本發(fā)明涉及于生物技術(shù)和基因工程領(lǐng)域，具體涉及一種產(chǎn)抗菌肽的酵母工程菌及其發(fā)酵應(yīng)用。
背景技術(shù)：
抗生素的出現(xiàn)對(duì)人類防御和治療細(xì)菌感染性疾病方面具有重要地位，為人類健康事業(yè)做出了巨大的貢獻(xiàn)。但是隨著抗生素的大范圍應(yīng)用，特別在農(nóng)業(yè)和養(yǎng)殖業(yè)層面，抗生素的過(guò)度使用給食品安全、生態(tài)安全以及人類健康帶來(lái)諸多不利影響，尋找合適的抗生素的替代物，開(kāi)發(fā)在體內(nèi)無(wú)有害殘留、不能或不易產(chǎn)生耐藥性、綠色環(huán)保的抗生素有效替代品的研究正成為當(dāng)下的熱點(diǎn)課題而受到廣泛關(guān)注。
抗菌肽(Antimicrobial peptides)是一類廣泛存在于生物體內(nèi)的天然免疫的重要介質(zhì)，是宿主防御系統(tǒng)的重要組成部分，在生物體遭受外界異物刺激或病原微生物感染時(shí)能夠快速產(chǎn)生、具有多種生物學(xué)活性的小分子多肽?？咕牡膩?lái)源非常廣泛，而且種類繁多，功能多樣，自1962年Kiss和Michl首次從鈴蟾皮膚分泌物中分離出鈴蟾抗菌肽以來(lái)，短短幾十年中，在植物、微生物、昆蟲(chóng)、兩棲類以及哺乳動(dòng)物等中已發(fā)現(xiàn)和鑒定抗菌肽一千多種，其中昆蟲(chóng)來(lái)源的抗菌肽已經(jīng)超過(guò)兩百種?？咕膶?duì)于細(xì)菌、真菌、原蟲(chóng)、病毒等具有非特異性的抑制作用，能抑殺癌變細(xì)胞，而且可作為免疫效應(yīng)分子來(lái)啟動(dòng)、調(diào)節(jié)生物體的一系列免疫反應(yīng)。另外，抗菌肽殺菌機(jī)制與傳統(tǒng)抗生素不同，多數(shù)抗菌肽通過(guò)細(xì)胞膜電荷的區(qū)別進(jìn)行選擇性殺傷，所以其對(duì)正常哺乳動(dòng)物細(xì)胞幾乎無(wú)毒性，而且由于細(xì)胞膜具有的高度保守性，故耐藥的產(chǎn)生尤其困難甚至幾乎不可能，被認(rèn)為是一類天然的肽類抗生素。也正是由于抗菌肽獨(dú)特的抗菌機(jī)理、高效廣譜的抑菌活性以及綠色安全的特性，使其成為最具開(kāi)發(fā)前景的新型抗菌藥物，在飼料添加劑方面有廣泛的應(yīng)用前景，特別是在推行無(wú)抗養(yǎng)殖、保證食品健康的過(guò)程中，抗菌肽的應(yīng)用研究更是備受青睞。由于天然抗菌肽的表達(dá)量低、提取過(guò)程復(fù)雜，導(dǎo)致難以大量獲得；而化學(xué)合成的成本又高、價(jià)格昂貴，且對(duì)多數(shù)微生物宿主存在一定的毒性，這也導(dǎo)致抗菌肽的規(guī)?；纳a(chǎn)應(yīng)用一直受到制約。所以，選用合適宿主，利用基因工程手段進(jìn)行抗菌肽的異源表達(dá)的研究一直備受關(guān)注。而酵母由于其背景清晰、蛋白翻譯及后修飾功能完善以及便于培養(yǎng)等特點(diǎn)，使得其表達(dá)體系成為抗菌肽代謝工程研究中應(yīng)用最為廣泛和重要的表達(dá)體系之一。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明的目的是提供一種產(chǎn)抗菌肽的酵母工程菌及其發(fā)酵應(yīng)用。
本發(fā)明提供的釀酒酵母pm148(Saccharomyces cerevisiae pm148)，已于2016年12月18日保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(簡(jiǎn)稱CCTCC；地址：中國(guó)武漢，武漢大學(xué)；郵編：430072)，保藏編號(hào)為CCTCC NO：M 2016761。釀酒酵母pm148(Saccharomyces cerevisiae pm148)CCTCC NO：M2016761簡(jiǎn)稱為釀酒酵母pm148。
本發(fā)明還保護(hù)一種酵母制劑產(chǎn)品的制備方法，包括如下步驟：培養(yǎng)所述釀酒酵母pm148。
本發(fā)明還保護(hù)一種酵母制劑產(chǎn)品的制備方法，包括如下步驟(a1)和(a2)：
(a1)將釀酒酵母pm148接種至發(fā)酵培養(yǎng)基中培養(yǎng)；
(a2)完成步驟(a1)后，取整個(gè)培養(yǎng)體系，進(jìn)行低溫噴霧干燥，得到酵母制劑產(chǎn)品。
所述步驟(a1)中，所述培養(yǎng)具體可為將釀酒酵母pm148種子液接種至發(fā)酵培養(yǎng)基培養(yǎng)。
所述釀酒酵母pm148種子液的制備方法包括如下步驟(a3)：將釀酒酵母pm148接種至YPD液體培養(yǎng)基培養(yǎng)，得到種子液。
所述步驟(a3)可在培養(yǎng)瓶中進(jìn)行。
所述步驟(a3)中，所述培養(yǎng)條件具體可為30℃，250rpm振蕩培養(yǎng)。
所述種子液ΔOD650nm＝25-35。
所述種子液ΔOD650nm＝30。
所述步驟(a3)可在發(fā)酵罐中進(jìn)行。
所述步驟(a3)中，所述培養(yǎng)條件具體可為30℃培養(yǎng)。
所述種子液ΔOD650nm＝55-65。
所述種子液ΔOD650nm＝60。
