本發(fā)明專利屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，尤其是在一種J亞型禽白血病抗性相關(guān)基因NRAMP1和特異性病毒受體gp85檢測的領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

由于ALV-J造成雞的生長和免疫抑制，病原的宿主譜廣，發(fā)病日齡范圍大，已對世界的養(yǎng)禽業(yè)造成巨大影響。從發(fā)現(xiàn)ALV-J以來，世界各國多次報道。但是由于J亞群白血病難于診斷、病毒變異迅速，在近十年來，ALV-J已經(jīng)從傳染性強(qiáng)的慢性致瘤性病毒演變成傳染性很強(qiáng)的急性致瘤性病毒，給治療和預(yù)防帶來一定困難。ALV-J的控制和清除在于盡早地診斷病雞，因此，研究ALV-J的診斷方法十分必要。ALV-J的ELISA診斷方法用于檢測群特異性抗原，但卻會因?yàn)闄z測到內(nèi)源性病毒群特異性抗原而出現(xiàn)假陽性。經(jīng)過研究發(fā)現(xiàn)，從患病雞群的疑似病料中能檢出ALV-J的特異性區(qū)帶，進(jìn)一步說明了用分子生物學(xué)手段檢測ALV-J是一種迅速、準(zhǔn)確、特異的方法。該病毒的亞群特異性主要是由env基因編碼的表面囊膜蛋白gp85所決定(SU)。gp85編碼ALV與受體結(jié)合的決定簇，并通過gp37編碼的穿膜蛋白(TM)定位到細(xì)胞膜上。ALV-Jgag和pol基因相對保守，而在包括gp85在內(nèi)的env基因上存在著較大的變異。因此，開展對ALV-Jgp85基因的研究是進(jìn)行ALV-J分子變異和病毒進(jìn)化研究的前提，針對gp85建立的特異性診斷方法也是在種雞場中特異性檢出ALV-J并及時凈化種群的強(qiáng)有力的技術(shù)手段。并且，NRAMP1基因與雞、老鼠和人類有68％的同源性，是決定雞是否是對J亞型禽白血病易感的一個重要因素，研究雞NRAMP1基因抗J亞型禽白血病的作用機(jī)制也有很大意義。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

有鑒于此，本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供一種針對患病雞群J亞型禽白血病的診斷方法，用于解決研究雞NRAMP1基因抗J亞型禽白血病的作用機(jī)制；

本發(fā)明的內(nèi)容為：特異性引物的克隆病毒的gp85片斷為識別靶細(xì)胞膜上的特異性病毒受體，稱作外膜蛋白；

特異性引物的克隆病毒的NRAMP1基因?yàn)橐环N免疫力相關(guān)的抗病候選基因，主要在吞噬細(xì)胞和噬中性粒細(xì)胞及外周血細(xì)胞中特異表達(dá)，影響動物的固有免疫；

并包括下列步驟：

1)特異性引物的克隆病毒的培養(yǎng)與增殖；

2)提取特異性引物的克隆病毒的的DNA；

3)使用PCR反應(yīng)進(jìn)行擴(kuò)增特異性引物的克隆病毒的基因片斷，形成PCR反應(yīng)產(chǎn)物；其中PCR反應(yīng)為聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，Polymerase Chain Reaction；

4)PCR反應(yīng)產(chǎn)物的電泳檢測；

5)PCR反應(yīng)產(chǎn)物的膠回收；

6)PCR反應(yīng)產(chǎn)物的酶切鑒定；

7)構(gòu)建重組質(zhì)粒；

8)使用PCR反應(yīng)進(jìn)行擴(kuò)增SNP位點(diǎn)所在的片斷，進(jìn)行PCR反應(yīng)產(chǎn)物的酶切鑒定；SNP位點(diǎn)為單核苷酸的多態(tài)性；

本發(fā)明的進(jìn)一步方案為：特異性引物的克隆病毒的培養(yǎng)與增殖有以下步驟：

1)取研磨好的制備雞胚的病毒肝組織，進(jìn)行特異性引物的克隆病毒的培養(yǎng)與增殖；反復(fù)凍融后，用磷酸鹽緩沖液進(jìn)行5倍稀釋，經(jīng)0.45μm無菌濾器過濾后，在－20℃溫度下儲存?zhèn)溆?，待雞胚的病毒肝組織中的纖維細(xì)胞長成近80％單層細(xì)胞時，用無血清培養(yǎng)液洗滌雞胚的病毒肝組織中的纖維細(xì)胞兩次；

