本申請(qǐng)要求2015年10月2日提交的美國申請(qǐng)序列號(hào)62/236226的優(yōu)先權(quán)，其通過引用并入本文。本發(fā)明涉及糖d-塔格糖的制備。更具體地，本發(fā)明涉及將糖類(例如多糖、寡糖、二糖、蔗糖、d-葡萄糖和d-果糖)酶促轉(zhuǎn)化為d-塔格糖來制備d-塔格糖的方法。
背景技術(shù)：
：：d-塔格糖(tagatose)是一種低熱量的天然甜味劑，具有92％的蔗糖甜度，但只有蔗糖38％的卡路里。它是天然存在的單糖己糖，僅少量存在于水果、可可和乳制品中。2003年食品和藥品監(jiān)督管理局(fda)批準(zhǔn)塔格糖為食品添加劑，其指定塔格糖為公認(rèn)安全使用物質(zhì)(gras)。然而，由于塔格糖售價(jià)高，其作為甜味劑的使用受到限制。塔格糖具有無數(shù)的健康益處：其是非致齲的；其是低熱量的；其具有非常低的血糖指數(shù)3；其將葡萄糖的血糖指數(shù)降低了20％；其可以降低平均血糖水平；通過提高高密度脂蛋白(hdl)膽固醇，其有助于預(yù)防心血管疾病、中風(fēng)和其他血管疾??；其是經(jīng)過驗(yàn)證的益生元和抗氧化劑。lu等人，“tagatose，anewantidiabeticandobesitycontroldrug，diabetesobes.metab.10(2)：109-34(2008)”。因此，塔格糖明顯地在制藥、生物技術(shù)、學(xué)術(shù)、食品、飲料、膳食補(bǔ)充劑和雜貨業(yè)中具有多種應(yīng)用。目前，主要通過乳糖酶水解乳糖或酸解乳糖形成d-葡萄糖和d-半乳糖來制備塔格糖(wo2011150556、cn103025894、us5002612、us6057135和us8802843)。然后d-半乳糖在堿性條件下由氫氧化鈣化學(xué)異構(gòu)化或在ph中性條件下由l-阿拉伯糖異構(gòu)酶酶促異構(gòu)化為d-塔格糖。通過過濾和離子交換色譜組合分離最終產(chǎn)物。該過程在幾個(gè)罐或生物反應(yīng)器中進(jìn)行?？傊?，由于其它糖(例如d-葡萄糖、d-半乳糖和未水解的乳糖)昂貴的分離以及低產(chǎn)率，該方法變差。正在開發(fā)幾種通過微生物細(xì)胞發(fā)酵的方法，但是由于它們依賴于昂貴的原料(例如半乳糖醇和d-阿洛酮糖)、產(chǎn)率低和分離昂貴，沒有一個(gè)被證明是實(shí)際的替代方案。需要開發(fā)成本有效的合成途徑，用于高產(chǎn)率生產(chǎn)塔格糖，其中該方法的至少一個(gè)步驟包括能量有利的化學(xué)反應(yīng)。此外，需要一種塔格糖的生產(chǎn)方法，其中其方法步驟可以在一個(gè)罐或生物反應(yīng)器中進(jìn)行。還需要可以在相對(duì)低濃度的磷酸鹽條件下進(jìn)行塔格糖生產(chǎn)的方法，其中磷酸鹽可以循環(huán)利用，和/或該方法不需要使用三磷酸腺苷(atp)作為磷酸鹽的來源。還需要塔格糖的生產(chǎn)途徑，該途徑在任何反應(yīng)步驟中都不需要使用昂貴的煙酰胺腺苷二核苷酸(nad(h))輔酶。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本文所述的發(fā)明涉及制備塔格糖的方法。在各個(gè)方面，該方法包括采用差向異構(gòu)酶催化將6-磷酸果糖(f6p)轉(zhuǎn)化為6-磷酸塔格糖(t6p)；和采用磷酸酶催化將t6p轉(zhuǎn)化為塔格糖。本發(fā)明還涉及通過本文所述的任何方法制備的塔格糖。在本發(fā)明的一些方面，用于制備塔格糖的方法還包括將6-磷酸葡萄糖(g6p)轉(zhuǎn)化為f6p的步驟，其中該步驟采用磷酸葡糖異構(gòu)酶(pgi)催化。在其他方面，用于塔格糖合成的方法還包括將1-磷酸葡萄糖(g1p)轉(zhuǎn)化為g6p的步驟，并且該轉(zhuǎn)化步驟采用葡萄糖磷酸變位酶(pgm)催化。在各個(gè)方面，用于制備塔格糖的方法可以包括采用至少一種酶催化將糖類轉(zhuǎn)化為g1p；采用葡萄糖磷酸變位酶(pgm)催化將g1p轉(zhuǎn)化為g6p；采用磷酸葡糖異構(gòu)酶(pgi)催化將g6p轉(zhuǎn)化為f6p；采用差向異構(gòu)酶催化將f6p轉(zhuǎn)化為6-磷酸塔格糖(t6p)；以及采用磷酸酶催化將生成的t6p轉(zhuǎn)化為塔格糖。在任何方法中使用的糖類可以選自由淀粉或其衍生物、纖維素或其衍生物和蔗糖組成的組。淀粉或其衍生物可以是直鏈淀粉、支鏈淀粉、可溶性淀粉、淀粉糊精、麥芽糖糊精、麥芽糖或葡萄糖。在本發(fā)明的一些方面，用于制備塔格糖的方法包括酶解或酸解淀粉將淀粉轉(zhuǎn)化為淀粉衍生物。在其它方面，淀粉衍生物可以通過酶解淀粉來制備，其由異淀粉酶、支鏈淀粉酶、α-淀粉酶或兩種或更多種這些酶的組合催化。