本發(fā)明屬于分子生物學(xué)與生物醫(yī)學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及CRISPR/Cas9特異性敲除人基因組Lin28A基因的方法以及用于靶向人Lin28A基因的gRNA。

背景技術(shù)：

基因敲除，即針對某個特定的基因，通過破壞或改變其基因序列令其功能喪失的一種技術(shù)手段。常用的基因敲除方法包括 ：鋅指核酸酶（ZFNs）(Miller etal.,2007;Porteus and Baltimore,2003;Wood et al.,2011)、類轉(zhuǎn)錄因子活化因子核酸酶（TALEN）(Miller et al.,2011;Wood et al.,2011;Zhang et al.,2011)，以及最近發(fā)現(xiàn)的原核生物第二類適應(yīng)性免疫系統(tǒng) CRISPER/Cas9 系統(tǒng) (Cong et al.,2013;Mali etal.,2013) 等。

CRISPER/Cas9 系統(tǒng)原本被細(xì)菌免疫系統(tǒng)用來抵御外源病毒或質(zhì)粒。在第二類 CRISPER 系統(tǒng)中，Cas9 核酸內(nèi)切酶在 sgRNA 的引導(dǎo)下切割雙鏈 DNA，造成基因組雙鏈斷裂，利用細(xì)胞基因組修復(fù)的不穩(wěn)定性產(chǎn)生修復(fù)錯誤（堿基的缺失或插入），從而可能造成基因功能的喪失，實現(xiàn)基因敲除的目的。

Lin28A是一種高度保守的RBP，是miRNA調(diào)節(jié)蛋白。有研究顯示Lin28屬于一種致癌基因，在多種腫瘤組織或細(xì)胞系中高表達(dá)，促進腫瘤細(xì)胞的增殖和腫瘤的進展，而且多出現(xiàn)在低分化以及愈后差的腫瘤中。盡管Lin28A促進腫瘤發(fā)生的確切機制還不明確，但已經(jīng)有大量的證據(jù)表明Lin28/let-7雙向負(fù)反饋通路可以與一些因子（如RAS，MYC，NF-κB）結(jié)合，形成一個復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)參與致癌作用。Lin28A還是腫瘤細(xì)胞中多種與生長相關(guān)的上游基因（例如HER2和HMGA1）的主調(diào)節(jié)器，這一發(fā)現(xiàn)可能為更有效地診斷和治療腫瘤開辟新的方向。Lin28A作為一種參與誘導(dǎo)多能干細(xì)胞的多能因子可能成為腫瘤的潛在治療靶點。因此，本發(fā)明開發(fā)出一種高效、靶向敲除人Lin28A基因的gRNA，對于CRISPR/Cas9系統(tǒng)充分發(fā)揮作用和腫瘤治療的靶標(biāo)的研究具有極其重要的作用。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明目的在于通過設(shè)計、構(gòu)建、篩選，最終提供一些基于CRISPR/Cas9系統(tǒng)，同時靶向人Lin28A基因的高效gRNA及其靶位點序列，并用其抑制人Lin28A基因的表達(dá)，從而抑制腫瘤細(xì)胞的增值。

為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明以CRISPR/Cas9系統(tǒng)原理及其gRNA的設(shè)計原理為基礎(chǔ)，設(shè)計出6個gRNA，并以PX458為表達(dá)載體，構(gòu)建了gRNA/Cas9表達(dá)系統(tǒng)。通過篩選和系列分析測試，最終篩選出2個高效的gRNA，并在HepG2和A375腫瘤細(xì)胞中制備出Lin28A基因缺陷型腫瘤細(xì)胞模型。

本發(fā)明技術(shù)方案如下：

靶向人Lin28A基因的高效gRNA、靶點序列的設(shè)計及gRNA/Cas9表達(dá)系統(tǒng)構(gòu)建；

在腫瘤細(xì)胞模型中分析檢測gRNA對于腫瘤細(xì)胞Lin28A基因靶點的靶向性，篩選到2個高效的gRNA，其對應(yīng)的DNA序列如序列表SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.5任意一條序列所示，然后再制備出HepG2和A375腫瘤細(xì)胞Lin28A基因缺陷型腫瘤細(xì)胞模型。

