本發(fā)明涉及用于檢測GATA4基因SNP位點rs904018基因型的試劑盒。

背景技術(shù)：

GATA4位于染色體8q23.1，cDNA全長3414bp，包括6個外顯子，編碼由442個氨基酸組成的蛋白質(zhì)，在進化中高度保守。GATA4由N端的轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域、中間兩個鄰近的鋅指結(jié)構(gòu)域和C端的轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域構(gòu)成，其中的鋅指結(jié)構(gòu)域Cys-X2-Cys-X17-Cys-X2-Cys可與靶基因啟動子區(qū)的DNA序列元件5’-(A/T)GATA(A/G)-3’結(jié)合，從而調(diào)節(jié)下游靶基因的轉(zhuǎn)錄活性。

GATA4作為鋅指蛋白轉(zhuǎn)錄激活因子，為GATA基因家族之一，在心臟發(fā)育的早期對心管的形成以及心臟原基細胞的分化、轉(zhuǎn)移起調(diào)控作用。在常染色體顯性遺傳中，GATA4基因突變與大多數(shù)房間隔缺損有關(guān)，部分患者合并室間隔缺損、肺動脈狹窄等，并且伴有嚴重的舒張功能障礙和房室返流病變，說明GATA4基因在人類心臟發(fā)育過程中也具有重要的調(diào)控作用，GATA4基因雜合突變可能導(dǎo)致單倍型不足或顯性負性效應(yīng)，引發(fā)先天性心臟病。

高分辨率熔解曲線（high resolution melting, HRM）是在常規(guī)聚合酶鏈式反應(yīng)（PCR）過程中飽和熒光染枓如Eva Green與DNA雙鏈結(jié)合，當(dāng)通過加熱升溫使DNA雙鏈解離時，熒光染料從局部解鏈的DNA分子上釋放，由于突變、SNP位點雙鏈堿基間不匹配會使雙鏈DNA在此位點首先解開，通過實時監(jiān)測升溫過程中的熒光強度，從熒光強度與時間軸曲線上便可判斷是否存在突變或SNP。不同位點、雜合子與否、GC含量、擴增子長度等都會影響熔解曲線的峰形，所以HRM分析能夠有效區(qū)分不同突變位點、SNP位點和擁有不同GC含量的擴增片段。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明提供了用于檢測GATA4基因SNP位點rs904018基因型的試劑盒，檢測結(jié)果可用于GATA4基因SNP rs904018相關(guān)的先天性房間隔缺損型心臟病的輔助診斷。

本發(fā)明的第一個目的是提供用于檢測GATA4基因SNP位點rs904018基因型的試劑盒，所述試劑盒包括引物對和PCR檢測反應(yīng)試劑；其中，所述引物對為（1）或（2）中的一種：

（1）上游引物：GATA4-F 5'- CACCGCCCTGCATCCCTAAT-3'

下游引物：GATA4-R 5'- GGTGGGTTAAGTGCCCCTG-3'；

（2）與（1）中的互補序列。

上述引物的衍生序列也在本發(fā)明的保護范圍，所述衍生序列為向5’端和/或3’端方向延伸一致數(shù)個堿基或刪減一致數(shù)個堿基得到的序列。

作為優(yōu)選，所述PCR檢測反應(yīng)試劑包括含EvaGreen 的Green-2-Go qPCRMastermix。

作為優(yōu)選，所述PCR擴增時的反應(yīng)體系為：

Green-2-Go qPCRMastermix（含EvaGreen） 5μl

引物F（10μM） 0.1μl

引物R（10μM） 0.1μl

模板（50ng/μl） 0.5μl

ddH₂O 4.3μl

總體積 10μl。

作為優(yōu)選，所述試劑盒還包括標準品，所述標準品為重組陰性質(zhì)粒和重組陽性質(zhì)粒，所述重組陰性質(zhì)粒的核苷酸序列為序列表SEQ ID No.1，所述重組陽性質(zhì)粒的核苷酸序列為序列表中SEQ ID No.2。