所述步驟(a1)可在培養(yǎng)瓶中進(jìn)行。所述步驟(a1)中，所述培養(yǎng)條件具體可為30℃，250rpm振蕩培養(yǎng)72小時(shí)。所述種子液和所述發(fā)酵培養(yǎng)基的體積比具體可為1∶10。
所述步驟(a1)可在發(fā)酵罐中進(jìn)行。所述步驟(a1)中，所述培養(yǎng)條件具體可為：培養(yǎng)時(shí)間72小時(shí)，通過(guò)加入50％的葡萄糖水溶液控制培養(yǎng)體系中的葡萄糖濃度在0.5-1.0g/100mL(每當(dāng)培養(yǎng)體系中的葡萄糖濃度低于0.5g/100mL時(shí)，加入70％的葡萄糖水溶液使得培養(yǎng)體系中的葡萄糖濃度達(dá)到1.0g/100mL)，通過(guò)流加20％的氨水溶液控制發(fā)酵罐的pH在5.5-6.0，培養(yǎng)溫度30℃。所述種子液和所述發(fā)酵培養(yǎng)基的體積比具體可為1∶5。
所述步驟(a2)中，所述低溫噴霧干燥具體可采用YC-2000實(shí)驗(yàn)室真空噴霧干燥機(jī)進(jìn)行操作。
以上任一所述低溫具體可為70℃。
本發(fā)明還保護(hù)以上任一所述方法制備得到的酵母制劑產(chǎn)品。
本發(fā)明還保護(hù)釀酒酵母pm148的應(yīng)用，為如下(b1)-(b11)中的至少一種：
(b1)抑制細(xì)菌；
(b2)抑制革蘭氏陽(yáng)性菌；
(b3)抑制革蘭氏陰性菌；
(b4)抑制大腸桿菌；
(b5)抑制金黃色葡萄球菌；
(b6)制備抑制細(xì)菌的產(chǎn)品；
(b7)制備抑制革蘭氏陽(yáng)性菌的產(chǎn)品；
(b8)制備抑制革蘭氏陰性菌的產(chǎn)品；
(b9)制備抑制大腸桿菌的產(chǎn)品；
(b10)制備抑制金黃色葡萄球菌的產(chǎn)品；
(b11)制備飼料添加劑。
本發(fā)明還保護(hù)所述酵母制劑產(chǎn)品的應(yīng)用，為如下(c1)-(c12)中的至少一種：
(c1)抑制細(xì)菌；
(c2)抑制革蘭氏陽(yáng)性菌；
(c3)抑制革蘭氏陰性菌；
(c4)抑制大腸桿菌；
(c5)抑制金黃色葡萄球菌；
(c6)制備抑制細(xì)菌的產(chǎn)品；
(c7)制備抑制革蘭氏陽(yáng)性菌的產(chǎn)品；
(c8)制備抑制革蘭氏陰性菌的產(chǎn)品；
(c9)制備抑制大腸桿菌的產(chǎn)品；
(c10)制備抑制金黃色葡萄球菌的產(chǎn)品；
(c11)作為飼料添加劑；
(c12)制備飼料添加劑。
本發(fā)明還保護(hù)一種培養(yǎng)釀酒酵母pm148的方法，包括如下步驟：采用發(fā)酵培養(yǎng)基培養(yǎng)所述釀酒酵母。
所述培養(yǎng)具體可為將釀酒酵母pm148種子液接種至發(fā)酵培養(yǎng)基培養(yǎng)。
所述培養(yǎng)可在培養(yǎng)瓶中進(jìn)行。所述種子液和所述發(fā)酵培養(yǎng)基的體積比具體可為1∶10。所述培養(yǎng)條件具體可為30℃，250rpm振蕩培養(yǎng)72小時(shí)。
所述種子液ΔOD650nm＝25-35。
所述種子液ΔOD650nm＝30。
所述培養(yǎng)可在發(fā)酵罐中進(jìn)行。所述種子液和所述發(fā)酵培養(yǎng)基的體積比具體可為1∶5。所述培養(yǎng)條件具體可為：培養(yǎng)時(shí)間72小時(shí)，通過(guò)加入50％的葡萄糖水溶液控制培養(yǎng)體系中的葡萄糖濃度在0.5-1.0g/100mL(每當(dāng)培養(yǎng)體系中的葡萄糖濃度低于0.5g/100mL時(shí)，加入70％的葡萄糖水溶液使得培養(yǎng)體系中的葡萄糖濃度達(dá)到1.0g/100mL)，通過(guò)流加20％的氨水溶液控制發(fā)酵罐的pH在5.5-6.0，培養(yǎng)溫度30℃。
所述種子液ΔOD650nm＝55-65。
所述種子液ΔOD650nm＝60。
所述釀酒酵母pm148種子液的制備方法包括如下步驟：將釀酒酵母pm148接種至YPD液體培養(yǎng)基培養(yǎng)，得到種子液。
所述培養(yǎng)可在培養(yǎng)瓶中進(jìn)行。所述培養(yǎng)條件具體可為30℃，250rpm振蕩培養(yǎng)。
所述培養(yǎng)可在發(fā)酵罐中進(jìn)行。所述培養(yǎng)條件具體可為30℃培養(yǎng)。
本發(fā)明還保護(hù)一種用于培養(yǎng)釀酒酵母pm148的試劑盒，包括發(fā)酵培養(yǎng)基。
所述試劑盒還包括YPD液體培養(yǎng)基。
本發(fā)明還保護(hù)一種用于制備酵母制劑產(chǎn)品的試劑盒，包括發(fā)酵培養(yǎng)基。
所述試劑盒還包括釀酒酵母pm148。
所述試劑盒還包括YPD液體培養(yǎng)基。
本發(fā)明還保護(hù)以上任一所述的試劑盒的應(yīng)用，為如下(d1)-(d6)中的至少一種：
(d1)制備抑制細(xì)菌的產(chǎn)品；
(d2)制備抑制革蘭氏陽(yáng)性菌的產(chǎn)品；
(d3)制備抑制革蘭氏陰性菌的產(chǎn)品；
(d4)制備抑制大腸桿菌的產(chǎn)品；
(d5)制備抑制金黃色葡萄球菌的產(chǎn)品；
(d6)制備飼料添加劑。
