1.一種針對(duì)患病雞群J亞型禽白血病的診斷方法，其特征是：
既包含對(duì)特異性引物的克隆病毒的gp85片斷的檢測(cè)過(guò)程，又包含對(duì)所述特異性引物的克隆病毒的NRAMP1基因的檢測(cè)過(guò)程；
所述特異性引物的克隆病毒的gp85片斷為識(shí)別靶細(xì)胞膜上的特異性病毒受體，稱作外膜蛋白；
所述特異性引物的克隆病毒的NRAMP1基因?yàn)橐环N免疫力相關(guān)的抗病候選基因，主要在吞噬細(xì)胞和噬中性粒細(xì)胞及外周血細(xì)胞中特異表達(dá)，影響動(dòng)物的固有免疫；
并包括下列步驟：
1)所述特異性引物的克隆病毒的培養(yǎng)與增殖；
2)提取所述特異性引物的克隆病毒的DNA；
3)使用PCR反應(yīng)進(jìn)行擴(kuò)增所述特異性引物的克隆病毒的基因片斷，形成PCR反應(yīng)產(chǎn)物；其中所述PCR反應(yīng)為聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Polymerase Chain Reaction)；
4)所述PCR反應(yīng)產(chǎn)物的電泳檢測(cè)；
5)所述PCR反應(yīng)產(chǎn)物的膠回收；
6)所述PCR反應(yīng)產(chǎn)物的酶切鑒定；
7)構(gòu)建重組質(zhì)粒；
8)使用PCR反應(yīng)擴(kuò)增后的所述特異性引物的克隆病毒的基因片斷中的SNP位點(diǎn)所在的片斷，進(jìn)行所述PCR反應(yīng)產(chǎn)物的酶切鑒定；所述SNP位點(diǎn)為單核苷酸的多態(tài)性。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述針對(duì)患病雞群J亞型禽白血病的診斷方法，其特征是，所述特異性引物的克隆病毒的培養(yǎng)與增殖有以下步驟：
1)取研磨好的制備雞胚的病毒肝組織，進(jìn)行所述特異性引物的克隆病毒的培養(yǎng)與增殖；反復(fù)凍融后，用磷酸鹽緩沖液進(jìn)行5倍稀釋，經(jīng)0.45μm無(wú)菌濾器過(guò)濾后，在－20℃溫度下儲(chǔ)存?zhèn)溆?，待所述雞胚的病毒肝組織中的纖維細(xì)胞長(zhǎng)成近80％單層細(xì)胞時(shí)，用無(wú)血清培養(yǎng)液洗滌所述雞胚的病毒肝組織中的纖維細(xì)胞兩次；
2)每個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)瓶接種病毒懸液0.2ml，用雞胚的正常肝組織中的纖維細(xì)胞做陰性對(duì)照，37℃電感作用1小時(shí)，在所述每個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)瓶中加入5ml無(wú)血清的無(wú)機(jī)鹽溶液和平衡鹽溶液(Hanks)培養(yǎng)液，在37℃條件下進(jìn)行培養(yǎng)，形成細(xì)胞懸液，7日后收獲病毒，反復(fù)凍融三次后，－20℃貯存?zhèn)溆谩?/p>
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述針對(duì)患病雞群J亞型禽白血病的診斷方法，其特征是，提取所述特異性引物的克隆病毒的DNA有以下步驟：
1)取1000μl所述細(xì)胞懸液，用4000rpm的離心速度進(jìn)行離心1分鐘，棄上清，用450μlTE緩沖液(pH＝8.0)重懸細(xì)胞沉淀，向其中加入50μl10％十二烷基硫酸鈉(終濃度為1％)，加入2μl蛋白酶K(使用濃度為50μg/ml)，輕輕混勻，在56℃水浴中消化過(guò)夜；
2)經(jīng)三羥甲基氨基甲烷飽和酚，氯仿抽提后，取上清，用等體積的異丙醇-20℃沉淀過(guò)夜，隔日將樣品在4℃和在12000rpm離心速度下進(jìn)行離心12分鐘，沉淀用70％乙醇洗滌，真空抽干，用30μlTE緩沖液重懸細(xì)胞沉淀，并于37℃條件下用核糖核酸酶消化30分鐘后，在4℃條件下進(jìn)行保存。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述針對(duì)患病雞群J亞型禽白血病的診斷方法，其特征是，所述使用PCR反應(yīng)進(jìn)行擴(kuò)增所述特異性引物的克隆病毒的基因片斷有以下步驟：
1)采用所述特異性引物的上游引物(引物序列為T(mén)ATTGCTGTTTCATCGTTA)、所述特異性引物的下游引物(引物序列為GTGCGTGGTTATTATTTCC)進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系，所述特異性引物的所述PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系的反應(yīng)液的容積為100μl；