2)每個細(xì)胞培養(yǎng)瓶接種病毒懸液0.2ml，用雞胚的正常肝組織中的纖維細(xì)胞做陰性對照，37℃感作1小時，在每個細(xì)胞培養(yǎng)瓶中加入5ml無血清生物醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)中最常用的無機(jī)鹽溶液和平衡鹽溶液(Hanks)培養(yǎng)液37℃培養(yǎng)，形成細(xì)胞懸液，7日后收毒，反復(fù)凍融三次后，－20℃貯存?zhèn)溆茫?/p>

本發(fā)明的進(jìn)一步方案為：提取特異性引物的克隆病毒的的DNA有以下步驟：

1)取1000μl細(xì)胞懸液，用4000rpm的離心速度進(jìn)行離心1分鐘，棄上清，用450μlTE緩沖液(pH＝8.0)重懸細(xì)胞沉淀，向其中加入50μl10％十二烷基硫酸鈉(終濃度為1％)，加入2μl蛋白酶K(使用濃度為50μg/ml)，輕輕混勻，在56℃水浴中消化過夜；

2)經(jīng)三羥甲基氨基甲烷飽和酚，氯仿抽提后，取上清，用等體積的異丙醇-20℃沉淀過夜，隔日將樣品在4℃和在12000rpm離心速度下進(jìn)行離心12分鐘，沉淀用70％乙醇洗滌，真空抽干，用30μlTE緩沖液重懸細(xì)胞沉淀，并于37℃用核糖核酸酶消化30分鐘后，在4℃條件下進(jìn)行保存；

4.本發(fā)明的進(jìn)一步方案為：使用PCR反應(yīng)進(jìn)行擴(kuò)增特異性引物的克隆病毒的基因片斷有以下步驟：

1)采用特異性引物的上游引物(引物序列為

TATTGCTGTTTCATCGTTA)、特異性引物的下游引物(引物序列為

GTGCGTGGTTATTATTTCC)為特異性引物的進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系，特異性引物的進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系的反應(yīng)液的容積為100μl；

PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系的反應(yīng)液的組成為：10×PCR反應(yīng)緩沖液10μl(2.5mmol/L)、脫氧核糖核苷三磷酸8μl(2.5mmol/L)、特異性引物的上游引物59μl(10pmol/L)、特異性引物的下游引物30μl(10pmol)、鎂離子終濃度為1.05pmol/L、高保真taq酶濃度為0.08pmol/L、模板脫氧核糖核酸10μl，并用去離子水將PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系的反應(yīng)液補(bǔ)至100μl；

2)進(jìn)行反應(yīng)，條件為：95℃下預(yù)變性3分鐘，進(jìn)行30個循環(huán)，一個循環(huán)周期為95℃條件下變性，57℃退火1分鐘，72℃延長2分鐘，最后72℃延伸0分鐘，得到PCR反應(yīng)產(chǎn)物，并在4℃條件下進(jìn)行保存；

5.本發(fā)明的進(jìn)一步方案為：PCR反應(yīng)產(chǎn)物的電泳檢測有以下步驟：

1)取PCR反應(yīng)產(chǎn)物4.5μl混合0.5μl10×上樣緩沖液的上樣于0.8％瓊脂糖凝膠中，上樣電壓120V；

2)至溴酚藍(lán)指示劑泳過瓊脂糖凝膠的中線后，將瓊脂糖凝膠取出，置于紫外透視儀下檢測電泳結(jié)果，使用DNAMarker選用DL15000，DNAMarker作為一種分子標(biāo)記(Marker)，用于構(gòu)建分子圖譜；

本發(fā)明的進(jìn)一步方案為：PCR反應(yīng)產(chǎn)物的膠回收有以下步驟：

1)制做1％低溶點(diǎn)的瓊脂糖凝膠；

將PCR反應(yīng)產(chǎn)物與10×上樣緩沖液混合加于上樣孔中，80V電泳20min條件下，切下擴(kuò)增目的基因片斷進(jìn)行回收，按每100mg瓊脂糖加入300μl的特異性引物(序列為TTTGGATCCGTGGGGGGAGTTCATCTGTTG)液的比例形成特異性引物液，55℃溫浴10min，每隔2min顛倒混勻一次，使瓊脂糖完全融化，形成瓊脂糖凝膠；

