本發(fā)明涉及生物技術領域，特別提供了一種適合規(guī)模化生產(chǎn)的雨生紅球藻綠色細胞保藏以及后續(xù)蝦青素誘導的方法。
背景技術：
在雨生紅球藻的大規(guī)模養(yǎng)殖中，通常采用兩步法進行培養(yǎng)：第一步為綠色擴培，在環(huán)境適宜、營養(yǎng)豐富的條件下雨生紅球藻以綠色的營養(yǎng)細胞形態(tài)存在，在這個過程中藻細胞分裂繁殖，產(chǎn)生大量帶鞭毛的游動細胞，此時細胞脆弱，對光、溫度等環(huán)境因素敏感，因此，綠色擴培通常在溫度與光照控制良好的室內(nèi)進行。第二步為蝦青素誘導，將綠色細胞置于不利的環(huán)境條件，細胞失去鞭毛，以不動的厚壁孢子形態(tài)存在，這時細胞內(nèi)會積累大量的蝦青素以對抗不利的環(huán)境條件，由于需要高光照的刺激，因此，蝦青素誘導通常在室外進行。在實際的生產(chǎn)過程中，尤其是在北方地區(qū)，冬季室外溫度低，無法進行蝦青素的誘導培養(yǎng)，養(yǎng)殖企業(yè)不得不面對冬季停產(chǎn)的困境，造成設施和人員的閑置和浪費。而綠色擴培階段是在室內(nèi)進行，不受氣候條件的影響。因此，如果能夠將冬季室內(nèi)生產(chǎn)的綠色細胞進行保藏，待春季氣溫回升之后再進行蝦青素誘導，可以實現(xiàn)全年的生產(chǎn)，提高蝦青素的產(chǎn)量。
藻種保藏常用的方法主要是低溫（4℃）、冷凍（-20）、超低溫保藏（-60~-196℃）等，其中超低溫保藏法僅適用于少量藻種的保藏，低溫保藏法中藻細胞存在一定的生理活動，隨時間延長，藻細胞逐漸降解，同時由于細菌在低溫條件下仍然會繁殖，長時間保藏也會腐敗變質。冷凍保藏法能夠保藏較長時間，同時工藝相對簡單，具備規(guī)?；寮毎２氐臐摿?。
由于不同藻種對冷凍條件的耐受性不同，這也導致了不同微藻冷凍保藏時的方法和結果有很大差別。文章《3種優(yōu)質海洋微藻的低溫保存研究》報道了在-20℃條件下保存亞心型扁藻、三角褐指藻、球等鞭金藻的方法，但僅扁藻在10%DMSO+10%蔗糖條件下的存活率達到60.2%，但解凍后的生長速率僅為0.12 d-1，其他兩種藻的存活率極低。文章“海鏈藻絮凝和凝后保存技術研究”報道了使用10%甘油在-20℃條件下保存殼聚糖絮凝的海鏈藻，在保藏后比生長速率稍有降低，但是由于甘油粘稠，不易除去，后續(xù)培養(yǎng)中易造成污染。專利201010222005.0公開了一種保藏小球藻、葡萄藻、小環(huán)藻、微綠球藻、硅藻藻種的方法，采用-60℃低溫預凍后冷凍真空干燥的工藝，但該方法生產(chǎn)成本高，只適合小量的菌種保藏，不適合規(guī)?；瘧?。
雨生紅球藻綠色擴培的細胞脆弱，在冷凍保藏過程中鞭毛易受到冰晶和冷凍劑的損傷和毒害，同時后續(xù)的蝦青素誘導需要高光、高鹽、營養(yǎng)缺失等條件的刺激，因此，冷凍保藏細胞活性的保持以及后續(xù)的誘導方法是需要解決的關鍵問題。另外，規(guī)?；G色擴培細胞密度通常不高，培養(yǎng)體積大，因此將細胞濃縮為藻泥的狀態(tài)可以減小保藏體積，降低生產(chǎn)成本。但目前尚未有關于雨生紅球藻藻泥大規(guī)模保藏以及后續(xù)蝦青素誘導方法的相關報道。而現(xiàn)有的微藻保藏方法存在成本高、存活度低、局限于部分藻種、不適合規(guī)?；a(chǎn)等缺點，無法應用于雨生紅球藻的生產(chǎn)過程中。