所述PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系的反應(yīng)液的組成為：10×PCR反應(yīng)緩沖液10μl (2.5mmol/L)、脫氧核糖核苷三磷酸8μl(2.5mmol/L)、所述所述特異性引物的上游引物29μl(10pmol/L)、所述特異性引物的下游引物40μl(10pmol/L)、鎂離子終濃度為1.05pmol/L、高保真taq酶濃度為0.08pmol/L、模板脫氧核糖核酸10μl，并用去離子水將所述PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系的反應(yīng)液補(bǔ)至100μl；
2)進(jìn)行反應(yīng)，條件為：在90℃條件下預(yù)變性3分鐘，進(jìn)行30個(gè)循環(huán)，一個(gè)循環(huán)周期為90℃條件下變性，57℃退火1分鐘，72℃延長(zhǎng)2分鐘，最后72℃延伸0分鐘，得到所述PCR反應(yīng)產(chǎn)物，并在4℃條件下進(jìn)行保存。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述針對(duì)患病雞群J亞型禽白血病的診斷方法，其特征是，所述PCR反應(yīng)產(chǎn)物的電泳檢測(cè)有以下步驟：
1)取所述PCR反應(yīng)產(chǎn)物4.5μl混合0.5μl 10×上樣緩沖液的上樣于0.8％瓊脂糖凝膠中，上樣的電壓為120V；
2)至溴酚藍(lán)指示劑泳過(guò)所述瓊脂糖凝膠的中線后，將所述瓊脂糖凝膠取出，置于紫外透視儀下檢測(cè)電泳結(jié)果，并使用DL15000型號(hào)的DNAMarker構(gòu)建分子圖譜，所述DNAMarker作為一種分子標(biāo)記(Marker)，用于構(gòu)建分子圖譜。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述針對(duì)患病雞群J亞型禽白血病的診斷方法，其特征是，所述PCR反應(yīng)產(chǎn)物的膠回收有以下步驟：
1)制做1％低溶點(diǎn)的所述瓊脂糖凝膠；
制作過(guò)程如下：置一收集管，將所述PCR反應(yīng)產(chǎn)物與所述10×上樣緩沖液混合加于所述收集管的上樣孔中，在電壓80V，電泳20min條件下，切下所述擴(kuò)增目的基因片斷進(jìn)行回收，按每100mg瓊脂糖加入300μl的所述特異性引物(序列為T(mén)TTGGATCCGTGGGGGGAGTTCATCTGTTG)的比例形成特異性引物液，并在55℃條件下溫浴10min，每隔2min顛倒混勻一次，使所述瓊脂糖完全融化，形成所述瓊脂糖凝膠；
2)再加入1/3所述所述特異性引物的體積的異丙醇，混勻，在55℃條件下溫浴1min，將融化后的所述瓊脂糖液移入吸附柱，用14000Rpm的離心速度離心1min，倒掉所述收集管中的液體，將所述吸附柱放入所述收集管中；在所述吸附柱中加入450μl的所述所述特異性引物，靜置1min后，用14000Rpm的離心速度離心15s，倒掉收集管中的液體，將所述吸附柱放入所述收集管中，用14000Rpm的離心速度離心1min后，將所述吸附柱放入一個(gè)干凈的1.5mlEP管中，在吸附膜中央加入30μl的所述所述特異性引物，靜置1min后，離心1min，用1％濃度瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行純化帶有所述擴(kuò)增目的基因片斷的所述PCR反應(yīng)產(chǎn)物，得到所述PCR反應(yīng)產(chǎn)物中的純化后的基因片斷，并在-20℃條件下保存?zhèn)溆谩?/p>
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述針對(duì)患病雞群J亞型禽白血病的診斷方法，其特征是，所述PCR反應(yīng)產(chǎn)物的酶切鑒定有以下步驟：
1)根據(jù)ALV-J的原型株的并在-20℃條件下脫氧核糖核酸序列，在所述PCR反應(yīng)產(chǎn)物中的純化后的基因片斷中，尋找兩個(gè)單酶切位點(diǎn)，用于酶切鑒定，共10μl體系；所述ALV-J為針對(duì)患病雞群J亞型禽白血病的一種病毒J亞群；
2)取8.5μl經(jīng)過(guò)膠回收試劑盒回收的所述PCR反應(yīng)產(chǎn)物，加入1μl的所述上樣緩沖液，加ApaⅠ內(nèi)切酶7.5U，同時(shí)在相同劑量的情況下，用PvuⅡ限制性內(nèi)切酶進(jìn)行酶切鑒定。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述針對(duì)患病雞群J亞型禽白血病的診斷方法，其特征是，所述構(gòu)建重組質(zhì)粒有以下步驟：
