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一種用于增強(qiáng)PPRV復(fù)制的敏感細(xì)胞亞克隆Vero/Slam/V的制備方法與流程

文檔序號:12412248閱讀:來源:國知局

技術(shù)特征:

1.一種用于增強(qiáng)PPRV復(fù)制的敏感細(xì)胞亞克隆Vero/Slam/V的制備方法,其特征在于包括山羊信號淋巴細(xì)胞激活分子slam/V引物序列,通過構(gòu)建山羊slam/V慢病毒表達(dá)載體,獲得slam/V復(fù)制缺陷型慢病毒樣粒子,以獲得的slam/V慢病毒感染Vero靶標(biāo)細(xì)胞,篩選穩(wěn)定表達(dá)slam/V的Vero陽性細(xì)胞亞克隆,驗證陽性細(xì)胞亞克隆Vero/Slam/V表達(dá)的Slam/V的活性、遺傳穩(wěn)定性及其對PPRV復(fù)制的增殖效果。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種用于增強(qiáng)PPRV復(fù)制的敏感細(xì)胞亞克隆Vero/Slam/V的制備方法,其特征在于所述slam/V引物帶有與載體匹配的B位點(diǎn)同源臂,其序列為:

SEQ ID NO.1:GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTTAATGCTAGATCTGCGGAAAGGTGACT,

SEQ ID NO.2:GGGGACAACTTTTGTATACAAAGTTGTGGCATGCTGAGGGCCAAGAGTGAG。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種用于增強(qiáng)PPRV復(fù)制的敏感細(xì)胞亞克隆Vero/Slam/V的制備方法,其特征在于所述Slam/V表達(dá)載體的構(gòu)建,包括Slam/V與pDONRTM221供體載體進(jìn)行B、P位點(diǎn)重組,獲得入門載體pDONR/Slam/V,pDONR/Slam/V與pLenti6.2/V5-DESTTMVector表達(dá)載體進(jìn)行L、R位點(diǎn)重組獲得表達(dá)克隆pDEST/Slam/V。

4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種用于增強(qiáng)PPRV復(fù)制的敏感細(xì)胞亞克隆Vero/Slam/V的制備方法,其特征在于所述Slam/V復(fù)制缺陷型慢病毒樣粒子的獲得,是將pDEST/Slam/V質(zhì)粒與包裝混合物pLP1、pLP2及VSV-G共同轉(zhuǎn)染人胚腎細(xì)胞株293-FT,收獲細(xì)胞上清,獲得具有感染性的Slam/V復(fù)制缺陷型慢病毒樣粒子。

5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種用于增強(qiáng)PPRV復(fù)制的敏感細(xì)胞亞克隆Vero/Slam/V的制備方法,其特征在于所述篩選穩(wěn)定表達(dá)slam/V的Vero陽性細(xì)胞亞克隆,是采用殺稻瘟菌素blasticidin進(jìn)行抗性篩選,獲得穩(wěn)定表達(dá)Slam/V的Vero陽性細(xì)胞亞克隆。

6.如權(quán)利要求5所述的一種用于增強(qiáng)PPRV復(fù)制的敏感細(xì)胞亞克隆Vero/Slam/V的制備方法,其特征在于所述Vero細(xì)胞對blasticidin殺稻瘟菌素的耐受濃度為3.5ug/ml。

7.如權(quán)利要求1所述的一種用于增強(qiáng)PPRV復(fù)制的敏感細(xì)胞亞克隆Vero/Slam/V的制備方法,其特征在于所述敏感細(xì)胞亞克隆Vero/Slam/V的驗證,采用靶標(biāo)基因擴(kuò)增方法、間接免疫熒光方法、western-blot免疫印跡檢測方法及致細(xì)胞病變效應(yīng)分別驗證slam/V基因組整合、轉(zhuǎn)錄,slam/V蛋白表達(dá)、反應(yīng)活性以及PPRV在表達(dá)slam/V的陽性細(xì)胞亞克隆上的增殖效果。

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