附圖說明

附圖1 為T7 Endonuclease I酶切結(jié)果圖；

附圖2 為A375測序結(jié)果圖；

附圖3 為HepG2測序結(jié)果圖；

附圖4 為Western blot檢測缺陷株和正常株Lin28A蛋白表達(dá)結(jié)果圖。

具體實施方式

實施例1 靶向人Lin28A基因的gRNA合成及載體構(gòu)建

1、靶向人Lin28A基因的gRNA 的選擇和設(shè)計

在Genebank中找到人Lin28A基因的序列，在人Lin28A基因的外顯子區(qū)域設(shè)計潛在靶位點；

通過在線設(shè)計工具（http://crispr.mit.edu/）及gRNA的設(shè)計原則，評估人Lin28A基因序列上得分較高的靶位點設(shè)計gRNA。

2、靶向人Lin28A基因的gRNA 寡核苷酸序列的合成和真核表達(dá)載體的構(gòu)建

將pSpCas9(BB)-2A-GFP (PX458)質(zhì)粒（Addgene plasmid ID：48138，以下簡稱PX458），用BbSI酶切，37℃水浴1h后，1%的瓊脂糖電泳，回收酶切產(chǎn)物（TAKARA膠回收試劑盒）。

酶切體系如下：

將兩寡核苷酸退火，形成帶有粘性末端的短雙鏈DNA。

反應(yīng)體系如下：

將上述反應(yīng)體系在200 μLPCR管中混合均勻，然后將PCR管在37℃水浴鍋中處理30 min，再放入500 ml沸水中，自然冷卻至室溫。

連接體系：

將帶有粘性末端的雙鏈短DNA產(chǎn)物連入酶切后的PX458線性片段，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞（Takara Code : D9057A），并涂布于氨芐青霉素濃度為100 μg/mL的LB固體平板上培養(yǎng)過夜，挑取生長良好的單菌落，于15 mL 氨芐青霉素濃度為100 μg/mL的LB液體培養(yǎng)基中，置于250 rpm、37℃振蕩培養(yǎng)過夜，提取質(zhì)粒，命名為PX458-Lin28A-T1。同樣的方法，對應(yīng)靶點編號構(gòu)建出CRISPR/Cas9載體，分別命名為PX458-Lin28A-T2、PX458-Lin28A-T3、PX458-Lin28A-T4、PX458-Lin28A-T5和PX458-Lin28A-T6。

3、無內(nèi)毒素質(zhì)粒DNA 的制備

A、分別取PX458-Lin28A-T1、PX458-Lin28A-T2、PX458-Lin28A-T3、PX458-Lin28A-T4、PX458-Lin28A-T5和PX458-Lin28A-T6質(zhì)粒各1 μL加入100 μL DH5α感受態(tài)細(xì)胞中吹勻，冰中靜置20 min，再放入42℃水浴90 s，迅速置于冰浴中3 min，加入500 μL LB液體培養(yǎng)基，放置搖床180 rpm 37℃ 1 h，取菌液100 μL均勻涂布于氨芐青霉素濃度為100 μg/mL 的LB固體培養(yǎng)基37℃培養(yǎng)過夜；

B、取單菌落3 mL于氨芐青霉素濃度為100 μg/mL的LB液體培養(yǎng)基中，250 rpm、37℃振蕩培養(yǎng)8 h；從中取300 μL菌液接種于300 mL 氨芐青霉素濃度為100 μg/mL的LB液體培養(yǎng)基中，并于250 rpm、37℃振蕩培養(yǎng)12~16 h；

C、收集菌液，然后在4℃、4000 rpm條件下離心15 min，棄上清，收集菌體，然后按照QIAGEN EndoFree Plasmid Maxi Kit試劑盒說明書操作步驟提取質(zhì)粒，得無內(nèi)毒素的PX458-Lin28A-T1、PX458-Lin28A-T2、PX458-Lin28A-T3、PX458-Lin28A-T4、PX458-Lin28A-T5和PX458-Lin28A-T6載體。

實施例2 制備人黑色素瘤細(xì)胞和人肝癌細(xì)胞敲除Lin28A基因細(xì)胞株

復(fù)蘇人黑色素瘤細(xì)胞（A375細(xì)胞株，中科院上海細(xì)胞庫），將細(xì)胞放入加有10%的FBS+DMEM培養(yǎng)瓶中，于37℃、5% CO₂的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，轉(zhuǎn)染前1天，傳代培養(yǎng)細(xì)胞。