以上任一所述發(fā)酵培養(yǎng)基由溶質(zhì)和溶劑組成；所述溶質(zhì)及其在所述發(fā)酵培養(yǎng)基中的濃度如下：蛋白胨1-3g/100ml、酵母粉0.5-1.5g/100ml、葡萄糖4-5g/100ml、NH4H2PO44-6g/100ml、K2SO4 1-3g/100ml、MgSO4·7H2O 1-2g/100ml、KH2PO4 0.5-0.7g/100ml、CaSO40.03-0.05g/100ml；所述溶劑為水。
所述溶質(zhì)及其在所述發(fā)酵培養(yǎng)基中的濃度具體如下：蛋白胨2g/100ml、酵母粉1g/100ml、葡萄糖3g/100ml、NH4H2PO4 5g/100ml、K2SO4 2g/100ml、MgSO4·7H2O 1.5g/100ml、KH2PO4 0.6g/100ml、CaSO4 0.04g/100ml。
所述發(fā)酵培養(yǎng)基的pH＝5.5。
以上任一所述YPD液體培養(yǎng)基由溶質(zhì)和溶劑組成；所述溶質(zhì)及其在所述YPD液體培養(yǎng)基中的濃度如下：葡萄糖2g/100ml、蛋白胨2g/100ml、酵母抽提物1g/100ml；所述溶劑為水。
以上任一所述飼料添加劑具體可為豬飼料添加劑。
本發(fā)明提供了一種產(chǎn)抗菌肽的酵母工程菌及其制備方法和發(fā)酵應(yīng)用。本發(fā)明以安全營(yíng)養(yǎng)型的釀酒酵母為宿主，采用組成型啟動(dòng)子GAP為調(diào)控因子，以rDNA為整合位點(diǎn)，構(gòu)建無(wú)外源抗性基因片段、生物安全性高的釀酒酵母工程菌株，通過(guò)強(qiáng)啟動(dòng)子多拷貝整合高效啟動(dòng)抗菌肽表達(dá)，無(wú)需誘導(dǎo)，無(wú)需純化，發(fā)酵產(chǎn)物采用低溫噴霧干燥工藝，直接制備富含抗菌肽成分的酵母制劑產(chǎn)品，該產(chǎn)品具備較好的抗菌性能，特別是針對(duì)大腸桿菌等革蘭氏陰性菌抑菌效果顯著，可直接作為飼料添加劑使用，具備較好的應(yīng)用效果。
附圖說(shuō)明
圖1為高拷貝重組載體pUGrx-mor的構(gòu)建過(guò)程示意圖。
具體實(shí)施方式
以下的實(shí)施例便于更好地理解本發(fā)明，但并不限定本發(fā)明。下述實(shí)施例中的實(shí)驗(yàn)方法，如無(wú)特殊說(shuō)明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的試驗(yàn)材料，如無(wú)特殊說(shuō)明，均為自常規(guī)生化試劑商店購(gòu)買得到的。以下實(shí)施例中的定量試驗(yàn)，均設(shè)置三次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，結(jié)果取平均值。以下實(shí)施例中的低溫為70℃。
pGAPZαA質(zhì)粒：Invitrogen公司。
pUG6質(zhì)粒：武漢淼靈生物科技有限公司。
pSH65質(zhì)粒：武漢淼靈生物科技有限公司。
釀酒酵母1373：中國(guó)工業(yè)微生物菌種保藏中心，編號(hào)：1373。
大腸桿菌(Escherichia coli)：中國(guó)醫(yī)學(xué)細(xì)菌保藏管理中心，菌株編號(hào)：44103。
金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)：ATCC，貨號(hào)：25923。
YPD液體培養(yǎng)基：葡萄糖20g，蛋白胨20g，酵母抽提物10g，加蒸餾水至1000ml，pH自然，121℃條件下滅菌20min。
YPD固體培養(yǎng)基：葡萄糖20g，蛋白胨20g，酵母抽提物10g，瓊脂粉20g，加蒸餾水至1000ml，pH自然，121℃條件下滅菌20min。
YPG液體培養(yǎng)基：半乳糖18g，蛋白胨20g，酵母抽提物10g，加蒸餾水至1000ml，pH自然，121℃條件下滅菌20min。
YPG固體培養(yǎng)基：半乳糖18g，蛋白胨20g，酵母抽提物10g，瓊脂粉20g，加蒸餾水至1000ml，pH自然，121℃條件下滅菌20min。
發(fā)酵培養(yǎng)基：蛋白胨20g，酵母粉10g，葡萄糖45g，NH4H2PO450g，K2SO420g，MgSO4·7H2O15g，KH2PO46g，CaSO40.4g，加蒸餾水至1000ml，調(diào)節(jié)pH至5.5，121℃條件下滅菌20min。
YC-2000實(shí)驗(yàn)室真空噴霧干燥機(jī)：上海雅程儀器有限公司。
杜長(zhǎng)大仔豬：江蘇輝煌豬業(yè)養(yǎng)豬有限公司。
基礎(chǔ)日糧：玉米55％，豆粕粉20％，麩皮12％，米糠3％，豬濃縮料10％，河南九鼎農(nóng)牧發(fā)展有限公司。
10％硫酸粘菌素預(yù)混劑：廣東容大生物股份有限公司。
以下實(shí)施例中的瓊脂孔穴擴(kuò)散法檢測(cè)待測(cè)產(chǎn)品的抑菌活性參照文獻(xiàn)：李秀蘭，戴祝英，張雙全.抗菌肽瓊脂糖孔穴擴(kuò)散法與比濁法測(cè)活比較及其相關(guān)性[J].南京師大學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版)，1998(2)：81-83.。具體為取待測(cè)產(chǎn)品1g和9mL無(wú)菌水充分混勻，分別選用革蘭氏陰性菌大腸桿菌(Escherichia coli)與革蘭氏陽(yáng)性菌金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)檢測(cè)抑菌活性，測(cè)量待測(cè)產(chǎn)品的抑菌圈直徑(含孔徑)，計(jì)算孔徑比(抑菌圈直徑與孔直徑的比值)，孔徑為固定值8mm。