因此，需要開發(fā)雨生紅球藻規(guī)模化生產(chǎn)過程中綠色細胞冷凍保藏以及后續(xù)保藏細胞的復蘇與蝦青素誘導工藝。
技術實現(xiàn)要素：
為解決以上問題，本發(fā)明提供了一種適合規(guī)模化生產(chǎn)的雨生紅球藻綠色細胞保藏以及后續(xù)蝦青素誘導的方法，采用的技術方案如下：
（a）藻泥制備：將處于對數(shù)生長期的雨生紅球藻藻液收集于不銹鋼攪拌罐中進行靜置沉降，去除部分上清培養(yǎng)基，得到細胞密度為10~20 g/L的濃縮藻液；將凍存液按照0.5~10：1的體積比加入到濃縮藻液中，攪拌混合均勻，再加入質量比為0.5~20%（w/v）的脫脂乳粉，攪拌混勻后離心去除上清液，得到用于冷凍保藏的藻泥；
（b）冷凍保藏：將制備好的藻泥迅速置于4℃預冷4~12小時，然后轉入到-5~-20℃冷凍保藏，保藏周期30~100天；
（c）細胞活化：將冷凍保藏的藻泥置于20℃水浴融化，然后利用0.1~1.0%（w/v）的氯化鈉溶液，結合離心、沉降或過濾等方法洗脫凍存劑。將清洗后的藻細胞按照0.2~0.8 g/L的濃度接種到低氮BG11培養(yǎng)基，在弱光條件下通氣培養(yǎng)，其中光強為10~50 μmol m-2 s-1，溫度為15~25℃，活化時間為2~4天；
（d）蝦青素誘導：藻細胞完成活化培養(yǎng)后，培養(yǎng)基中的氮基本消耗完畢，此時加入濃度為10~100 mM的碳源，并將藻液置于室外光生物反應器中進行誘導培養(yǎng)以積累蝦青素，培養(yǎng)周期為5~10天。
優(yōu)選的，步驟（a）中的凍存液為濃度1~20%（v/v）的DMSO或甘油，使用前需要4℃預冷。
優(yōu)選的，步驟（a）中的攪拌、離心操作需要在4℃進行
優(yōu)選的，步驟（a）中的藻泥的含水率為70~90%（w/w）。
優(yōu)選的，步驟（c）中的低氮BG11培養(yǎng)基氮源為硝酸鹽，濃度為0.5~2 mM。
優(yōu)選的，步驟（d）中的碳源包括碳酸氫鹽、碳酸鹽、醋酸鹽、檸檬酸鹽、乙醇中一種或多種。
本發(fā)明首先通過凍存劑與濃縮藻液攪拌混合的方式，實現(xiàn)凍存劑對藻細胞充分的接觸和保護，而添加脫脂乳一方面可以減少冷凍劑的使用量，另一方面可以降低凍存劑對藻細胞的傷害。而后通過離心去除多余的水分，獲得體積更小的藻泥，可以降低冷凍保藏環(huán)節(jié)的設備需求和運行成本。在細胞活化過程中，采用氯化鈉溶液進行洗脫，可以減少凍存劑對藻細胞后續(xù)培養(yǎng)的毒性，同時利用低氮、弱光的預培養(yǎng)，實現(xiàn)藻細胞的活化，避免誘導階段過強的環(huán)境刺激導致細胞的漂白死亡。另外，低氮條件可以保證細胞完成活化后處于營養(yǎng)缺失的誘導條件，并通過在培養(yǎng)基中添加碳源，實現(xiàn)活化細胞的快速誘導和蝦青素積累。本發(fā)明提供的雨生紅球藻綠色細胞保藏以及后續(xù)的蝦青素誘導工藝，操作簡單，適合大規(guī)模生產(chǎn)應用，可以有效地解決生產(chǎn)企業(yè)冬季停產(chǎn)的困境，實現(xiàn)冬季生產(chǎn)的綠色藻細胞在春季進行蝦青素誘導，提高設備和人員的生產(chǎn)效率以及蝦青素的產(chǎn)量。