2)再加入1/3特異性引物的體積的異丙醇，混勻，55℃溫浴1min，將融化后的瓊脂糖液移入吸附柱，用14000Rpm的離心速度離心1min，倒掉收集管中的液體，將吸附柱放入收集管中；在吸附柱中加入450μl的特異性引物，靜置1min后，用14000Rpm的離心速度離心15s，倒掉收集管中的液體，將吸附柱放入收集管中，用14000Rpm的離心速度離心1min后，將吸附柱放入一個干凈的1.5mlEP管中，在吸附膜中央加入30μl的特異性引物，靜置1min后，離心1min，用1％濃度瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行純化PCR反應(yīng)產(chǎn)物，得到純化的DNA進(jìn)行觀察，并在-20℃條件下保存?zhèn)溆茫?/p>

本發(fā)明的進(jìn)一步方案為：PCR反應(yīng)產(chǎn)物的酶切鑒定有以下步驟：

1)根據(jù)ALV-J的原型株的脫氧核糖核酸序列，在PCR反應(yīng)產(chǎn)物的內(nèi)部，尋找兩個單酶切位點(diǎn)，用于酶切鑒定，共10μl體系；ALV-J為針對患病雞群J亞型禽白血病的一種病毒J亞群；

2)取8.5μl經(jīng)過膠回收試劑盒回收的PCR反應(yīng)產(chǎn)物，加入1μl的上樣緩沖液，加ApaⅠ內(nèi)切酶7.5U，同時在相同劑量的情況下，用PvuⅡ限制性內(nèi)切酶進(jìn)行酶切鑒定；

本發(fā)明的進(jìn)一步方案為：構(gòu)建重組質(zhì)粒有以下步驟：

1)將PCR反應(yīng)產(chǎn)物與高效克隆TA的載體pMD18-T連接，取3μl膠回收產(chǎn)物，向其中加入5μl連接緩沖液，用水補(bǔ)至10μl，于16℃水浴中反應(yīng)形成連接產(chǎn)物，然后隔夜后將連接產(chǎn)物進(jìn)行轉(zhuǎn)化；

2)取一管100μl體積化感受態(tài)細(xì)胞JM109，融化后立即加入10μl上述連接產(chǎn)物，混勻后冰上放置30min，42℃熱休克90S，冰浴2min，加入預(yù)熱到37℃的無抗生素LB液體培養(yǎng)基100μl，37℃振搖培養(yǎng)60min，將此200μl體系均勻涂布于含有異丙基硫代半乳糖苷和氨芐青霉素抗性的無抗生素LB液體培養(yǎng)基的瓊脂平板上(Amp+)，37℃進(jìn)行培養(yǎng)12小時，然后用陽性重組質(zhì)粒(pMD18-T-JL-2/env)進(jìn)行篩選；

3)挑取白色菌落于5ml無抗生素LB液體培養(yǎng)基(含50μg/mlAmp)中，37℃振搖培養(yǎng)15小時(225轉(zhuǎn)/分)得到培養(yǎng)物，小量堿法提取質(zhì)粒，取1.5ml培養(yǎng)物，在4℃條件下用14000Rpm的離心速度離心1min，棄上清，使沉淀盡可能干燥；計體積，加等量酚/氯仿，振蕩混勻，在4℃條件下用12000Rpm的離心速度離心10min，取上層液體，計體積；

4)重復(fù)前步實(shí)驗(yàn)一次，在上層液體中加入2倍體積預(yù)冷的乙醇，-30℃沉淀20min，在4℃條件下用12000Rpm的離心速度離心15min，棄上清，用500μl的70％乙醇洗滌沉淀，沉淀真空抽干，用40μlTE緩沖液進(jìn)行溶解，加入RNA酶37℃作用30分鐘，即為提取質(zhì)粒，-20℃保存?zhèn)溆茫鶕?jù)高效克隆TA的載體pMD18-T的酶切圖譜，對重組質(zhì)粒進(jìn)行酶切分析，找到載體上的單酶切位點(diǎn)，分別用HindⅢ限制性內(nèi)切酶(HindⅢ)，限制性內(nèi)切酶(BamHⅠ)進(jìn)行單酶切和雙酶切鑒定；

本發(fā)明的進(jìn)一步方案為：PCR擴(kuò)增SNP位點(diǎn)所在片斷，進(jìn)行PCR反應(yīng)產(chǎn)物的酶切鑒定有以下步驟：