在某些方面，用于制備塔格糖的方法還可以包括加入4-轉(zhuǎn)葡糖苷酶(4gt)。在各個(gè)方面，用于制備塔格糖的方法可以包括采用至少一種酶催化將果糖轉(zhuǎn)化為f6p；采用差向異構(gòu)酶催化將f6p轉(zhuǎn)化為6-磷酸塔格糖(t6p)；以及采用磷酸酶催化將生成的t6p轉(zhuǎn)化為塔格糖。在其它實(shí)施例中，塔格糖的生產(chǎn)方法包括采用至少一種酶催化將蔗糖轉(zhuǎn)化為果糖；采用至少一種酶催化將果糖轉(zhuǎn)化為f6p；采用差向異構(gòu)酶催化將f6p轉(zhuǎn)化為6-磷酸塔格糖(t6p)；以及采用磷酸酶催化將生成的t6p轉(zhuǎn)化為塔格糖。在本發(fā)明的其他方面，用于制備塔格糖的方法中使用的g6p可以通過采用至少一種酶催化將葡萄糖轉(zhuǎn)化為g6p來生成。葡萄糖反過來可以通過采用至少一種酶催化將蔗糖轉(zhuǎn)化為葡萄糖來生成。在本發(fā)明的一些方面，用于將f6p轉(zhuǎn)化為t6p的差向異構(gòu)酶是6-磷酸果糖差向異構(gòu)酶。6-磷酸果糖差向異構(gòu)酶可以由多核苷酸編碼，該多核苷酸包括與seqidnos：1、3、5、7、9或10具有至少60％、至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％序列同一性的核苷酸序列。在各個(gè)方面，6-磷酸果糖差向異構(gòu)酶包含與seqidnos:2、4、6、8或11具有至少60％、至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％序列同一性的氨基酸序列。在本發(fā)明的各個(gè)方面，用于將t6p轉(zhuǎn)化為塔格糖的磷酸酶是6-磷酸塔格糖磷酸酶。6-磷酸塔格糖磷酸酶可以由多核苷酸編碼，該多核苷酸包含與seqidnos:12、14或16具有至少60％、至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％序列同一性的核苷酸序列。在本發(fā)明的一些方面，6-磷酸塔格糖磷酸酶包含與seqidnos:13、15或17具有至少60％、至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％序列同一性的氨基酸序列。在各個(gè)方面，本發(fā)明的方法在約40℃至約70℃的溫度范圍、約5.0至約8.0的ph范圍下進(jìn)行和/或進(jìn)行約8h至約48h。在一些方面，用于制備塔格糖的方法的步驟在一個(gè)生物反應(yīng)器中進(jìn)行。在其他方面，這些步驟在串聯(lián)布置的多個(gè)生物反應(yīng)器中進(jìn)行。在本發(fā)明的其他方面，用于制備塔格糖的方法的步驟在無atp、無nad(h)、約0mm至約150mm的磷酸鹽濃度中進(jìn)行，循環(huán)利用磷酸鹽，和/或該方法的至少一個(gè)步驟包括能量有利的化學(xué)反應(yīng)。附圖說明這些附圖說明了本發(fā)明一些實(shí)施例的某些方面，而不應(yīng)當(dāng)用于限制或限定本發(fā)明。圖1是將6-磷酸果糖轉(zhuǎn)化為6-磷酸塔格糖，然后轉(zhuǎn)化為d-塔格糖(塔格糖)的酶促途徑的示意圖；圖2是將淀粉或其衍生產(chǎn)物轉(zhuǎn)化為塔格糖的酶促途徑的示意圖。使用以下縮寫：αgp，α-葡聚糖磷酸化酶或淀粉磷酸化酶；pgm，葡萄糖磷酸變位酶；pgi，磷酸葡糖異構(gòu)酶；f6pe，6-磷酸果糖差向異構(gòu)酶；t6pp，6-磷酸塔格糖磷酸酶；ia，異淀粉酶；pa，支鏈淀粉酶；mp，麥芽糖磷酸化酶；ppgk，多磷酸鹽葡糖激酶；圖3示出了將纖維素或其衍生產(chǎn)物轉(zhuǎn)化為塔格糖的酶促途徑。cdp，纖維糊精磷酸化酶；cbp，纖維二糖磷酸化酶；ppgk，多磷酸鹽葡糖激酶；pgm，葡萄糖磷酸變位酶；pgi，磷酸葡糖異構(gòu)酶；f6pe，6-磷酸果糖差向異構(gòu)酶；t6pp，6-磷酸塔格糖磷酸酶；圖4是將果糖轉(zhuǎn)化為塔格糖的酶促途徑的示意圖。ppfk，多磷酸鹽果糖激酶；f6pe，6-磷酸果糖差向異構(gòu)酶；t6pp，6-磷酸塔格糖磷酸酶；圖5是將葡萄糖轉(zhuǎn)化為塔格糖的酶促途徑的示意圖。ppgk，多磷酸鹽葡糖激酶；pgi，磷酸葡糖異構(gòu)酶；f6pe，6-磷酸果糖差向異構(gòu)酶；t6pp，6-磷酸塔格糖磷酸酶；圖6示出了將蔗糖或其衍生產(chǎn)物轉(zhuǎn)化為塔格糖的酶促途徑。sp，蔗糖磷酸化酶；ppfk，多磷酸鹽果糖激酶；pgm，葡萄糖磷酸變位酶；pgi，磷酸葡糖異構(gòu)酶；f6pe，6-磷酸果糖差向異構(gòu)酶；t6pp，6-磷酸塔格糖磷酸酶；圖7示出了基于形成的gibbs能量的中間體之間的反應(yīng)吉布斯能量，用于將1-磷酸葡萄糖轉(zhuǎn)化為塔格糖。