實(shí)施例1、特異性抗菌肽及其編碼基因的獲得
經(jīng)過(guò)對(duì)多種物種中的多種抗菌肽序列進(jìn)行分析優(yōu)化，得到一種抗菌肽基因，將其命名為mor基因，mot基因的堿基序列如序列表的序列1所示，mor基因編碼的抗菌肽命名為mor抗菌肽，其氨基酸序列如序列表的序列2所示。
實(shí)施例2、多拷貝重組載體pUGrx-mor的構(gòu)建
一、重組載體pGAPZαA-mor的構(gòu)建
1、人工合成序列表的序列1所示的DNA分子。
2、以步驟1得到的DNA分子為模板，采用引物F1和引物R1進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。
F1：5′-CGGAATTCCGTTGCCATTGGTTCCAGTTCCAC-3′；
R1：5′-GCTCTAGAGCTCTACCCAAGTCAACGTCAACACC-3′；
F1中，下劃線標(biāo)注的部分為EcoR I酶切位點(diǎn)和保護(hù)性堿基；
R1中，下劃線標(biāo)注的部分為Xba I酶切位點(diǎn)和保護(hù)性堿基。
3、用限制性內(nèi)切酶EcoR I和Xba I雙酶切步驟2的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，回收酶切產(chǎn)物。
4、用限制性內(nèi)切酶EcoR I和Xba I雙酶切pGAPZαA質(zhì)粒，回收約3100bp的載體骨架。
5、將步驟3的酶切產(chǎn)物和步驟4的載體骨架連接，得到重組載體pGAPZαA-mor。根據(jù)測(cè)序結(jié)果，對(duì)重組載體pGAPZαA-mor進(jìn)行結(jié)構(gòu)描述如下：將pGAPZαA質(zhì)粒的EcoR I和Xba I酶切位點(diǎn)之間的小片段取代為了序列表的序列1的自5′端第1-129位核苷酸所示的DNA分子。
二、重組載體pUG-mor的構(gòu)建
1、以步驟一得到的重組載體pGAPZαA-mor為模板，采用引物F2和引物R2進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。
F2：5′-GGACTAGTCCTTTTGTAGAAATGTCTTGGTGTC-3′；
R2：5′-GGACTAGTCCCTCACTTAATCTTCTGTACTCTG-3′；
F2和R2中，下劃線標(biāo)注的部分為Spe I酶切位點(diǎn)和保護(hù)性堿基。
2、用限制性內(nèi)切酶Spe I酶切步驟1的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，回收酶切產(chǎn)物。
3、用限制性內(nèi)切酶Spe I酶切pUG6質(zhì)粒，回收約4000bp的載體骨架并采用CIAP去磷酸化。
4、將步驟2的酶切產(chǎn)物和步驟3的載體骨架連接，得到重組載體pUG-mor。根據(jù)測(cè)序結(jié)果，對(duì)重組載體pUG-mor進(jìn)行結(jié)構(gòu)描述如下：將pUG6質(zhì)粒的Spe I酶切位點(diǎn)之間插入了序列表的序列3的自5′端第1-1283位核苷酸所示的DNA分子。
序列表的序列3由4個(gè)功能區(qū)段組成，序列3第1-476位核苷酸為GAP啟動(dòng)子的編碼區(qū)段，第486-752位核苷酸為α信號(hào)肽的編碼區(qū)段，第761-889位核苷酸為mor基因區(qū)段，第1037-1283位核苷酸為AOX1基因轉(zhuǎn)錄終止子序列。
三、重組載體pUGr-mor的構(gòu)建
1、提取釀酒酵母1373的基因組DNA。
2、以步驟1得到的基因組DNA為模板，采用引物F3和引物R3進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。
F3：5′-AACTGCAGAACTCCACAGTGTGTTGTATTG-3′；
R3：5′-AACTGCAGGTGCTATGGTATGGTGACGGAG-3′；
F3和R3中，下劃線標(biāo)注的部分為Pst I酶切位點(diǎn)和保護(hù)性堿基。
3、用限制性內(nèi)切酶Pst I酶切步驟2的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，回收酶切產(chǎn)物。
4、用限制性內(nèi)切酶Pst I酶切步驟二得到的重組載體pUG-mor，回收約5300bp的載體骨架并采用CIAP去磷酸化。
5、將步驟3的酶切產(chǎn)物和步驟4的載體骨架連接，得到重組載體pUGr-mor。根據(jù)測(cè)序結(jié)果，對(duì)重組載體pUGr-mor進(jìn)行結(jié)構(gòu)描述如下：將重組載體pUG-mor的Pst I酶切位點(diǎn)之間插入了序列表的序列4的自5′端第1-2249位核苷酸所示的DNA分子。
