV病毒，驗(yàn)證PPRV對vero/slam/V陽性細(xì)胞亞克隆的易感性

同時(shí)取vero/slam/V和vero正常細(xì)胞各兩瓶，同時(shí)設(shè)空白對照，棄培養(yǎng)液，接種PPRV病毒液3ml，37℃孵育2h，補(bǔ)加維持液7ml，置37℃，觀察致細(xì)胞病變情況。

9、結(jié)果

接種PPRV后，與正常vero細(xì)胞(如圖2中A)相比，PPRV致vero/slam/V陽性細(xì)胞亞克隆(如圖2中B)病變時(shí)間明顯縮短，如圖4，表明，vero/slam/V陽性細(xì)胞亞克隆表達(dá)的slam/V具有提高PPRV易感性功效。這一結(jié)果為繁殖PPRV提供了較好工具。

實(shí)施例5

1-7步驟同實(shí)施例1。

8、接種PPRV病毒，real-time RT-PCR從轉(zhuǎn)錄水平驗(yàn)證轉(zhuǎn)基因陽性細(xì)胞亞克隆表達(dá)的山羊slam/V對PPRV的增殖效果

PPRV分別接種vero/slam/V敏感細(xì)胞亞克隆和正常vero細(xì)胞，分別于48h、72h及96h收集病毒，-70°冰箱反復(fù)凍融后，各取400ul，Trizol法分別提取其RNA，ND2000測定其濃度，稀釋使所有RNA保持在一個(gè)濃度(100ng/uL)，每個(gè)樣品3ul，利用實(shí)驗(yàn)室驗(yàn)證好的PPRV引物、探針引物及β-actin管家基因引物分別稀釋成10umol/L，按照One StepPrimer Script^TMRT-PCR Kit(Perfect Real time)說明書配比，同步擴(kuò)增PPRV和β-actin基因，每個(gè)樣品重復(fù)3次。然后，用比較閾值法分析不同樣品中PPRV的相對拷貝數(shù)。

9、結(jié)果

由圖5可知，無論48h、72h或96h哪個(gè)時(shí)間點(diǎn)，PPRV在轉(zhuǎn)基因vero/slam/V敏感細(xì)胞亞克隆上繁殖的相對拷貝數(shù)比正常Vero細(xì)胞的都要高，說明vero/slam/V敏感細(xì)胞亞克隆穩(wěn)定表達(dá)的slam具有明顯增強(qiáng)PPRV繁殖的功能。

Organization Applicant

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Street : 甘肅省蘭州市城關(guān)區(qū)鹽場堡徐家坪1號

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<110> OrganizationName : 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所

Application Project

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<120> Title : 一種用于增強(qiáng)PPRV復(fù)制的敏感細(xì)胞亞克隆Vero-Slam-V的制備方法

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