具體實(shí)施方式本發(fā)明提供了用于高產(chǎn)率合成塔格糖同時(shí)大大降低產(chǎn)品分離成本和塔格糖生產(chǎn)成本的酶促途徑或方法。本發(fā)明涉及用于制備塔格糖的方法，其中該方法包括采用差向異構(gòu)酶催化將6-磷酸果糖(f6p)轉(zhuǎn)化為6-磷酸塔格糖(t6p)，以及采用磷酸酶(例如，6-磷酸塔格糖磷酸酶，t6pp)催化將生成的t6p轉(zhuǎn)化為塔格糖。該方法概括地在圖1中示出。在某些實(shí)施例中，催化f6p轉(zhuǎn)化為t6p的差向異構(gòu)酶是6-磷酸果糖差向異構(gòu)酶(f6pe)。將f6p轉(zhuǎn)化為t6p的差向異構(gòu)酶可用于本發(fā)明的方法中。在本發(fā)明的一些方面，在該方法中適用于將f6p轉(zhuǎn)化為t6p的差向異構(gòu)酶包括與seqidnos：2、4、6、8或11(如下所示)的氨基酸序列具有至少60％、優(yōu)選地至少65％、更優(yōu)選地至少70％、更優(yōu)選地至少75％、更優(yōu)選地至少80％、更優(yōu)選地至少85％、甚至更優(yōu)選地至少90％、最優(yōu)選地至少95％、甚至最優(yōu)選地至少96％、97％、98％、99％或100％同一性程度的氨基酸序列。合適的差向異構(gòu)酶由多核苷酸編碼，該多核苷酸包括與seqidnos：1、3、5、7、9或10(如下所示)的核苷酸序列具有至少60％、優(yōu)選地至少65％、更優(yōu)選地至少70％、更優(yōu)選地至少75％、更優(yōu)選地至少80％、更優(yōu)選地至少85％、甚至更優(yōu)選地至少90％、最優(yōu)選地至少95％、甚至最優(yōu)選地至少96％、97％、98％、99％或100％同一性程度的核苷酸序列。本發(fā)明還涉及差向異構(gòu)酶，其包括與seqidnos：2、4、6、8或11的氨基酸序列具有至少60％、優(yōu)選地為至少65％、更優(yōu)選地至少70％，更優(yōu)選地至少75％、更優(yōu)選地至少80％、更優(yōu)選地至少85％、甚至更優(yōu)選地至少90％、最優(yōu)選地至少95％、甚至最優(yōu)選至少96％、97％、98％、99％或100％同一性程度的氨基酸序列。在其它方面，本發(fā)明涉及由多核苷酸編碼的差向異構(gòu)酶，該多核苷酸包括與seqidnos：1、3、5、7、9或10的核苷酸序列具有與至少60％、優(yōu)選地至少65％、更優(yōu)選地至少70％、更優(yōu)選地至少75％、更優(yōu)選地至少80％、更優(yōu)選地至少85％、甚至更優(yōu)選地至少90％、最優(yōu)選地95％、甚至最優(yōu)選地至少96％、97％、98％、99％或100％同一性程度的核苷酸序列。將t6p轉(zhuǎn)化為塔格糖(d-塔格糖)的磷酸酶可以用于本發(fā)明的方法中。在本發(fā)明的一些方面，可以用于將t6p轉(zhuǎn)化為塔格糖(d-塔格糖)的磷酸酶包括與seqidnos：12、14或16(如下所示)的氨基酸序列具有至少60％、優(yōu)選地至少65％、更優(yōu)選地至少70％、更優(yōu)選地至少75％、更優(yōu)選地至少80％、更優(yōu)選地至少85％、甚至更優(yōu)選地至少90％、最優(yōu)選地至少95％、甚至最優(yōu)選地至少96％、97％、98％、99％或100％同一性程度的氨基酸序列。塔格糖磷酸酶由多核苷酸編碼，該多核苷酸包括與seqidnos：13、15或17(如下所示)的核苷酸序列具有至少60％、優(yōu)選地至少65％、更優(yōu)選地至少70％、更優(yōu)選地至少75％、更優(yōu)選地至少80％、更優(yōu)選地至少85％、甚至更優(yōu)選地至少90％、最優(yōu)選地至少95％、甚至最優(yōu)選地至少95％96％、97％、98％、99％或100％同一性程度的核苷酸序列。本發(fā)明還涉及將t6p轉(zhuǎn)化為塔格糖(d-塔格糖)的磷酸酶，其包括與seqidnos：12、14或16的氨基酸序列具有至少60％、優(yōu)選地至少65％、更優(yōu)選地至少70％、更優(yōu)選地至少75％、更優(yōu)選地至少80％、更優(yōu)選地至少85％、甚至更優(yōu)選地至少90％、最優(yōu)選地至少95％、甚至最優(yōu)選地至少96％、97％、98％、99％或100％同一性程度的氨基酸序列。在各個(gè)方面，本發(fā)明涉及將t6p轉(zhuǎn)化為塔格糖(d-塔格糖)的磷酸酶，其由多核苷酸編碼，該多核苷酸包括與seqidnos：13、15或17的核苷酸序列具有至少60％、優(yōu)選地至少65％、更優(yōu)選地至少70％、更優(yōu)選地至少75％、更優(yōu)選地至少80％、更優(yōu)選地至少85％、甚至更優(yōu)選地至少90％、最優(yōu)選地至少95％、甚至最優(yōu)選地至少96％、97％、98％、99％或100％同一性程度的核苷酸序列。