四、多拷貝重組載體pUGrx-mor的構(gòu)建
1、用限制性內(nèi)切酶Not I酶切步驟三得到的重組載體pUGr-mor，得到酶切產(chǎn)物。
2、將步驟1得到酶切產(chǎn)物用T4DNA連接酶進(jìn)行自連，得到去除重組載體pUGr-mor氨芐青霉素抗性基因片段的新質(zhì)粒，命名為重組載體pUGrx-mor。
重組載體pUGrx-mor的構(gòu)建示意圖如圖1所示。
實(shí)施例3、釀酒酵母工程菌pm148的獲得
一、釀酒酵母工程菌pm148的構(gòu)建
1、將實(shí)施例2得到的重組載體pUGrx-mor轉(zhuǎn)化釀酒酵母，得到重組菌。
2、將步驟1得到的重組菌進(jìn)行G418抗篩選，獲得若干株能夠在含G418濃度為1000μg/mL的YPD培養(yǎng)基平板生長(zhǎng)的多拷貝整合的陽(yáng)性重組菌。
3、將pSH65質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)化步驟2得到的各個(gè)菌株，得到重組菌。
4、將步驟3得到的各個(gè)重組菌在含有半乳糖的YPG液體培養(yǎng)基中誘導(dǎo)培養(yǎng)表達(dá)Cre酶，識(shí)別loxP位點(diǎn)，得到切除抗性基因KanMX的重組菌。
5、完成步驟4后，將各個(gè)重組菌傳代10次以上丟失pSH65質(zhì)粒，最終獲得抗菌肽基因多拷貝整合，且不含任何抗性基因的若干株釀酒酵母工程菌株。
從若干株釀酒酵母工程菌株中隨機(jī)取10個(gè)菌株，依次命名為SC01-SC10。
將SC01-SC10中抗菌素產(chǎn)量最高的釀酒酵母工程菌株SC06命名為釀酒酵母工程菌pm148。
二、釀酒酵母工程菌pm148的遺傳穩(wěn)定性
將步驟二得到的釀酒酵母工程菌pm148進(jìn)行傳代培養(yǎng)以考察其遺傳穩(wěn)定性，每24h傳代一次，傳代15代，每隔一代進(jìn)行搖瓶發(fā)酵，將發(fā)酵液進(jìn)行低溫噴霧干燥，得到低溫噴霧干燥測(cè)定酵母制劑產(chǎn)品，采用瓊脂孔穴擴(kuò)散法檢測(cè)其對(duì)大腸桿菌(Escherichia coli)和金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)的抑菌活性，結(jié)果顯示釀酒酵母工程菌pm148傳代過(guò)程中酵母制劑產(chǎn)品抑菌活性均無(wú)明顯變化，具有良好的遺傳穩(wěn)定性。
三、釀酒酵母工程菌pm148的保藏
釀酒酵母pm148(Saccharomyces cerevisiae pm148)，已于2016年12月18日保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(簡(jiǎn)稱CCTCC；地址：中國(guó)武漢，武漢大學(xué)；郵編：430072)，保藏編號(hào)為CCTCC NO：M 2016761。釀酒酵母pm148(Saccharomyces cerevisiae pm148)CCTCC NO：M2016761簡(jiǎn)稱為釀酒酵母pm148。
實(shí)施例4、釀酒酵母pm148的發(fā)酵應(yīng)用
一、釀酒酵母pm148的搖瓶發(fā)酵
1、將釀酒酵母pm148接種至30mLYPD液體培養(yǎng)基中，4層紗布封口，30℃，250rpm振蕩培養(yǎng)至菌液ΔOD650nm＝30，得到種子液。
2、將3ml步驟1得到的種子液轉(zhuǎn)接至30mL發(fā)酵培養(yǎng)基中，4層紗布封口，30℃，250rpm振蕩培養(yǎng)72小時(shí)。
3、完成步驟2后，收集整個(gè)發(fā)酵體系，進(jìn)行低溫噴霧干燥(YC-2000實(shí)驗(yàn)室真空噴霧干燥機(jī))，干燥的成品即為酵母制劑產(chǎn)品。
4、采用釀酒酵母1373替代釀酒酵母pm148，按照步驟1-3進(jìn)行操作，得到對(duì)照酵母制劑產(chǎn)品。
5、采用實(shí)施例3得到的釀酒酵母工程菌株SC01-SC10(不包括SC06)替代釀酒酵母pm148，按照步驟1-3進(jìn)行操作，得到酵母制劑產(chǎn)品SC01-SC10(不包括SC06)。
6、采用瓊脂孔穴擴(kuò)散法檢測(cè)步驟3獲得的酵母制劑產(chǎn)品、步驟4獲得的對(duì)照酵母制劑產(chǎn)品和步驟5得到的酵母制劑產(chǎn)品SC01-SC10(不包括SC06)的抑菌活性。
步驟3獲得的酵母制劑產(chǎn)品對(duì)大腸桿菌(Escherichia coli)測(cè)得的抑菌圈直徑為27.5mm，孔徑比為3.4375；對(duì)金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)測(cè)得的抑菌圈直徑為12.0mm，孔徑比為1.5。
步驟4獲得的對(duì)照酵母制劑產(chǎn)品對(duì)大腸桿菌(Escherichia coli)測(cè)得的抑菌圈直徑為8.0mm，孔徑比為1，對(duì)金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)測(cè)得的抑菌圈直徑為8mm，孔徑比為1。