具體實施方式
下面結合實施例對本發(fā)明做進一步詳細的描述，但僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。其他任何未背離本發(fā)明的精神實質與原理下所作的改變、修飾、替代、結合、簡化，均為等效形式，同樣落于本申請所附權利要求書所限定的范圍。
實施例1
（1）藻泥制備：將處于對數(shù)生長期的雨生紅球藻藻液收集于10 m3不銹鋼攪拌罐，裝液量為7 m3。攪拌罐在4℃條件下靜置沉降6~12小時，去除部分上清培養(yǎng)基，得到細胞密度為10~20 g/L的濃縮藻液。將4℃預冷的濃度為1~20%（v/v）的DMSO按照0.5~10：1的體積比加入到濃縮藻液中，攪拌混合均勻，轉速為10~50 rpm，攪拌時間為5~30 min。而后加入質量比為0.5%-20%（w/v）的脫脂乳粉，攪拌混勻后，1000~5000 rpm離心去上清，得到用于冷凍保藏的藻泥，含水率為70~90%（w/w）。
（2）冷凍保藏：將制備好的藻泥迅速置于4℃預冷4~12小時，然后轉入到-20℃冷凍保藏90天。
（3）細胞活化：將冷凍保藏的藻泥置于20℃水浴融化，然后按體積比2：1比例加入0.1~1.0%（w/v）的氯化鈉溶液混合攪拌均勻，1000~5000 rpm離心去除上清液。將清洗后的藻細胞按照0.2~0.8 g/L的濃度接種到硝酸鹽濃度為0.5~2 mM的低氮BG11培養(yǎng)基，在室內(nèi)光徑為10 cm的玻璃平板式光生物反應器中進行通氣培養(yǎng)，其中光強為10~50 μmol m-2 s-1，溫度為15~25℃，活化培養(yǎng)時間為2~4天。每天取樣觀察細胞狀態(tài)，結果顯示部分藻細胞進入分裂增殖的狀態(tài)，極少量漂白細胞，細胞數(shù)目和干重均有較多增長。
（4）蝦青素誘導：藻細胞活化培養(yǎng)過程中取樣測定培養(yǎng)基氮含量，待氮基本消耗完畢，加入濃度為10~100 mM的醋酸鹽和碳酸氫鹽的混合碳源，并將藻液置于室外光徑為5 cm的薄膜立柱式光生物反應器中進行誘導培養(yǎng)。培養(yǎng)季節(jié)為3月份，培養(yǎng)期間室外溫度14.3~27.6℃，白天最高光照強度800~1800 μmol m-2 s-1。培養(yǎng)5~10天后，采用改良的Boussiba測定蝦青素含量。結果顯示，進行誘導培養(yǎng)后，藻細胞迅速積累蝦青素，由綠色細胞向紅色細胞轉變，培養(yǎng)結束時，基本所有細胞都轉化為紅色不動細胞，僅有少量細胞漂白，最終的干重為1.5~1.8 g L-1，其蝦青素含量為3.2~3.6%，相比于正常擴培后直接誘導的對照組沒有明顯差別。
實例說明了采用上述方法經(jīng)過冬季90天的保藏，雨生紅球藻綠色細胞活性保持完整。春季氣溫轉暖后，結合活化后再誘導的方案，冷凍保藏的藻細胞可以正常進行蝦青素的誘導生產(chǎn)。
此外，需要說明的是，本說明書中所描述的具體實施例，其各部分名稱等可以不同，凡依本發(fā)明專利構思所述的構造、特征及原理所做的等效或簡單變化，均包括于本發(fā)明專利的保護范圍內(nèi)。本發(fā)明所屬技術領域的技術人員可以對所描述的具體實施例做修改或補充或采用類似的方式替代，只要不偏離本發(fā)明的結構或者超越本權利要求書所定義的范圍，均應屬于本發(fā)明的保護范圍。