在一些實(shí)施例中，根據(jù)本發(fā)明用于制備塔格糖的方法還包括將6-磷酸葡萄糖(g6p)酶促轉(zhuǎn)化為f6p的步驟，且該步驟采用磷酸葡糖異構(gòu)酶(pgi)催化。在其它實(shí)施例中，用于制備塔格糖的方法還包括將1-磷酸葡萄糖(g1p)轉(zhuǎn)化為g6p的步驟，其中該步驟采用葡萄糖磷酸變位酶(pgm)催化。在另外的實(shí)施例中，塔格糖生產(chǎn)方法還包括采用至少一種酶催化將糖類轉(zhuǎn)化為g1p的步驟。因此，根據(jù)本發(fā)明用于制備塔格糖的方法可以(例如)包括以下步驟：(i)使用一種或多種酶將糖類轉(zhuǎn)化為1-磷酸葡萄糖(g1p)；(ii)使用葡萄糖磷酸變位酶(pgm，ec5.4.2.2)將g1p轉(zhuǎn)化為g6p；(iii)使用磷酸葡糖異構(gòu)酶(pgi，ec5.3.1.9)將g6p轉(zhuǎn)化為f6p；(iv)通過6-磷酸果糖差向異構(gòu)酶(f6pe)將f6p轉(zhuǎn)化為t6p；和(v)通過6-磷酸塔格糖磷酸酶(t6pp)將t6p轉(zhuǎn)化為塔格糖。該方法的一個(gè)實(shí)例如圖2所示，其中糖類是淀粉。通常，在所公開的方法中使用的酶單位的比例為1：1：1：1：1(αgp：pgm：pgi：f6pe：t6pp)。為了優(yōu)化產(chǎn)率，這些比例可以以任意數(shù)字的組合進(jìn)行調(diào)整。例如，可以使用3：1：1：1：1的比例使磷酸化中間體的濃度最大化，這將使得下游反應(yīng)活性提高。相反，可以使用1：1：1：1：3的比例來保持αgp的磷酸鹽的穩(wěn)定供應(yīng)，這將使得α-1,4-糖苷鍵的磷酸切割更有效?？梢允褂美?：1：1：1：3的酶比例來進(jìn)一步提高反應(yīng)速率。因此，可以改變酶的比例，包括下文討論的其它任選的酶，以提高塔格糖生產(chǎn)的效率。例如，相對(duì)于其它酶的量，特定的酶可以以約2×、3×、4×、5×等的量存在。該方法的重要優(yōu)點(diǎn)之一是，方法步驟可以在一個(gè)生物反應(yīng)器或反應(yīng)容器中進(jìn)行?；蛘?，步驟也可以在串聯(lián)布置的多個(gè)生物反應(yīng)器或反應(yīng)容器中進(jìn)行。然后，采用t6pp將t6p脫磷酸化生成的磷酸根離子，可以在將糖類轉(zhuǎn)化為g1p的方法步驟中再利用，特別是當(dāng)所有的方法步驟在單個(gè)生物反應(yīng)器或反應(yīng)容器中進(jìn)行時(shí)。在所公開的方法中循環(huán)利用磷酸鹽的能力使得能夠使用非化學(xué)計(jì)量的磷酸鹽，其能保持反應(yīng)磷酸鹽的低濃度。這影響了工藝方法的總體途徑和總速率，但并未限制各個(gè)酶的活性，并且能滿足塔格糖制造方法的總效率。例如，反應(yīng)磷酸鹽濃度可以在約0mm至約300mm的范圍，約0mm至約150mm，約1mm至約50mm，優(yōu)選地約5mm至約50mm，或更優(yōu)選地約10mm至約50mm。例如，反應(yīng)磷酸鹽濃度可以為約0.1mm、約0.5mm、約1mm、約1.5mm、約2mm、約2.5mm、約5mm、約6mm、約7mm、約8mm、約10mm、約15mm、約20mm、約25mm、約30mm、約35mm、約40mm、約45mm、約50mm或約55mm。因此，由于低的總磷酸鹽，低的磷酸鹽濃度使得生產(chǎn)成本降低，因此使除去磷酸鹽的成本更低。其還可以防止高濃度游離磷酸鹽對(duì)t6pp的抑制并且降低磷酸鹽污染的可能性。此外，本文公開的方法可以在不加入atp作為磷酸鹽源，即不含atp的情況下進(jìn)行。該方法還可以在不必加入nad(h)，即不含nad(h)的情況下進(jìn)行。其它優(yōu)點(diǎn)還包括，所公開制備塔格糖的方法的至少一個(gè)步驟包括能量有利的化學(xué)反應(yīng)(圖7)。用于將糖類轉(zhuǎn)化為g1p的酶的實(shí)例包括α-葡聚糖磷酸化酶(αgp，ec2.4.1.1)、麥芽糖磷酸化酶(mp，ec2.4.1.8)、纖維糊精磷酸化酶(cdp，ec2.4.1.49)、纖維二糖磷酸化酶(cbp，ec2.4.1.20)、纖維素磷酸化酶、蔗糖磷酸化酶(sp，ec2.4.1.7)及其組合。酶或酶的組合的選擇取決于方法中使用的糖類。用于生產(chǎn)g1p的糖類可以是多糖、寡糖和/或二糖。例如，糖類可以是淀粉、一種或多種淀粉衍生物、纖維素、一種或多種纖維素衍生物、蔗糖、一種或多種蔗糖衍生物或其組合。淀粉是自然界中使用最廣泛的儲(chǔ)能化合物，主要儲(chǔ)存在植物種子中。天然的淀粉包括直鏈淀粉和支鏈淀粉。淀粉衍生物的實(shí)例包括直鏈淀粉、支鏈淀粉、可溶性淀粉、淀粉糊精、麥芽糖糊精、麥芽糖、果糖和葡萄糖。