1)PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系準(zhǔn)備，在200μl的PCR薄壁管中，加入1μl模板DNA(50ng/μl)、2μl10×PCR反應(yīng)緩沖液、0.8ul脫氧核糖核苷三磷酸(dNTP)、0.1μl的TaqDNA聚合酶(5U/ul)，加水至20ul，充分混勻后短暫離心，在PCR儀上設(shè)置如下PCR反應(yīng)程序：先在94℃條件下變性4分鐘；再經(jīng)過35個循環(huán)，每個循環(huán)包括94℃40秒、56℃50秒、72℃20s；然后在73℃條件下延長7分鐘、最后在4℃條件下保存；PCR反應(yīng)程序設(shè)置完畢后，將PCR薄壁管放入PCR儀進(jìn)行反應(yīng)擴(kuò)增，反應(yīng)結(jié)束后，取4μl反應(yīng)產(chǎn)物在2％瓊脂糖凝膠，1×Tris硼酸(TBE)中電泳，檢測擴(kuò)增產(chǎn)物片斷大小，判定PCR擴(kuò)增的片斷是否正確；

2)在200μl的PCR薄壁管中加入酶切反應(yīng)體系：5μlPCR反應(yīng)產(chǎn)物、瓊脂糖凝膠1μl10倍緩沖液、1ulTscAI酶(10U/ul)加水至15μl，65℃消化2.5h，酶切結(jié)果鑒定，全部酶切產(chǎn)物在4％瓊脂糖凝膠，1×TBE中電泳條件下，判定酶切結(jié)果，進(jìn)行基因分型，分型依據(jù)為，酶切產(chǎn)物為119bp和101bp兩條帶則為TT基因型，酶切產(chǎn)物為225bp則為CC基因型，三條帶的則為雜合型CT基因型。

具體實(shí)施方式

為了使本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題、技術(shù)方案及有益效果更加清楚明白，以下結(jié)合實(shí)施例，對本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)的說明。應(yīng)當(dāng)說明的是，此處所描述的具體實(shí)施例僅用以解釋本發(fā)明，并不用于限定本發(fā)明，能實(shí)現(xiàn)同樣功能的產(chǎn)品屬于等同替換和改進(jìn)，均包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。具體方法如下：

實(shí)施例1：進(jìn)行g(shù)p85基因原核表達(dá)載體PGEX-6P-1/gp85的構(gòu)建奠定基礎(chǔ)。

1)病毒培養(yǎng)及病毒cDNA的提取，培養(yǎng)雞胚成纖維細(xì)胞，待細(xì)胞長至80％單層時，接種病毒，擴(kuò)增病毒后，提取細(xì)胞DNA為模板。

2)目的片斷的擴(kuò)增，本實(shí)驗(yàn)用使用S1和S2引物對含有整合進(jìn)宿主基因組中的病毒序列進(jìn)行PCR擴(kuò)增，以期擴(kuò)增出包括病毒完整gp85基因在內(nèi)的960bp，反應(yīng)體系為100μl。反應(yīng)條件為，94℃預(yù)變性4分鐘，然后進(jìn)行30個循環(huán)。一個循環(huán)周期為：94℃變性45秒，57℃退火45秒，72℃延長1.5分鐘，最后72℃延伸10分鐘，反應(yīng)產(chǎn)物4℃保存。

3)制做1％低溶點(diǎn)瓊脂糖，將PCR反應(yīng)產(chǎn)物與10×loading的buffer混合加于上樣孔中，0V電泳，紫外燈下檢測結(jié)果。切下目的片斷，采用膠回收試劑盒進(jìn)行回收。

4)gp85基因原核表達(dá)載體PGEX-6P-1/gp85的構(gòu)建，將回收的PCR反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行雙酶切，酶選用BamHI、SalI酶。酶切體積如下：

重組質(zhì)粒30μl

1.5×Tbuffer15μl

純水45μl

HindⅢ10μl

共100μl反應(yīng)體積，30℃水浴2小時后，向體系中加入SalI酶10μl，37℃水浴2小時。中間不換酶切緩沖液。1％瓊脂糖凝膠電泳檢測酶切效果。對目的片斷進(jìn)行膠回收，-20℃儲存?zhèn)溆谩?/p>