本發(fā)明的第二個目的是提供一種檢測GATA4基因SNP位點rs904018基因型的方法，步驟如下：

（1）構(gòu)建重組陰性質(zhì)粒和重組陽性質(zhì)粒：所述重組陰性質(zhì)粒的核苷酸序列為序列表中SEQ ID No.1，所述重組陽性質(zhì)粒的核苷酸序列參見序列表中SEQ ID No.2；

（2）構(gòu)建PCR擴增時的引物對，所述引物對為a或b中的一種：

a、上游引物：GATA4-F 5'- CACCGCCCTGCATCCCTAAT-3'

下游引物：GATA4-R 5'- GGTGGGTTAAGTGCCCCTG-3'；

b、與a中的互補序列；

（3）提取待測樣本的外周血基因組DNA，對重組陰性質(zhì)粒、重組陽性質(zhì)粒和待測樣本的DNA均使用步驟（2）所述引物，且在同一條件下進行PCR擴增和HRM分析，收集數(shù)據(jù)；

作為優(yōu)選，所述HRM分析的條件為：94℃ 90s；60℃ 30s；83-94℃收集數(shù)據(jù)，溫度上升速率為0.06℃/s；

（4）根據(jù)收集數(shù)據(jù)繪制高分辨率熔解曲線，根據(jù)重組陰性質(zhì)粒、重組陽性質(zhì)粒的熔解曲線判斷待測樣本GATA4基因SNP位點rs904018的基因型：

與重組陰性質(zhì)粒的熔解曲線重合則GATA4基因SNP位點rs904018的基因型為TT；

與重組陽性質(zhì)粒的熔解曲線重合則GATA4基因SNP位點rs904018的基因型為CC；

在重組陰性質(zhì)粒和重組陽性質(zhì)粒之間的則GATA4基因SNP位點rs904018的基因型為TC。

作為優(yōu)選，所述PCR擴增時的反應(yīng)體系為：

Green-2-Go qPCRMastermix（含EvaGreen） 5μl

引物F（10μM） 0.1μl

引物R（10μM） 0.1μl

模板（50ng/μl） 0.5μl

ddH₂O 4.3μl

總體積 10μl。

作為優(yōu)選，所述PCR擴增時的反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性3min；94℃變性10s；60℃退火/延伸20s；40個循環(huán)。

本發(fā)明的第三個目的是提供上述試劑盒的使用方法，步驟如下：

（1）提取待測樣本的外周血基因組DNA，對重組陰性質(zhì)粒、重組陽性質(zhì)粒和待測樣本的DNA均使用相同引物，且在同一條件下進行PCR擴增和HRM分析，收集數(shù)據(jù)；

所述HRM分析的條件為：94℃ 90s；60℃ 30s；83-94℃收集數(shù)據(jù)，溫度上升速率為0.06℃/s；

（2）根據(jù)收集數(shù)據(jù)繪制高分辨率熔解曲線，根據(jù)重組陰性質(zhì)粒、重組陽性質(zhì)粒的熔解曲線判斷待測樣本GATA4基因SNP位點rs904018的基因型：

與重組陰性質(zhì)粒的熔解曲線重合則GATA4基因SNP位點rs904018的基因型為TT；

與重組陽性質(zhì)粒的熔解曲線重合則GATA4基因SNP位點rs904018的基因型為CC；

在重組陰性質(zhì)粒和重組陽性質(zhì)粒之間的則GATA4基因SNP位點rs904018的基因型為TC。

本發(fā)明的第四個目的是提供上述試劑盒在制備輔助診斷室間隔缺損型心臟病的試劑中的應(yīng)用。

本發(fā)明的試劑盒能夠準確檢測GATA4基因SNP位點rs904018的基因型，靈敏度高，特異性好，檢測迅速；應(yīng)用本發(fā)明的試劑盒對GATA4基因SNP位點rs904018基因型的分型與測序結(jié)果完全一致，能夠用于室間隔缺損型心臟病的輔助判斷，對后續(xù)先天性心臟病的研究具有重要意義。

附圖說明

附圖用來提供對本發(fā)明的進一步理解，并且構(gòu)成說明書的一部分，與本發(fā)明的實施例一起用于解釋本發(fā)明，并不構(gòu)成對本發(fā)明的限制。在附圖中：