1)將所述PCR反應(yīng)產(chǎn)物與高效克隆TA的載體pMD18-T連接，取3μl膠回收產(chǎn)物，向其中加入5μl連接緩沖液，用水補(bǔ)至10μl，于16℃水浴中反應(yīng)形成連接產(chǎn)物，然后隔夜后將所述連接產(chǎn)物進(jìn)行轉(zhuǎn)化；
2)取一管100μl體積的感受態(tài)細(xì)胞JM109，融化后立即加入10μl上述所述連接產(chǎn)物，混勻后冰上放置30min，并在33℃條件下熱休克90S，冰浴2min，加入預(yù)熱到37℃的無(wú)抗生素LB液體培養(yǎng)基100μl，37℃振搖培養(yǎng)60min，將此200μl體系均勻涂布于含有異丙基硫代半乳糖苷和氨芐青霉素抗性的所述無(wú)抗生素LB液體培養(yǎng)基的瓊脂平板上(Amp+)，并在30℃條件下進(jìn)行培養(yǎng)12小時(shí)，然后用陽(yáng)性重組質(zhì)粒(pMD18-T-JL-2/env)進(jìn)行篩選；
3)挑取白色菌落于5ml所述無(wú)抗生素LB液體培養(yǎng)基(含50μg/mlAmp)中，并在30℃條件下振搖培養(yǎng)15小時(shí)(225轉(zhuǎn)/分)得到培養(yǎng)物，小量堿法提取質(zhì)粒，取1.5ml所述培養(yǎng)物，在4℃條件下用14000Rpm的離心速度離心1min，棄上清，使沉淀盡可能干燥；計(jì)體積，加等量酚/氯仿，振蕩混勻，在4℃條件下用12000Rpm的離心速度離心10min，取上層液體，計(jì)算體積；
4)重復(fù)前步實(shí)驗(yàn)一次，在所述上層液體中加入2倍體積預(yù)冷的乙醇，-30℃沉淀20min，在4℃條件下用12000Rpm的離心速度離心15min，棄上清，用500μl的70％乙醇洗滌沉淀，沉淀真空抽干，用40μlTE緩沖液進(jìn)行溶解，加入RNA酶37℃作用30分鐘，即為提取的所述重組質(zhì)粒，-20℃保存?zhèn)溆?，根?jù)所述高效克隆TA的載體pMD18-T的酶切圖譜，對(duì)所述重組質(zhì)粒進(jìn)行酶切分析，找到所述重組質(zhì)粒的載體上的單酶切位點(diǎn)，分別用HindⅢ限制性內(nèi)切酶(HindⅢ)，BamHⅠ限制性內(nèi)切酶(BamHⅠ)進(jìn)行單酶切和雙酶切鑒定。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述針對(duì)患病雞群J亞型禽白血病的診斷方法，其特征是，所述使用PCR反應(yīng)擴(kuò)增后的所述特異性引物的克隆病毒的基因片斷中的SNP位點(diǎn)所在的片斷，進(jìn)行PCR反應(yīng)產(chǎn)物的酶切鑒定有以下步驟：
1)PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系準(zhǔn)備，在200μl的PCR薄壁管中，加入1μl的模板DNA(50ng/μl)、2μl10×PCR反應(yīng)緩沖液、0.8ul脫氧核糖核苷三磷酸(dNTP)、0.1μl的TaqDNA聚合酶(5U/ul)，加水至20ul，充分混勻后短暫離心，在PCR儀上設(shè)置如下PCR反應(yīng)程序：先在94℃條件下變性4分鐘；再經(jīng)過(guò)35個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)包括94℃40秒、56℃50秒、72℃20秒；然后在73℃條件下延長(zhǎng)至7分鐘、最后在4℃條件下保存；所述PCR反應(yīng)程序設(shè)置完畢后，將所述PCR薄壁管放入所述PCR儀進(jìn)行反應(yīng)擴(kuò)增，反應(yīng)結(jié)束后，取4μl所述PCR反應(yīng)產(chǎn)物在2％所述瓊脂糖凝膠，1×Tris硼酸(TBE)中電泳條件下，檢測(cè)所述PCR擴(kuò)增SNP位點(diǎn)所在片斷的大小，判定所述PCR反應(yīng)產(chǎn)物中的純化后的基因片斷是否正確；
2)在200μl的所述PCR薄壁管中加入酶切反應(yīng)體系：5μlPCR反應(yīng)產(chǎn)物、所述瓊脂糖凝膠1μl10倍緩沖液、1ulTscAI酶(10U/ul)加水至15μl，65℃消化2.5h，酶切結(jié)果鑒定，全部酶切產(chǎn)物在55℃條件下，在所述瓊脂糖凝膠中，1×TBE中電泳條件下，判定酶切結(jié)果，進(jìn)行基因分型，分型依據(jù)為，酶切產(chǎn)物為119bp和101bp兩條帶則為T(mén)T基因型，酶切產(chǎn)物為225bp則為CC基因型，三條帶的則為雜合型CT基因型。