纖維素衍生物的實(shí)例包括預(yù)處理的生物質(zhì)、再生的無定形纖維素、纖維糊精、纖維二糖、果糖和葡萄糖。蔗糖衍生物包括果糖和葡萄糖。淀粉衍生物可以通過淀粉的酶解或通過淀粉的酸解來制備。具體來說，淀粉的酶解可以通過水解α-1,6-糖苷鍵的異淀粉酶(ia，ec.3.2.1.68)、水解α-1,6-糖苷鍵的支鏈淀粉酶(pa，ec.3.2.1.41)、催化短麥芽低聚糖的轉(zhuǎn)糖基化并生成更長的麥芽低聚糖的4-α-葡聚糖轉(zhuǎn)移酶(4gt，ec.2.4.1.25)或切割α-1,4-糖苷鍵的α-淀粉酶(ec3.2.1.1)來催化或增強(qiáng)。此外，纖維素衍生物可以通過由纖維素酶混合物、酸或催化纖維素酶解或預(yù)處理生物質(zhì)來制備。在某些實(shí)施例中，用于將糖類轉(zhuǎn)化為g1p的酶包括αgp。在該步驟中，當(dāng)糖類包括淀粉時(shí)，g1p利用淀粉通過αgp生成；當(dāng)糖類包括可溶性淀粉、淀粉糊精或麥芽糖糊精時(shí)，g1p利用可溶性淀粉、淀粉糊精或麥芽糖糊精通過αgp生成。當(dāng)糖類包括麥芽糖并且酶包括麥芽糖磷酸化酶時(shí)，g1p利用麥芽糖通過麥芽糖磷酸化酶生成。如果糖類包括蔗糖并且酶包括蔗糖磷酸化酶，g1p利用蔗糖通過蔗糖磷酸化酶生成。在另一個(gè)實(shí)施例中，當(dāng)糖類包括纖維二糖并且酶包括纖維二糖磷酸化酶時(shí)，g1p利用纖維二糖通過纖維二糖磷酸化酶生成。在另外的實(shí)施例中，當(dāng)糖類包括纖維糊精并且酶包括纖維糊精磷酸化酶時(shí)，g1p利用纖維糊精通過纖維糊精磷酸化酶生成。將糖轉(zhuǎn)化為g1p的可替代的實(shí)施例中，當(dāng)糖類包括纖維素并且酶包括纖維素磷酸化酶時(shí)，g1p利用纖維素通過纖維素磷酸化酶生成。根據(jù)本發(fā)明，塔格糖也可以由果糖制備。該方法的實(shí)例如圖4所示。例如，該方法包括采用多磷酸鹽果糖激酶(ppfk)催化使果糖和多磷酸鹽生成f6p；采用f6pe催化將f6p轉(zhuǎn)化為t6p；以及采用t6pp催化將t6p轉(zhuǎn)化為塔格糖。果糖可以，例如通過蔗糖的酶促轉(zhuǎn)化來制備。在其它實(shí)施例中，塔格糖可以由蔗糖制備。這種方法的一個(gè)實(shí)例如圖6所示。該方法提供體外合成途徑，合成途徑包括以下酶促步驟：采用蔗糖磷酸化酶(sp)催化由蔗糖和游離的磷酸鹽生成g1p；采用pgm催化將g1p轉(zhuǎn)化為g6p；采用pgi催化將g6p轉(zhuǎn)化為f6p；采用f6pe催化將f6p轉(zhuǎn)化為t6p；以及采用t6pp催化將t6p轉(zhuǎn)化為塔格糖。然后，當(dāng)t6p轉(zhuǎn)化為塔格糖時(shí)生成的磷酸鹽離子可在將蔗糖轉(zhuǎn)化為g1p的步驟中循環(huán)利用。另外，如圖6所示，通過由果糖生成f6p，該果糖由sp磷酸切割蔗糖生成，ppfk和多磷酸鹽可用于提高塔格糖的產(chǎn)率。在一些實(shí)施例中，用于制備塔格糖的方法包括以下步驟：通過酶解或酸解由多糖和寡糖生成葡萄糖，采用至少一種酶催化將葡萄糖轉(zhuǎn)化為g6p，通過酶解或酸解由多糖和寡糖生成果糖，以及采用至少一種酶催化將果糖轉(zhuǎn)化為g6p。上面列舉了多糖和寡糖的實(shí)例。在其它實(shí)施例中，g6p通過多磷酸鹽葡糖激酶由葡萄糖和多磷酸鈉生成。本公開提供了將糖類，例如淀粉中的多糖和寡糖、纖維素、蔗糖及它們的衍生產(chǎn)物轉(zhuǎn)化為塔格糖的方法。在某些實(shí)施例中，提供了人工(非天然)無atp的酶促途徑，使用無細(xì)胞酶混合物將淀粉、纖維素、蔗糖及其衍生產(chǎn)物轉(zhuǎn)化為塔格糖。如上所示，可以使用幾種酶來水解淀粉以提高g1p的產(chǎn)率。這樣的酶包括異淀粉酶、支鏈淀粉酶和α-淀粉酶。玉米淀粉含有妨礙αgp作用的許多支鏈。異淀粉酶可用于使淀粉去支鏈化，生成線性淀粉糊精。異淀粉酶預(yù)處理淀粉可以導(dǎo)致最終產(chǎn)品中較高的f6p濃度。異淀粉酶和支鏈淀粉酶切割α-1,6-糖苷鍵，其允許通過α-葡聚糖磷酸化酶更完全的淀粉降解。α-淀粉酶切割α-1,4-糖苷鍵，因此α-淀粉酶用于將淀粉降解成片段，以更快地轉(zhuǎn)化為塔格糖。如圖2所示，通過將降解產(chǎn)物麥芽磷磷酸切割成g1p和葡萄糖，麥芽糖磷酸化酶(mp)可用于提高塔格糖的產(chǎn)率?；蛘撸ㄟ^將降解產(chǎn)物葡萄糖、麥芽糖和麥芽三糖再利用到更長的麥芽低聚糖中，可以使用4-轉(zhuǎn)葡糖苷酶(4gt)來提高塔格糖的產(chǎn)率，其可被αgp磷酸切割生成g1p。此外，纖維素是最豐富的生物資源，并且是植物細(xì)胞壁的主要成分。非食用木質(zhì)纖維素生物質(zhì)包括纖維素、半纖維素和木質(zhì)素以及其他次要成分。