圖1為本發(fā)明的HRM方法靈敏度實驗結(jié)果。

圖2為樣本用本發(fā)明的HRM方法分析結(jié)果：其中a代表純合突變型序列，b代表野生型序列，c為雜合突變序列。

圖3為樣本的GATA4 rs904018（c.*532T>C）位點的測序結(jié)果；其中a代表純合突變型序列，b代表雜合突變型序列，c為野生型序列。

具體實施方式

以下的實施例便于更好地理解本發(fā)明，但并不限定本發(fā)明。下述實施例中的實驗方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實施例中所用的試驗材料，如無特殊說明，均為市售。本申請所用引物和所用序列合成及測序工作均由生工生物工程（上海）股份有限公司完成。

實施例1 GATA4 rs904018標準品的制備

要建立HRM分析方法，首先必須制備方法所需的外部標準品，標準品應(yīng)包含高度保守和特異性的序列，要保證反應(yīng)的高特異性。本發(fā)明合成包含GATA4 rs904018（c.*532T>C）位點的野生型和純合突變型DNA序列，利用基因重組技術(shù)將其克隆到pMD18-T載體中，構(gòu)建出pMD18-T-rs904018的野生型和純合突變型重組質(zhì)粒，并進行相應(yīng)的PCR鑒定和測序鑒定，最后經(jīng)定量后作為待建立方法的標準品：野生型重組質(zhì)粒為重組陰性質(zhì)粒，純合突變型重組質(zhì)粒為重組陽性質(zhì)粒，為下一步的方法及評估奠定基礎(chǔ)。

一、重組陰性和陽性質(zhì)粒pMD18-T-rs904018的構(gòu)建和轉(zhuǎn)化

1.合成GATA4 rs904018（c.*532T>C）野生型和純合突變型DNA序列，本發(fā)明合成的序列400bp，序列如下：

（1）野生型序列

TGCATCTCTCCTGTGAGTTGGAGACTTCTTTCCCAAGATGTCCTTGTCCCCTGCGTTCCCCACTGTGGCCTAGACCGTGGGTTTTGCATTGTGTTTCTAGCACCGAGGATCTGAGAACAAGCGGAGGGCCGGGCCCTGGGACCCCTGCTCCAGCCCGAATGACGGCATCTGTTTGCCATGTACCTGGATGCGACGGGCCCCTGGGGACAGGCCCTTGCCCCATCCATCCGCTTGAGGCATGGCACCGCCCTGCATCCCTAATACCAAATCTGACTCCAAAATTGTGGGGTGTGACATACAAGTGACTGAACACTTCCTGGGGAGCTACAGGGGCACTTAACCCACCACAGCACAGCCTCATCAAAATGCAGCTGGCAACTTCTCCCCCAGGTGCCTTCCC

（2）純合突變型序列

TGCATCTCTCCTGTGAGTTGGAGACTTCTTTCCCAAGATGTCCTTGTCCCCTGCGTTCCCCACTGTGGCCTAGACCGTGGGTTTTGCATTGTGTTTCTAGCACCGAGGATCTGAGAACCAGCGGAGGGCCGGGCCCTGGGACCCCTGCTCCAGCCCGAATGACGGCATCTGTTTGCCATGTACCTGGATGCGACGGGCCCCTGGGGACAGGCCCTTGCCCCATCCATCCGCTTGAGGCATGGCACCGCCCTGCATCCCTAATACCAAATCTGACTCCAAAATTGTGGGGTGTGACACACAAGTGACTGAACACTTCCTGGGGAGCTACAGGGGCACTTAACCCACCACAGCACAGCCTCATCAAAATGCAGCTGGCAACTTCTCCCCCAGGTGCCTTCCC

其中標有下劃線的堿基為基因突變位點。

2.連接反應(yīng)：將上述合成的DNA片段與pMD18-T進行連接，采用如下連接體系進行配制：

pMD18-T 1μL

DNA 2μL

SolutionI 5μL

ddH₂O 2μL

總體積 10μL

配制完成后置于16℃進行過夜連接反應(yīng)。

3. pMD18-T-rs904018質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化以及PCR鑒定