步驟5得到的酵母制劑產(chǎn)品SC01對(duì)大腸桿菌(Escherichia coli)測(cè)得的抑菌圈直徑為20.0mm，孔徑比為2.5；對(duì)金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)測(cè)得的抑菌圈直徑為10.0mm，孔徑比為1.25。酵母制劑產(chǎn)品SC02-酵母制劑產(chǎn)品SC10(不包括SC06)的抗菌活性與酵母制劑產(chǎn)品SC01無(wú)顯著差異。
結(jié)果表明，步驟3獲得的酵母制劑產(chǎn)品具備較好的抑制大腸桿菌(Escherichia coli)和金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)的能力，特別是對(duì)于革蘭氏陰性菌大腸桿菌(Escherichia coli)，其抑菌能力較革蘭氏陽(yáng)性菌金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)明顯要好，體現(xiàn)了較為特異性的抑制部分革蘭氏陰性菌的潛力，而且不含有任何外源抗性基因，具有更好的生物安全性。
二、釀酒酵母pm148的工業(yè)化發(fā)酵(采用30L全自動(dòng)發(fā)酵罐，全程溶氧(DO)35-45％)
1、將釀酒酵母pm148接種至15L YPD液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)溫度30℃，培養(yǎng)至菌液ΔOD650nm＝60，得到種子液。
2、將3000ml步驟1得到的種子液轉(zhuǎn)接至15L發(fā)酵培養(yǎng)基中，培養(yǎng)時(shí)間為72小時(shí)，通過(guò)加入50％的葡萄糖水溶液控制培養(yǎng)體系中的葡萄糖濃度在0.5-1.0g/100mL(每當(dāng)培養(yǎng)體系中的葡萄糖濃度低于0.5g/100mL時(shí)，加入70％的葡萄糖水溶液使得培養(yǎng)體系中的葡萄糖濃度達(dá)到1.0g/100mL)，通過(guò)流加20％的氨水溶液控制發(fā)酵罐的pH在5.5-6.0，培養(yǎng)溫度30℃。
3、步驟2發(fā)酵結(jié)束后，取整個(gè)發(fā)酵體系，低溫噴霧干燥，干燥的成品即為酵母制劑產(chǎn)品。
4、采用瓊脂孔穴擴(kuò)散法檢測(cè)步驟3得到的酵母制劑產(chǎn)品的抑菌活性。
步驟3獲得的酵母制劑產(chǎn)品對(duì)大腸桿菌(Escherichia coli)測(cè)得的抑菌圈直徑為32.0mm，孔徑比為4；對(duì)金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)測(cè)得的抑菌圈直徑為16.0mm，孔徑比為2，體現(xiàn)了非常好的抑菌效果。
實(shí)施例5、酵母制劑產(chǎn)品的熱穩(wěn)定性
1、將實(shí)施例4步驟二得到的酵母制劑產(chǎn)品分別進(jìn)行如下分組處理：
對(duì)照組：不進(jìn)行任何處理；
實(shí)驗(yàn)組A：10min沸水浴處理；
實(shí)驗(yàn)組B：20min沸水浴處理；
實(shí)驗(yàn)組C：30min沸水浴處理。
2、采用瓊脂孔穴擴(kuò)散法檢測(cè)步驟1各組酵母制劑產(chǎn)品的抑菌活性。
結(jié)果表明，沸水浴處理對(duì)釀酒酵母pm148制備的酵母制劑產(chǎn)品對(duì)大腸桿菌(Escherichia coli)和金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)的敏感性影響不大，抑菌圈直徑與未處理的對(duì)照產(chǎn)品無(wú)明顯差別，表明釀酒酵母pm148制備的酵母制劑產(chǎn)品具有非常好的耐高溫性能，體現(xiàn)了較好的熱穩(wěn)定性。
實(shí)施例6、酵母制劑產(chǎn)品的應(yīng)用效果實(shí)驗(yàn)
將150頭杜長(zhǎng)大健康斷奶仔豬(10.5-11.5kg)隨機(jī)分為4組(基礎(chǔ)日糧對(duì)照組、實(shí)驗(yàn)對(duì)照組、實(shí)驗(yàn)組甲、實(shí)驗(yàn)組乙和實(shí)驗(yàn)組丙)，每組10只(公母各半)，每組設(shè)置三個(gè)重復(fù)。各組仔豬飼喂的飼料如下：
基礎(chǔ)日糧對(duì)照組：基礎(chǔ)日糧；
實(shí)驗(yàn)對(duì)照組：在基礎(chǔ)日糧中加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.1％的10％硫酸粘菌素預(yù)混劑；
實(shí)驗(yàn)組甲：在基礎(chǔ)日糧中加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.025％的實(shí)施例4步驟二得到的釀酒酵母pm148制備的酵母制劑產(chǎn)品。
實(shí)驗(yàn)組乙：在基礎(chǔ)日糧中加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.05％的實(shí)施例4步驟二得到的釀酒酵母pm148制備的酵母制劑產(chǎn)品。
實(shí)驗(yàn)組丙：在基礎(chǔ)日糧中加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.1％的實(shí)施例4步驟二得到的釀酒酵母pm148制備的酵母制劑產(chǎn)品。