純纖維素，包括avicel(微晶纖維素)、再生無定形纖維素、細(xì)菌纖維素、濾紙等可以通過一系列處理來制備。部分水解的纖維素底物包括其聚合度大于7的水不溶性纖維糊精、聚合度為3-6的水溶性纖維糊精、纖維二糖、葡萄糖和果糖。在某些實(shí)施例中，通過一系列步驟可以將纖維素及其衍生產(chǎn)物轉(zhuǎn)化為塔格糖。這種方法的實(shí)例如圖3所示。該方法提供了包括以下步驟的體外合成途徑：分別采用纖維糊精磷酸化酶(cdp)和纖維二糖磷酸化酶(cbp)催化，由纖維糊精和纖維二糖以及游離的磷酸鹽生成g1p；采用pgm催化將g1p轉(zhuǎn)化為g6p；采用pgi催化將g6p轉(zhuǎn)化為催化的f6p；采用f6pe催化將f6p轉(zhuǎn)化為t6p；以及采用t6pp催化將t6p轉(zhuǎn)化為塔格糖。在該方法中，通過將纖維糊精和纖維二糖轉(zhuǎn)化為g1p的步驟可以再利用磷酸鹽離子。可以使用幾種酶將固體纖維素水解成水溶性纖維糊精和纖維二糖。這些酶包括內(nèi)切葡聚糖酶和外切纖維素酶，但不包括β-葡糖苷酶(纖維二糖酶)。在纖維素水解及g1p生成之前，可以對(duì)纖維素和生物質(zhì)進(jìn)行預(yù)處理以增加它們的反應(yīng)性并降低纖維素鏈的聚合度。纖維素和生物質(zhì)預(yù)處理的方法包括稀酸預(yù)處理、纖維素溶劑型木質(zhì)纖維素分級(jí)、氨纖維膨脹、氨水浸泡、離子液體處理和部分水解，部分水解通過使用濃酸、包括鹽酸、硫酸、磷酸及其組合。在一些實(shí)施例中，在該方法中可以加入多磷酸鹽和多磷酸鹽葡糖激酶(ppgk)，從而通過將降解產(chǎn)物葡萄糖磷酸化為g6p來增加塔格糖的產(chǎn)率，如圖3所示。在其它實(shí)施例中，塔格糖可以由葡萄糖生成。該方法的實(shí)例如圖5所示。該方法包括采用多磷酸鹽葡糖激酶(ppgk)催化從葡萄糖和多磷酸鹽生成g6p的步驟；采用pgi催化將g6p轉(zhuǎn)化為f6p；采用f6pe催化將f6p轉(zhuǎn)化為t6p；以及采用t6pp催化將t6p轉(zhuǎn)化為塔格糖。本領(lǐng)域已知的任何合適的生物緩沖溶液可用于本發(fā)明的方法中，例如hepes、pbs、bis-tris、mops、dipso、trizma等。用于所有實(shí)施例的反應(yīng)緩沖溶液可以具有5.0-8.0的ph范圍。更優(yōu)選地，反應(yīng)緩沖溶液ph可以在約6.0至約7.3的范圍。例如，反應(yīng)緩沖溶液的ph可以為6.0、6.2、6.4、6.6、6.8、7.0、7.2或7.3。反應(yīng)緩沖溶液還可以含有關(guān)鍵的金屬陽離子。金屬離子的實(shí)例包括mg2+和zn2+。進(jìn)行工藝步驟的反應(yīng)溫度可以在37-85℃的范圍進(jìn)行。更優(yōu)選地，步驟可以在約40℃至約70℃的溫度范圍進(jìn)行。溫度可以是，例如約40℃、約45℃、約50℃、約55℃或約60℃。優(yōu)選地反應(yīng)溫度為約50℃。所公開方法的反應(yīng)時(shí)間可以根據(jù)需要調(diào)整，并且可以在約8h至約48h的范圍。例如，反應(yīng)時(shí)間可以是約16h、約18h、約20h、約22h、約24h、約26h、約28h、約30h、約32h、約34h、約36、約38h、約40h、約42h、約44h、約46h或約48h。更優(yōu)選地，反應(yīng)時(shí)間為約24h。由于對(duì)整個(gè)反應(yīng)非常有利的平衡常數(shù)，根據(jù)本發(fā)明的方法可以實(shí)現(xiàn)高產(chǎn)率。例如，圖7顯示了基于形成的吉布斯能量的中間體之間的反應(yīng)吉布斯能量，用于將1-磷酸葡萄糖轉(zhuǎn)化為塔格糖。反應(yīng)吉布斯能量使用http://equilibrator.weizmann.ac.il/.生成。理論上，如果起始材料完全轉(zhuǎn)化為中間體，則可以實(shí)現(xiàn)高達(dá)99％的產(chǎn)率。本發(fā)明的方法使用低成本的起始材料，并通過降低與原料和產(chǎn)物分離相關(guān)的成本來降低生產(chǎn)成本。淀粉、纖維素、蔗糖及它們的衍生物是比，例如乳糖更便宜的原料。當(dāng)由乳糖生成塔格糖時(shí)，葡萄糖和半乳糖以及塔格糖通過色譜分離，這導(dǎo)致更高的生產(chǎn)成本。此外，根據(jù)本發(fā)明將t6p轉(zhuǎn)化為塔格糖的步驟是不可逆的磷酸酶反應(yīng)，無論原料如何。因此，塔格糖以非常高的產(chǎn)率生產(chǎn)，同時(shí)有效地最小化隨后的產(chǎn)品分離成本。與基于細(xì)胞生產(chǎn)的方法相比，本發(fā)明包括無細(xì)胞制備塔格糖，由于消除了細(xì)胞膜而具有相對(duì)高的反應(yīng)速率，而細(xì)胞膜通常會(huì)降低底物/產(chǎn)物運(yùn)輸進(jìn)出速度的細(xì)胞。