（1）從-80℃的超低溫冰箱中取出凍存的DH5α感受態(tài)細胞，置于冰盒上使其解凍；

（2）取連接產(chǎn)物10μL加入50μL的DH5α感受態(tài)細胞中，輕輕搖勻后置冰浴30分鐘；

（3）42℃水浴熱激90秒，熱激后立即置冰上冷卻2min；

（4）于1.5ml EP管中加入預(yù)冷的1ml的不含抗性的LB液體培養(yǎng)基吹打混勻后，37℃ 120轉(zhuǎn)/分輕搖培養(yǎng)90min；

（5）將上述培養(yǎng)液短暫離心吸去900μl后取剩余的100μl涂布于含Amp抗生素的LB平板上，正面向上放置30min，待菌液完全被培養(yǎng)基吸收后，倒置培養(yǎng)皿37℃恒溫箱培養(yǎng)過夜；

（6）從平板上挑取單克隆菌落于500μL Amp抗性LB液體培養(yǎng)基的1.5ml EP管中，37℃ 220rpm振蕩培養(yǎng)5-6小時；

（7）取1μL作為模板進行菌液PCR鑒定。將鑒定為陽性的菌液加入到20ml的LB液體培養(yǎng)基中進行擴搖；

（8）用引物GATA4-F和GATA4-R擴增上述稀釋菌液，PCR產(chǎn)物采用2%瓊脂糖凝膠電泳，通過檢測PCR產(chǎn)物鑒定陽性轉(zhuǎn)化子。

引物序列為HRM分析所用引物，序列如下：

上游引物：GATA4-F 5'- CACCGCCCTGCATCCCTAAT-3'

下游引物：GATA4-R 5'- GGTGGGTTAAGTGCCCCTG-3' 。

體系如下：

10×PCR buffer 2μL

dNTP（2.5μM） 2μL

引物F（5μM） 1.5μL

引物R（5μM） 1.5μL

模板 2μL

Taq酶（5U） 0.5μL

ddH₂O 10.5μL

總體積 20μL。

擴增程序/反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性5min；94℃ 30s、60℃ 30s、72℃ 30sec，35個循環(huán)；72℃ 10min。

重組陰性和重組陽性質(zhì)粒提取

采用北京百泰克公司生產(chǎn)的質(zhì)粒制備試劑盒提取重組質(zhì)粒，測定濃度和純度，同時取10ul純化質(zhì)粒送至上海生物工程有限公司進行測序，確定插入片段的基因序列與目的序列一致。

二、標準品的獲取和定量

（1）將步驟一得到的凍存的含有重組質(zhì)粒pMD18-T-rs904018的大腸桿菌DH5α100μl接種于15ml氨芐抗性的LB液體培養(yǎng)基中，37℃ 220rpm培養(yǎng)14-16h；

（2）采用北京百泰克生物科技有限公司生產(chǎn)的質(zhì)粒制備試劑盒提取重組質(zhì)粒；

（3）利用北京百泰克生物科技有限公司的超微量紫外可見分光光度計（ND5000）對提取的質(zhì)粒測定濃度，根據(jù)A₂₆₀/A₂₈₀判斷質(zhì)粒的純度。A₂₆₀/A₂₈₀=1.79。

實施例2 HRM-PCR檢測GATA4 rs904018方法的建立

一、待測樣本的制備

提取30例樣本的外周血基因組DNA，用作GATA4基因PCR擴增的模板。具體提取步驟為：

（1）取1ml全血，加入3ml TE，顛倒混勻后靜置10min，8000rpm離心5分鐘，棄上清液；

（2）重復(fù)上述步驟2-3次至沉淀為白色；

（3）加入900μl 10%SDS和10μl 10mg/ml蛋白酶K，55℃水浴1h；

（4）將離心管冷卻至室溫，加入等體積的酚/氯仿/異戊醇（25:24:1）混勻，12000rpm離心10min；

（5）小心吸取上清后再加入等體積酚/氯仿/異戊醇（25:24:1）混勻，12000rpm離心10min；

（6）取上清，加入兩倍體積的無水乙醇，上下顛倒混勻，12000rpm離心10min，棄上清；

（7）加500μl 70%的乙醇洗滌沉淀，短暫離心后棄上清，開蓋干燥至乙醇完全揮發(fā)；

（8）加50μl雙蒸水或TE溶解DNA中，-20℃保存。

二、特異性引物的設(shè)計與合成

本發(fā)明通過對NCBI數(shù)據(jù)庫中GATA4 rs904018基因序列進行檢索，選取適合設(shè)計引物的片段序列為靶目標，設(shè)計了一組HRM-PCR引物。