將培養(yǎng)A375細(xì)胞T75瓶中的培養(yǎng)基吸凈，加入2 mL 4℃冰箱取出的0.25%胰酶，使其均勻覆蓋瓶底，置于37℃培養(yǎng)箱中3~5 min，取出，搖晃可發(fā)現(xiàn)細(xì)胞于底部脫離，將其全部晃下，加入3 mL 37℃水浴中預(yù)熱的10％DMEM，用10 mL移液管進行吹打，吹打6~8次，不留死角，瓶口處較難吹打可將移液管對準(zhǔn)瓶口，小力將培養(yǎng)基打出即可覆蓋到接近瓶口的細(xì)胞。之后，將所有細(xì)胞吸出，置于15 mL離心管中，取50 μL混勻后的細(xì)胞于1.5 mL eppendorf管中，加入450 μL 10％DMEM，即為10倍稀釋、混勻，取10 μL細(xì)胞于計數(shù)板中計數(shù)。傳代當(dāng)天記為第1天，若第2天進行轉(zhuǎn)染，鋪900~1000萬/T75；若第3天轉(zhuǎn)染，鋪350~400萬/T75。每瓶T75加10 mL 10％DMEM培養(yǎng)基。轉(zhuǎn)染當(dāng)天觀察細(xì)胞密度，80~90％滿即可進行轉(zhuǎn)染。

采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將PX458-Lin28A-T1轉(zhuǎn)染A375細(xì)胞。轉(zhuǎn)染體系及試劑使用Lipofectamine? 2000（invitrogen公司），轉(zhuǎn)染詳細(xì)步驟參照轉(zhuǎn)染說明書。

轉(zhuǎn)染24 h后，利用胰酶消化轉(zhuǎn)染后貼壁的細(xì)胞，離心收集，經(jīng)流式分選收集轉(zhuǎn)染陽性細(xì)胞，吸掉廢液加入1 ml PBS重懸細(xì)胞，取500 μL放入瓶中繼續(xù)培養(yǎng)，剩余細(xì)胞放入1.5 mL離心管，提取DNA（按照DNA提取試劑盒說明書進行）。

以提取的DNA為模板（未轉(zhuǎn)染細(xì)胞DNA為對照組），擴增靶點序列，采用T7 Endonuclease I酶切鑒定，驗證靶點序列突變情況，來確定PX458-Lin28A-T1質(zhì)粒在細(xì)胞內(nèi)的活性。

PCR反應(yīng)體系如下：

PCR擴增程序：95℃預(yù)變性3 min；95℃變性30 s，58℃退火30 s，72℃延伸40 s，30個循環(huán)后72℃延伸5 min，最后4℃保溫。

采用同樣方法步驟，檢測載體PX458-Lin28A-T2、PX458-Lin28A-T3、PX458-Lin28A-T4、PX458-Lin28A-T5和PX458-Lin28A-T6 在細(xì)胞內(nèi)活性。

PCR產(chǎn)物用T7 Endonuclease I 37℃水浴酶切1h，酶切體系如下：

酶切產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測分析，結(jié)果（圖1）顯示：PX458-Lin28A-T1和PX458-Lin28A-T5具有胞內(nèi)活性。

細(xì)胞克隆培養(yǎng)

將剩余貼壁的細(xì)胞用胰酶消化，離心吸掉廢液，加入1ml PBS重懸細(xì)胞，采用極度稀釋的方法，將細(xì)胞放入10 cm培養(yǎng)皿中培養(yǎng)，培養(yǎng)810天時可觀察到細(xì)胞克隆比較明顯，每個集簇細(xì)胞數(shù)量約在500~1000個。

將細(xì)胞消化，移至96孔板中培養(yǎng)，傳代至6孔板時，消化細(xì)胞，離心重懸，取一部分提取DNA鑒定，剩余細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)。

PCR反應(yīng)體系參考實施例2，將PCR產(chǎn)物克隆送樣測序，具體步驟如下：

PCR產(chǎn)物的克隆

參照PMD18-T載體使用說明書，反應(yīng)體系為10μL：1μ LPMD18-TV ector、4μL純化PCR產(chǎn)物、5 μL Solution I。在16℃下連接2 h。