實(shí)施例2：通過gp85基因與載體的連接，實(shí)現(xiàn)PGEX-6P-1/gp85重組質(zhì)粒的鑒定。

制備的雙酶切純化物進(jìn)行連接，共10μl反應(yīng)體系，16℃連接過夜，連接產(chǎn)物將用于轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞DH5α。連接體積如下：

粘末端gp85基因的純化物3μl

粘末端PGEX-6P-1的純化物1.5μl

10×ligasebuffer1μl

T4DNAligase1μl

水3.5μl

氯化鈣法制備感受態(tài)細(xì)胞。以無菌接種環(huán)挑取凍存的菌種DH5α于LB平板劃線，同時在含有氨芐青霉素的LB平板劃線做對照，37℃溫箱培養(yǎng)過夜。次日挑取生長良好的單個菌落接種于5mlLB液體培養(yǎng)基中37℃震搖培養(yǎng)過夜。取1ml活化后的培養(yǎng)液加到100mlLB液體培養(yǎng)基中，37℃劇烈震搖，使OD600 達(dá)到0.4左右。在無菌條件下將細(xì)菌培養(yǎng)液倒入滅菌后冰預(yù)冷的離心管中，冰浴10min后，4℃1000RPM離心10min，棄凈上清。再用10ml冰預(yù)冷的0.1MCaCL溫和懸起細(xì)菌沉淀，冰浴放置30min，4℃1000RPM離心10min，棄凈上清。最后以4ml冰預(yù)冷的0.1MCaCL。再次重懸沉淀，加入終濃度為15％的甘油，混勻后分裝為100μg/管，－70℃保存?zhèn)溆?。于平板挑取白色菌落，分別接種于5mlLB液體培養(yǎng)基中(Amp+)，37℃搖菌過夜。小量堿法提取質(zhì)粒。以堿法小量提取質(zhì)粒作為模板，使用S1，S2為引物對重組質(zhì)粒進(jìn)行PCR鑒定。鑒定后送大連寶生物公司進(jìn)行序列測定，并對結(jié)果進(jìn)行分析。

實(shí)施例3：針對患病雞群J亞型禽白血病的診斷方法，既包含特異性引物克隆該病毒株的gp85片斷的檢測過程，又包含NRAMP1基因的檢測過程；

gp85片斷為識別靶細(xì)胞膜上的特異性病毒受體，稱作外膜蛋白

NRAMP1基因?yàn)橐环N免疫力相關(guān)的抗病候選基因，主要在吞噬細(xì)胞和噬中性粒細(xì)胞及外周血細(xì)胞中特異表達(dá)，影響動物的的固有免疫；

包括下列步驟：

1)病毒的培養(yǎng)與增殖；

2)提取前病毒DNA；

3)PCR反應(yīng)擴(kuò)增目的基因片斷；

4)PCR反應(yīng)產(chǎn)物電泳檢測；

5)PCR反應(yīng)產(chǎn)物的膠回收；

6)PCR反應(yīng)產(chǎn)物酶切鑒定；

7)構(gòu)建重組質(zhì)粒pMD18-T-JL-2/env；

8)PCR擴(kuò)增SNP位點(diǎn)所在片斷，進(jìn)行PCR反應(yīng)產(chǎn)物的酶切鑒定；

病毒的培養(yǎng)與增殖有以下步驟：

1)取研磨好的病毒肝組織，將其反復(fù)凍融后，用磷酸緩沖鹽溶液(phosphatebuffersaline，PBS)進(jìn)行5倍稀釋，經(jīng)0.45μm無菌濾器過濾后，在－20℃溫度下儲存?zhèn)溆?，制備雞胚成纖維細(xì)胞，待雞胚成纖維細(xì)胞長成近80％單層時，用無血清培養(yǎng)液洗滌單層細(xì)胞兩次，

2)每瓶細(xì)胞接種病毒懸液0.2ml，正常雞胚成纖維細(xì)胞做陰性對照，37℃感作1小時，在每個細(xì)胞培養(yǎng)瓶中加入5ml無血清Hanks培養(yǎng)液37℃培養(yǎng)，7日后收毒，反復(fù)凍融三次后，－20℃貯存?zhèn)溆茫?/p>

提取前病毒DNA有以下步驟：

1)取1000μl細(xì)胞懸液,4000rpm離心1分鐘，棄上清，用450μlTE緩沖液(Tris-EDTAbuffersolution，pH＝8.0)重懸細(xì)胞沉淀，向其中加入50μl10％十二烷基硫酸鈉(終濃度為1％)，加入2μl蛋白酶K(使用濃度為50μg/ml)，輕輕混勻，在56℃水浴中消化過夜；