本發(fā)明選取的擴增序列如下：

其中標有下劃線的堿基為基因突變位點。

該引物序列如下：

上游引物：GATA4-F 5'- CACCGCCCTGCATCCCTAAT-3'

下游引物：GATA4-R 5'- GGTGGGTTAAGTGCCCCTG-3'

擴增片段大小為：104bp。擴增的核苷酸序列為：

三、HRM-PCR反應(yīng)體系和反應(yīng)條件

分別以待測樣本DNA、重組陰性質(zhì)粒和重組陽性質(zhì)粒為模板，以上述引物GATA4-F和GATA4-R為擴增引物，采用下述體系和反應(yīng)條件進行PCR擴增。

PCR體系：

Green-2-Go qPCRMastermix（含EvaGreen） 5μl

引物F（10μM） 0.1μl

引物R（10μM） 0.1μl

模板（50ng/μl） 0.5μl

ddH₂O 4.3μl

總體積 10μl。

其中引物采用GATA4-F和GATA4-R，HRM-PCR采用生工生物（上海），Green-2-Go qPCRMastermix試劑盒。HRM分析儀為百源基因ASA-9600實時熒光定量PCR儀。

PCR擴增程序：

94℃預(yù)變性3min；94℃變性10s；60℃退火/延伸20s；40個循環(huán)；

HRM分析：

94℃ 90s

60℃ 30sec

83-94℃收集數(shù)據(jù)，溫度上升速率為0.06℃/s。

四、結(jié)果分析

根據(jù)收集數(shù)據(jù)繪制高分辨率熔解曲線，根據(jù)重組陰性質(zhì)粒、重組陽性質(zhì)粒的熔解曲線判斷待測樣本GATA4基因SNP位點rs904018的基因型：

與重組陰性質(zhì)粒的熔解曲線重合則GATA4基因SNP位點rs904018的基因型為TT；

與重組陽性質(zhì)粒的熔解曲線重合則GATA4基因SNP位點rs904018的基因型為CC；

在重組陰性質(zhì)粒和重組陽性質(zhì)粒之間的則GATA4基因SNP位點rs904018的基因型為TC。

五、靈敏度實驗

將重組陽性質(zhì)粒和重組陰性質(zhì)粒均稀釋至50ng/μl，然后二者混合進行梯度稀釋，重組陽性質(zhì)粒比例依次為50%、25%、12.5%、5%、2%和1%，按照上述HRM-PCR反應(yīng)體系和參數(shù)進行擴增，分析突變檢出范圍，即靈敏度。

反應(yīng)體系如下：

Green-2-Go qPCRMastermix（含EvaGreen） 5μl

引物F（10μM） 0.1μl

引物R（10μM） 0.1μl

模板（50ng/μl） 0.5μl

ddH₂O 4.3μl

總體積 10μl。

PCR擴增程序：

94℃預(yù)變性3min；94℃變性10s；60℃退火/延伸20s；40個循環(huán)；

HRM分析：

94℃ 90s

60℃ 30sec

83-94℃收集數(shù)據(jù)，溫度上升速率為0.06℃/s。

結(jié)果參照圖1，實驗數(shù)據(jù)顯示，當(dāng)重組陽性質(zhì)粒與重組陰性質(zhì)粒體積比分別為1:1、1:3、1:7、1:19、1:49時，均能檢測出陽性質(zhì)粒，所以本發(fā)明所用HRM檢測方法的靈敏度為2%。

實施例3 應(yīng)用本發(fā)明的檢測方法檢測樣本基因突變

以實施例2步驟中的檢測試劑盒和檢測方法，對30例樣本進行HRM分析，與重組陽性質(zhì)粒和重組陰性質(zhì)粒的熔解曲線對照比較，依此確定樣本中的突變類型。HRM分析結(jié)束后進行瓊脂糖凝膠電泳檢測，并根據(jù)HRM分析結(jié)果針對每種基因型隨機挑選1個樣本在生工生物（上海）進行Sanger測序驗證。