最終產(chǎn)品不含營養(yǎng)豐富的發(fā)酵培養(yǎng)基/細(xì)胞代謝產(chǎn)物。實(shí)例材料和方法化學(xué)品除非另有說明，所有的化學(xué)品，包括玉米淀粉、可溶性淀粉、麥芽糖糊精、麥芽糖、葡萄糖、濾紙均為試劑級(jí)或更高級(jí)，購自sigma-aldrich(圣路易斯，密蘇里州，美國)或fisherscientific(匹茲堡，賓夕法尼亞州，美國)。限制性酶、t4連接酶和phusiondna聚合酶購自newenglandbiolabs(伊普斯威奇，馬薩諸塞州，美國)。寡核苷酸由integrateddnatechnologies(科勒爾維爾，艾奧瓦州，美國)或eurofinsmwgoperon(亨茨維爾，阿拉巴馬州，美國)合成。用于酶純化的再生無定形纖維素通過avicelph105(fmcbiopolymer，費(fèi)城，賓夕法尼亞州，美國)的溶解和再生來制備，如ye等在“fusionofafamily9cellulose-bindingmoduleimprovescatalyticpotentialofclostridiumthermocellumcellodextrinphosphorylaseoninsolublecellulose.appl.microbiol.biotechnol.2011；92:551-560”中所述。將大腸桿菌sig10(sigma-aldrich，圣路易斯，密蘇里州，美國)用作dna操作的宿主細(xì)胞，并將大腸桿菌bl21(de3)(sigma-aldrich，圣路易斯，密蘇里州，美國)用作重組蛋白表達(dá)的宿主細(xì)胞。含有100mg·l-1氨芐青霉素或50mg·l-1卡那霉素的zym-5052培養(yǎng)基用于大腸桿菌細(xì)胞生長和重組蛋白質(zhì)表達(dá)。來自里氏木霉(trichodermareesei)(目錄號(hào)：c2730)的纖維素酶和支鏈淀粉酶(目錄號(hào)：p1067)購自sigma-aldrich(圣路易斯，密蘇里州，美國)并由novozymes(富蘭克林頓，北卡羅來納州，美國)制備。麥芽糖磷酸化酶(目錄號(hào)：m8284)購自sigma-aldrich。重組酶的生產(chǎn)和純化在1l錐形瓶中，將帶有蛋白質(zhì)表達(dá)質(zhì)粒的大腸桿菌bl21(de3)菌株在含有100mg·l-1氨芐青霉素或50mg·l-1卡那霉素的100mlzym-5052培養(yǎng)基中孵育。細(xì)胞在37℃生長并以220rpm旋轉(zhuǎn)振蕩16-24h。通過離心在12℃收集細(xì)胞，并用含有50mmnacl和5mmmgcl2(熱沉淀和纖維素結(jié)合模塊)的20mmhepes(ph7.5)或含有300mmnacl和5mm咪唑(ni純化)的20mmhepes(ph7.5)洗滌一次。將細(xì)胞沉淀重新懸浮在相同的緩沖溶液中并通過超聲(fisherscientific超聲細(xì)胞破碎儀500型，打開脈沖5秒，在10秒關(guān)閉，以50％振幅共21min)裂解。離心后，純化上清液中的目標(biāo)蛋白質(zhì)。使用三種方法來純化各種重組蛋白。通過profinityimacni-帶電樹脂(bio-rad，赫拉克勒斯，加利福尼亞州，美國)純化組氨酸-標(biāo)記的蛋白。通過高親和力吸附在大表面再生無定形纖維素上純化含有纖維素結(jié)合模塊(cbm)和自切割內(nèi)含肽的融合蛋白。在70-95℃下熱沉淀5-30min用于純化超熱穩(wěn)定酶。通過十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(sds-page)檢測(cè)重組蛋白的純度。使用的酶及其活性測(cè)定使用來自海棲熱袍菌(thermotogamaritima)(uniprotidg4feh8)的α-葡聚糖磷酸化酶(αgp)。50℃下在含有1mmmgcl2、5mmdtt和30mm麥芽糖糊精的50mm磷酸鈉緩沖溶液(ph7.2)中測(cè)定活性。通過vivaspin2濃縮器(10000mwco)(vivaproducts，inc.，利特爾頓，馬薩諸塞州，美國)過濾酶來停止反應(yīng)。使用補(bǔ)充有25u/ml葡萄糖磷酸變位酶的葡萄糖己糖激酶/g6pdh檢測(cè)試劑盒(sigmaaldrich，目錄號(hào)gahk20-1kt)檢測(cè)1-磷酸葡萄糖(g1p)。單位(u)描述為μmol/min。使用來自thermococcuskodakaraensis(uniprotidq68bj6)的葡萄糖磷酸變位酶(pgm)。50℃下在含有5mmmgcl2和5mmg1p的50mmhepes緩沖溶液(ph7.2)中測(cè)定活性。