連接產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化：

a、取感受態(tài)細(xì)胞DH5α，放置冰中融化5 min，加入10 μL連接產(chǎn)物吹勻，放置冰中20 min；

b、然后42℃熱擊90 s，迅速轉(zhuǎn)入冰浴中維持3 min；

c、加入500 μL的LB液體培養(yǎng)基，置于搖床中，37℃， 180 rpm，1 h；

d、取菌液100 μL均勻涂布于LB固體培養(yǎng)基（含1/1000氨芐青霉素），37℃培養(yǎng)過夜；

e、挑取3個單菌落，分別放入3 mL LB液體培養(yǎng)基（含1/1000氨芐青霉素），37℃ 200 rpm，12 h，送至上海生工測序鑒定，測序結(jié)果見（圖2），篩選得到人黑色素瘤細(xì)胞敲除Lin28A基因細(xì)胞株，命名為A375-KO-Lin28A。

采用人黑色素瘤細(xì)胞敲除人Lin28A基因同樣的方法，制備人肝癌細(xì)胞敲除Lin28A基因細(xì)胞株，經(jīng)測序鑒定，結(jié)果見（圖3），篩選得到人肝癌細(xì)胞敲除Lin28A基因細(xì)胞株，命名為HepG2-KO-Lin28A。

實施例3 Western blot檢測A375-Lin28A基因缺陷細(xì)胞株和HepG2-Lin28A基因缺陷細(xì)胞株的蛋白表達(dá)

總蛋白提取---細(xì)胞裂解

（1） A375-KO-Lin28A 和HepG2-KO-Lin28A 細(xì)胞培養(yǎng)于10 cm培養(yǎng)皿中，同時培養(yǎng)A375和HepG2細(xì)胞作為對照組。

（2）棄培養(yǎng)上清，每106個細(xì)胞加0.1 mL RIPA buffer。

（3）冰上放置數(shù)分鐘，用槍頭輕輕吹打，使細(xì)胞充分裂解。再輕輕傾斜培養(yǎng)皿使裂解產(chǎn)物流向瓶皿的一邊或一角，然后將其轉(zhuǎn)移到1.5 mL離心管，劇烈振蕩30 s。

（4）12000 rpm，4oC離心15 min，吸取上清，即可進行后續(xù)Western blot檢測。

蛋白濃度測定（BCA測蛋白濃度）

工作液的配制

測定前，按照 BCA Reagent A：BCA Reagent B = 100：1的比例混合后配制成工作液。例如配制30 mL工作液：30 mL BCA Reagent A + 0.3 mL BCA Reagent B，充分振蕩混配制后的工作液可4℃保存3 d。

所需工作液量的計算方法如下：

所需工作液總體積（mL）= [（BSA標(biāo)準(zhǔn)溶液8份或7份+檢測樣品數(shù)）×平行樣本數(shù)（n）＋1]×1個樣品所需的工作液體積

例1） 標(biāo)準(zhǔn)操作流程【1 mL反應(yīng)體系】檢測樣品數(shù)為12個、平行樣（n=2）時：

[（8＋12）×2＋1 ]× 1 mL＝41 mL

例2） 標(biāo)準(zhǔn)操作流程【200 μL反應(yīng)體系】檢測樣品數(shù)為20個、平行樣（n=2）時：

[（8＋20）× 2＋1 ]× 0.2 mL＝11.4 mL

例3） 低濃度蛋白質(zhì)樣品測定的操作流程【1mL反應(yīng)體系】檢測樣品數(shù)為12個、平行樣（n=2）時：[（7＋12）× 2＋1 ]× 0.5 mL＝ 19.5 mL

低濃度蛋白樣品的標(biāo)準(zhǔn)操作流程（定量范圍：0～200 μg/mL）【0.2 mL 反應(yīng)體系，使用微孔板測定】

BSA 標(biāo)準(zhǔn)品溶液的配制

（1）0.2 mg/mL BSA標(biāo)準(zhǔn)品溶液：取120 μL BSA Standard Solution (2mg/mL)，加入1080 μL稀釋液后充分混合；

（2）按照下表稀釋BSA 標(biāo)準(zhǔn)品溶液。BSA 標(biāo)準(zhǔn)品溶液和檢測樣品的稀釋可使用去離子水、0.9% NaCl或 PBS；

BSA 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備

（1）分別取100 μL稀釋后的BSA標(biāo)準(zhǔn)品溶液加入到微孔板中，每個濃度取2個平行樣；

（2）加入100 μL工作液后，立即混勻；

（3）37℃水浴槽中反應(yīng)60 min后，冷卻至室溫；

（4）使用分光光度計測定562 nm處的吸光度值，測定時，使用1 mL比色皿，用ddH₂O校零，盡可能在20 min內(nèi)檢測完畢所有樣品；

（5）各濃度BSA標(biāo)準(zhǔn)品溶液的吸光度值減去Blank值的平均值，繪制 BSA 標(biāo)準(zhǔn)品溶液的標(biāo)準(zhǔn)曲線。