各組采取相同的飼養(yǎng)條件，飼養(yǎng)于同一棟豬舍內(nèi)，由專人飼養(yǎng)。各組仔豬自由采食、飲水，采用相同常規(guī)飼養(yǎng)管理方法和常規(guī)免疫程序進(jìn)行疾病預(yù)防。
實(shí)驗(yàn)期為24天。實(shí)驗(yàn)期間每天早上10點(diǎn)、下午5點(diǎn)觀察，并記錄各組仔豬喘氣、咳嗽情況和腹瀉情況，以及死亡數(shù)。計(jì)算呼吸道疾病發(fā)生率、腹瀉率和成活率。
結(jié)果見(jiàn)表1。
表1各組統(tǒng)計(jì)結(jié)果
結(jié)果顯示：0.025％添加量的酵母制劑產(chǎn)品對(duì)預(yù)防斷奶仔豬呼吸道疾病綜合癥和腹瀉的效果與目前市面常用的硫酸黏菌素相似，0.05-0.1％添加量的酵母制劑產(chǎn)品可顯著降低斷奶仔豬呼吸道疾病和腹瀉的發(fā)病率，對(duì)提高仔豬抵抗力有顯著效果，與0.1％添加量的10％硫酸黏菌素相比效果更好，因此，在實(shí)踐中可以作為一類抗生素替代品進(jìn)行推廣應(yīng)用。
SEQUENCE LISTING
<110> 福建師范大學(xué)
廣東容大生物股份有限公司
<120> 一種產(chǎn)特異性抗菌肽的酵母工程菌及其發(fā)酵應(yīng)用
<160> 4
<210> 1
<211> 129
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 1
ttgccattgg ttccagttcc acacgttgtt gttcacttca tgagaagacc aagaagagct 60
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ttgggtaga 129
<210> 2
<211> 43
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 2
Leu Pro Leu Val Pro Val Pro His Val Val Val His Phe Met Arg Arg
1 5 10 15
Pro Arg Arg Ala Asp His Thr Glu Thr Phe Phe Asn Asp Met Ala Ala
20 25 30
Leu Leu Glu Gly Val Asp Val Asp Leu Gly Arg
35 40
<210> 3
<211> 1283
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 3
ttttgtagaa atgtcttggt gtcctcgtcc aatcaggtag ccatctctga aatatctggc 60
tccgttgcaa ctccgaacga cctgctggca acgtaaaatt ctccggggta aaacttaaat 120
gtggagtaat ggaaccagaa acgtctcttc ccttctctct ccttccaccg cccgttaccg 180
tccctaggaa attttactct gctggagagc ttcttctacg gcccccttgc agcaatgctc 240
ttcccagcat tacgttgcgg gtaaaacgga ggtcgtgtac ccgacctagc agcccaggga 300
tggaaaagtc ccggccgtcg ctggcaataa tagcgggcgg acgcatgtca tgagattatt 360
ggaaaccacc agaatcgaat ataaaaggcg aacacctttc ccaattttgg tttctcctga 420
cccaaagact ttaaatttaa tttatttgtc cctatttcaa tcaattgaac aactatttcg 480
aaacgatgag atttccttca atttttactg ctgttttatt cgcagcatcc tccgcattag 540
ctgctccagt caacactaca acagaagatg aaacggcaca aattccggct gaagctgtca 600
tcggttactc agatttagaa ggggatttcg atgttgctgt tttgccattt tccaacagca 660
caaataacgg gttattgttt ataaatacta ctattgccag cattgctgct aaagaagaag 720
gggtatctct cgagaaaaga gaggctgaag ctgaattccg ttgccattgg ttccagttcc 780
acacgttgtt gttcacttca tgagaagacc aagaagagct gaccacactg aaactttctt 840
caacgacatg gctgctttgt tggaaggtgt tgacgttgac ttgggtagag ctctagaaca 900
aaaactcatc tcagaagagg atctgaatag cgccgtcgac catcatcatc atcatcattg 960
agttttagcc ttagacatga ctgttcctca gttcaagttg ggcacttacg agaagaccgg 1020