HRM分析結(jié)果參見表1和圖2，數(shù)據(jù)顯示30例樣本中GATA4基因 rs904018為T>C雜合突變型有6例，T>C純合突變型5例，其余19例為野生型。

Sanger測序結(jié)果參見圖3：其中a為樣本編號1的測序結(jié)果，b為樣本編號9的測序結(jié)果，c為樣本編號22的測序結(jié)果；與本發(fā)明方法檢測的結(jié)果完全一致。

表1應(yīng)用本發(fā)明的方法對樣本的分析結(jié)果

實施例4 用于檢測GATA4基因SNP位點rs904018基因型的試劑盒

本發(fā)明的用于檢測GATA4基因SNP位點rs904018基因型的試劑盒包括以下組分：

（1）GATA4 rs904018標準品：重組陰性質(zhì)粒和重組陽性質(zhì)粒，按照實施例1中的方法制備；

（2）引物：該引物序列為：

上游引物：GATA4-F 5'- CACCGCCCTGCATCCCTAAT-3'

下游引物：GATA4-R 5'- GGTGGGTTAAGTGCCCCTG-3'；

（3）含有Eva Green的PCR試劑。

應(yīng)用該試劑盒檢測GATA4基因SNP位點rs904018基因型的方法與實施例2相同。

最后應(yīng)說明的是：以上所述僅為本發(fā)明的優(yōu)選實施例而已，并不用于限制本發(fā)明，盡管參照前述實施例對本發(fā)明進行了詳細的說明，對于本領(lǐng)域的技術(shù)人員來說，其依然可以對前述各實施例所記載的技術(shù)方案進行修改，或者對其中部分技術(shù)特征進行等同替換。凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)，所作的任何修改、等同替換、改進等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。

序列表

<110> 蘇州百源基因技術(shù)有限公司

<120> 用于檢測GATA4基因SNP位點rs904018基因型的試劑盒

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 400

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

tgcatctctc ctgtgagttg gagacttctt tcccaagatg tccttgtccc ctgcgttccc 60

cactgtggcc tagaccgtgg gttttgcatt gtgtttctag caccgaggat ctgagaacaa 120

gcggagggcc gggccctggg acccctgctc cagcccgaat gacggcatct gtttgccatg 180

tacctggatg cgacgggccc ctggggacag gcccttgccc catccatccg cttgaggcat 240

ggcaccgccc tgcatcccta ataccaaatc tgactccaaa attgtggggt gtgacataca 300

agtgactgaa cacttcctgg ggagctacag gggcacttaa cccaccacag cacagcctca 360

tcaaaatgca gctggcaact tctcccccag gtgccttccc 400

<210> 2

<211> 400

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

tgcatctctc ctgtgagttg gagacttctt tcccaagatg tccttgtccc ctgcgttccc 60

cactgtggcc tagaccgtgg gttttgcatt gtgtttctag caccgaggat ctgagaacca 120

gcggagggcc gggccctggg acccctgctc cagcccgaat gacggcatct gtttgccatg 180

tacctggatg cgacgggccc ctggggacag gcccttgccc catccatccg cttgaggcat 240

ggcaccgccc tgcatcccta ataccaaatc tgactccaaa attgtggggt gtgacacaca 300

agtgactgaa cacttcctgg ggagctacag gggcacttaa cccaccacag cacagcctca 360

tcaaaatgca gctggcaact tctcccccag gtgccttccc 400

<210> 3

<211> 137

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

tgaggcatgg caccgccctg catccctaat accaaatctg actccaaaat tgtggggtgt 60

gacatacaag tgactgaaca cttcctgggg agctacaggg gcacttaacc caccacagca 120

cagcctcatc aaaatgc 137

<210> 4

<211> 104

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

caccgccctg catccctaat accaaatctg actccaaaat tgtggggtgt gacatacaag 60

tgactgaaca cttcctgggg agctacaggg gcacttaacc cacc 104