檢測樣品的測定

檢測樣品測定時，同 BSA 標(biāo)準(zhǔn)品溶液同時進行測定。

（1）分別取100 μL檢測樣品（稀釋15倍）加入到微孔板中，每個樣品取2個平行樣進行測定；

（如果必要，也可選擇與BSA標(biāo)準(zhǔn)品溶液相同的稀釋方法稀釋檢測樣品后測定）

（2）加入100 μL工作液后，立即混勻；

（3）37℃水浴中反應(yīng)60 min后，冷卻至室溫；

（4）酶標(biāo)儀波長設(shè)定在562 nm 處進行測定。用水校零，盡可能在20 min內(nèi)檢測完畢所有樣品；

（5）各樣品溶液的吸光度值減去Blank值的平均值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算出檢測樣品的蛋白濃度，A375、HepG2、A375-KO-Lin28A和HepG2-KO-LIN28上樣量均為50 μg，樣品濃度分別計算得118.01μg/mL、123.26μg/mL、99.76μg/mL、117.63μg/mL。

SDS-PAGE電泳

（1）將長短玻璃板對齊后按照方向放入制膠夾中卡緊，然后垂直卡在制膠架子上準(zhǔn)備灌膠；

（2）配制10％分離膠，加入TEMED后立即搖勻即可灌膠。將膠加至適量高度（綠線附近）后，輕柔加上雙蒸水壓膠；

（3）當(dāng)水和膠之間有一條折射線時，說明膠已凝了。再等3 min使膠充分凝固就可倒去膠上層水并用濾紙將水吸干；

（4）配制5％的濃縮膠，加入TEMED后立即搖勻即可灌膠。將剩余空間灌滿濃縮膠然后將梳子插入濃縮膠中；

（5）待濃縮膠凝固后，將含膠的玻璃板加入電泳夾卡緊，放入電泳槽（電極紅對紅，黑對黑）；

（6）取出上樣樣品與5×SDS上樣緩沖液按4：1比例混合，混勻后沸水中煮5 min使蛋白變性；

（7）加足夠的電泳液后按等量蛋白上樣；

（8）電泳，80V跑過濃縮膠后轉(zhuǎn)換電壓至120 V，待溴酚蘭跑至膠板底部剛好沒有跑出即可；

（9）將夾子打開使黑的一面保持水平，在上面依次墊海綿墊、濾紙、膠、PVDF膜(經(jīng)甲醇活化)、濾紙、海綿墊，同時將電泳液換成轉(zhuǎn)移液；

（10）將電流調(diào)整到恒流200 mA，轉(zhuǎn)移約1~3 h。根據(jù)蛋白分子量的大小，越大的蛋白轉(zhuǎn)膜時所用的時間也越長，但是也不能太久，否則會轉(zhuǎn)透到濾紙上；

（11）取出膜，并做好正反面標(biāo)記，在TBST中清洗1 min，然后用5%脫脂牛奶封閉液室溫封閉2 h；

（12）用封閉液將對應(yīng)的一抗稀釋成一定的濃度（1：500），內(nèi)參一抗的稀釋終濃度為1：1000，然后溫育1.5 h或4℃孵育過夜；

（13）用TBST洗3次，每次5 min；

（14）用封閉液將二抗稀釋成一定的濃度(1：1000)，然后溫育1.5 h；

（15）用TBST清洗4次，每次5 min；

（16）曝光，將ECL曝光液按A液：B液 1:1混勻后均勻覆蓋在整片膜上，反應(yīng)2 min放入曝光儀曝光檢測（圖3），結(jié)果顯示，A375-KO-LIN28A 和HepG2-KO-LIN28A 細(xì)胞Lin28A基因均成功敲除。

SEQUENCE LISTING

<110> 重慶高圣生物醫(yī)藥有限責(zé)任公司

<120> CRISPR/Cas9 靶向敲除人Lin28A基因及其特異性gRNA

<130> 2016

<160> 6

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

ggcggcagaa gaggcgcccg 20

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

ggtcgcgctc gaccccccag 20

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

ggcgcccgag gaggcgccgg 20

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

ggcgcccgag gaggcgccgg 20

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

ggcgccggag gacgcggccc 20

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

gccggaggac gcggcccggg 20