tcttgctaga ttctaatcaa gaggatgtca gaatgccatt tgcctgagag atgcaggctt 1080
catttttgat acttttttat ttgtaaccta tatagtatag gatttttttt gtcattttgt 1140
ttcttctcgt acgagcttgc tcctgatcag cctatctcgc agctgatgaa tatcttgtgg 1200
taggggtttg ggaaaatcat tcgagtttga tgtttttctt ggtatttccc actcctcttc 1260
agagtacaga agattaagtg aga 1283
<210> 4
<211> 2249
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 4
aactccacag tgtgttgtat tgaaacggtt ttaattgtcc tataacaaaa gcacagaaat 60
ctctcaccgt ttggaatagc aagaaagaaa cttacaagcc tagcaagacc gcgcacttaa 120
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cttgccaaaa caaaaaaatc cattttcaaa attattaaat ttctttaatg atccttccgc 240
aggttcacct acggaaacct tgttacgact tttagttcct ctaaatgacc aagtttgtcc 300
aaattctccg ctctgagatg gagttgcccc cttctctaag cagatcctga ggcctcacta 360
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caagctgatg acttgcgctt actaggaatt cctcgttgaa gagcaataat tacaatgctc 480
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atgctttcgc agtagttagt cttcaataaa tccaagaatt tcacctctga caattgaata 1140
ctgatgcccc cgaccgtccc tattaatcat tacgatggtc ctagaaacca acaaaataga 1200
accaaacgtc ctattctatt attccatgct aatatattcg agcaatacgc ctgctttgaa 1260
cactctaatt ttttcaaagt aaaagtcctg gttcgccaag agccacaagg actcaaggtt 1320
agccagaagg aaaggccccg ttggaaatcc agtacacgaa aaaatcggac cggccaaccg 1380
ggcccaaagt tcaactacga gctttttaac tgcaacaact ttaatatacg ctattggagc 1440
tggaattacc gcggctgctg gcaccagact tgccctccaa ttgttcctcg ttaaggtatt 1500
tacattgtac tcattccaat tacaagaccc gaatgggccc tgtatcgtta tttattgtca 1560
ctacctccct gaattaggat tgggtaattt gcgcgcctgc tgccttcctt ggatgtggta 1620
gccgtttctc aggctccctc tccggaatcg aacccttatt ccccgttacc cgttgaaacc 1680
atggtaggcc actatcctac catcgaaagt tgatagggca gaaatttgaa tgaaccatcg 1740
ccagcacaag gccatgcgat tcgaaaagtt attatgaatc atcaaagagt ccgaagacat 1800
tgatttttta tctaataaat acatctcttc caaagggtcg agattttaag catgtattag 1860
ctctagaatt accacagtta taccatgtag taaaggaact atcaaataaa cgataactga 1920
tttaatgagc cattcgcagt ttcactgtat aaattgctta tacttagaca tgcatggctt 1980
aatctttgag acaagcatat gactactggc aggatcaacc agataactat cttaaaagaa 2040
gaagcaacaa gcagtaaaaa agaaagaaac cgaaatctct tttttttttt cccacctatt 2100
ccctcttgct agaagatact tattgagttt ggaaacagct gaaattccag aaaaattgct 2160
ttttcaggtc tctctgctgc cggaaatgct ctctgttcaa aaagctttta cactcttgac 2220
cagcgcactc cgtcaccata ccatagcac 2249