2)經(jīng)三羥甲基氨基甲烷飽和酚，氯仿抽提后，取上清，用等體積的異丙醇-20℃沉淀過夜，隔日將樣品4℃12000rpm離心12分鐘，沉淀用70％乙醇洗滌，真空抽干，用30μlTE重懸沉淀，于37℃用核糖核酸酶消化30分鐘后，4℃保存；

PCR反應(yīng)擴(kuò)增目的基因片斷有以下步驟：

1)采用上游引物J3(引物序列為TATTGCTGTTTCATCGTTA)、下游引物J5(引物序列為GTGCGTGGTTATTATTTCC)為引物進(jìn)行PCR(聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，PolymeraseChainReaction)擴(kuò)增反應(yīng)體系為100μl，反應(yīng)液的組成為：10×PCR反應(yīng)緩沖液10μl、脫氧核糖核苷三磷酸(各2.5mmol/L)8μl、上游引物J54μl(10pmol)、下游引物J34μl(10pmol)、鎂離子終濃度為1.5mM、高保真taq酶0.8U、模板脫氧核糖核酸10μl、去離子水補(bǔ)至100μl；

2)進(jìn)行反應(yīng)，條件為：95℃預(yù)變性3分鐘，進(jìn)行30個循環(huán)，一個循環(huán)周期為95℃變性，57℃退火1分鐘，72℃延長2分鐘，最后72℃延伸10分鐘，反應(yīng)產(chǎn)物4℃保存；

PCR反應(yīng)產(chǎn)物電泳檢測有以下步驟：

1)取PCR反應(yīng)產(chǎn)物4.5μl混合0.5μl10×loadingbuffer上樣于0.8％瓊脂糖凝膠中，電壓120V；

2)至溴酚藍(lán)指示劑泳過瓊脂糖凝膠中線后，將凝膠取出，置于紫外透視儀下檢測電泳結(jié)果，DNAMarker選用DL15000；

PCR反應(yīng)產(chǎn)物的膠回收有以下步驟：

1)制做1％低溶點(diǎn)瓊脂糖凝膠，將PCR反應(yīng)產(chǎn)物與10×loadingbuffer混合加于上樣孔中，80V電泳20min，切下目的片斷，進(jìn)行回收，按每100mg瓊脂糖加入300μl的S1液的比例加入S1(引物，序列為TTTGGATCCGTGGGGGGAGTTCATCTGTTG)液，55℃溫浴10min，每2min顛倒混勻一次，使瓊脂糖完全融化；

2)加入1/3S1液體積的異丙醇，混勻，55℃溫浴1min，將融化后的瓊脂糖液移入吸附柱，14000Rpm離心1min，倒掉收集管中的液體，將吸附柱放入同一收集管中；在吸附柱中加入450μl的W1液，靜置1min后，14000Rpm離心15s，倒掉收集管中的液體，將吸附柱放入同一收集管中，14000Rpm離心1min后，將吸附柱放入一個干凈的1.5mlEP管中，在吸附膜中央加入30μl的T1液，靜置1min后，離心1min，1％瓊脂糖電泳觀察純化PCR反應(yīng)產(chǎn)物，純化的DNA-20℃保存?zhèn)溆茫籔CR反應(yīng)產(chǎn)物酶切鑒定有以下步驟：

1)根據(jù)ALV-J原型株HPRS-103的脫氧核糖核酸序列，在PCR擴(kuò)增產(chǎn)物內(nèi)部，尋找兩個單酶切位點(diǎn)，用于酶切鑒定，共10μl體系；

2)取經(jīng)膠回收試劑盒回收的PCR反應(yīng)產(chǎn)物8.5μl，加入1μlLbuffer，加入ApaⅠ內(nèi)切酶7.5U，同時在相同劑量的情況下，用PvuⅡ限制性內(nèi)切酶進(jìn)行酶切鑒定；構(gòu)建重組質(zhì)粒pMD18-T-JL-2/env有以下步驟：

1)將PCR反應(yīng)產(chǎn)物與pMD18-T連接，取3μl膠回收產(chǎn)物，向其中加入5μl連接緩沖液SolutionI，然后加入PMD18-T載體1μl，用水補(bǔ)至10μl，于16℃水浴中反應(yīng)過夜，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化，取一管100μl體積化感受態(tài)細(xì)胞JM109，融化后立即加入10μl上述連接物，混勻后冰上放置30min，42℃熱休克90S，冰浴2min，加入預(yù)熱到37℃的無抗生素LB液體培養(yǎng)基100μl，37℃振搖培養(yǎng)60min，將此200μl體系均勻涂布于含有異丙基硫代半乳糖苷和氨芐青霉素抗性的LB瓊脂平板上(Amp+)，37℃培養(yǎng)12h，pMD18-T-JL-2/env陽性重組質(zhì)粒的篩選；

2)挑取白色菌落于5mlLB液體培養(yǎng)基(含50μg/mlAmp)中，37℃振搖培養(yǎng)15小時(225轉(zhuǎn)/分)，小量堿法提取質(zhì)粒，取1.5ml培養(yǎng)物，4℃12000Rpm離心1min，棄上清，使沉淀盡可能干燥；100μl預(yù)冷的溶液Ⅰ重懸細(xì)菌沉淀，加入200μl現(xiàn)配的溶液Ⅱ，快速顛倒混勻，放于冰上5min，加入150μl預(yù)冷的溶液Ⅲ，溫和振蕩10S，冰上放置5min；于4℃以12000Rpm離心5min，取上清，計體積，加等量酚/氯仿，振蕩混勻，于4℃以12000Rpm離心10min，取上層液體，計體積；

3)重復(fù)前步實(shí)驗(yàn)一次，加入2倍體積預(yù)冷的乙醇，-30℃沉淀20min，4℃12000Rpm離心15min，棄上清，用500μl70％乙醇洗滌沉淀，沉淀真空抽干，用40μlTE溶解，加入RNA酶37℃作用30分鐘，即為提取質(zhì)粒，-20℃保存?zhèn)溆?，根?jù)PMD18-T載體的酶切圖譜，對重組質(zhì)粒進(jìn)行酶切分析，找到載體上的單酶切位點(diǎn)HindⅢ，BamHⅠ，此位點(diǎn)在外源片斷中不存在，分別用HindⅢ，BamHⅠ進(jìn)行單酶切和雙酶切鑒定；

PCR擴(kuò)增SNP位點(diǎn)所在片斷，進(jìn)行PCR反應(yīng)產(chǎn)物的酶切鑒定有以下步驟：

1)PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系準(zhǔn)備，在200μl的PCR薄壁管中，加入1μl50ng/μlDNA模板、2μl10×PCR反應(yīng)緩沖液、0.8ul2.5mMdNTP、0.8ul5uM引物P和0.1μl5U/ulTaqDNA聚合酶，加水至20ul，充分混勻后短暫離心，在PCR儀上設(shè)置如下PCR反應(yīng)程序：先94℃變性4分鐘；再經(jīng)過35個循環(huán)，每個循環(huán)包括94℃30秒、56℃30秒、72℃30s；然后72℃延伸6分鐘、最后4℃保存；PCR反應(yīng)程序設(shè)置完畢后，將PCR薄壁管放入PCR儀進(jìn)行反應(yīng)擴(kuò)增，反應(yīng)結(jié)束后，取4μl反應(yīng)產(chǎn)物在2％瓊脂糖膠，1×TBE(Tris硼酸)中電泳，檢測擴(kuò)增產(chǎn)物片斷大小，以擴(kuò)增產(chǎn)物片斷為268bp，判定PCR擴(kuò)增的片斷是否正確；

2)在200μl的PCR薄壁管中加入如下酶切反應(yīng)體系，5μlPCR反應(yīng)產(chǎn)物、1μl10倍緩沖液、1ul10U/ulTscAI酶加水至15μl，65℃消化2.5h，酶切結(jié)果鑒定，全部酶切產(chǎn)物在4％瓊脂糖膠，1×TBE中電泳，判定酶切結(jié)果，進(jìn)行基因分型，分型依據(jù)為，酶切產(chǎn)物為119bp和101bp兩條帶則為TT基因型，酶切產(chǎn)物為225bp則為CC基因型，三條帶的則為雜合型CT。

本發(fā)明設(shè)計優(yōu)點(diǎn)主要有：gp85蛋白及NRAMP1基因作為ALV-J抗原診斷試劑對我國的ALV-J的流行病學(xué)調(diào)查及檢疫與診斷提供了重要的實(shí)驗(yàn)依據(jù)和理論基礎(chǔ)。