通過vivaspin2濃縮器(10000mwco)過濾酶來停止反應(yīng)。使用己糖激酶/g6pdh檢測(cè)試劑盒(sigmaaldrich，目錄號(hào)gahk20-1kt)檢測(cè)產(chǎn)物6-磷酸葡萄糖(g6p)。使用來自熱纖維梭菌(clostridiumthermocellum)(uniprotida3dbx9)和嗜熱細(xì)菌(thermusthermophilus)(uniprotidq5sll6)兩種不同來源的磷酸葡糖異構(gòu)酶(pgi)。50℃下在含有5mmmgcl2和10mmg6p的50mmhepes緩沖溶液(ph7.2)中測(cè)定活性。采用vivaspin2濃縮器(10000mwco)過濾酶來停止反應(yīng)。使用6-磷酸果糖激酶(f6pk)/丙酮酸脫氫酶(pk)/乳酸脫氫酶(ld)偶聯(lián)酶檢測(cè)法檢測(cè)產(chǎn)物6-磷酸果糖(f6p)，其中340nm處吸光度的降低表明生成了f6p。該200μl反應(yīng)物含有50mmhepes(ph7.2)、5mmmgcl2、10mmg6p、1.5mmatp、1.5mm磷酸烯醇丙酮酸、200μmnadh、0.1upgi、5upk和5uld。使用來自嗜熱網(wǎng)球菌(dictyoglomusthermophilum)(uniprotidb5ybd7)的6-磷酸果糖差向異構(gòu)酶(f6pe)。50℃下在含有5mmmgcl2和10mmf6p的50mmhepes緩沖溶液(ph7.2)中測(cè)定活性。通過vivaspin2濃縮器(10000mwco)過濾酶來停止反應(yīng)。使用6-磷酸塔格糖磷酸酶檢測(cè)產(chǎn)物6-磷酸塔格糖(t6p)，并檢測(cè)游離磷酸鹽的釋放。為了檢測(cè)游離磷酸鹽的釋放，將500μl含有0.1m乙酸鋅和2mm鉬酸銨的溶液(ph5)加入到50μl反應(yīng)物中。將其混合然后加入125μl5％抗壞血酸(ph5)。將溶液混合，然后在30℃孵育20min。讀取850nm處的吸光度以檢測(cè)游離磷酸鹽的釋放。來自嗜熱鏈球菌uni-1(anaerolineathermophilauni-1)(uniprotid：e8n0n6)的嗜熱f6pe核苷酸序列(seqidno.：1)atgttcggctcgcctgctcccctgctggatatggtcaccgcgcagaaacagggcatggcgcggggtatcccatccatttgttcggcacatccggtggtgctgagtgccgcctgccatcttgcccgccggagcggcgcgcccctgctcatcgaaaccacctgcaatcaggtcaaccaccaaggtgggtacagcggcatgacccccgccgattttgtccgctttctgcgcgaaattctggaacgggaaggtattcccccgcaacaggtcatcctgggcggggatcacctgggtccttacccctggcggaaagagcctgccgaaaccgccatagcacaagcgctggaaatggtgcgggcatacgtgcaggcaggctacaccaaaattcatctggacgcttccatgccctgcgccgatgacgaccccgagcgtcccctgccgctggagcgcatagcccgacgggcggcgcagttgtgcgccgccgccgaagccgccgcgggagcggttcagccggtgtacgtaattggcagtgaggtgcccccgcccggcggcgcgcagggtcaggaggcaagacttcacgtcaccactccgcaggaagcccaagccgcgctggatgcctttcgggaagcctttctgcaggcaggcttgactcccgtttgggagcgggtcattgcgctggtagtccagccgggggtggagtttggcgtggacagcattcacgcctatcagcgcgaagccgcccgcccgctgaagaccttcatcgagggcgtgcccggcatggtgtatgaagcccactcgaccgattaccagacccgtgcctccctgcgtgcgctggtggaagaccacttttccattctcaaggttggtccggcactaacctttgcctaccgcgaagccgtgttcgccctggaacacatcgaacgggaaatattgggcaggcaggatatgcctctctcccgcctgagtgaagtcctcgacgaggtgatgctgaacgatccacgccactggcagggatactttgccggcgctcccgccgaacaggcgctggcgcgccgctacagtttcagcgaccgcattcgctattactggcaccatcccgccgcgcaggaagccgtgcggagactgctcgccaacctgatcgaaaccccgccgccgctgagtttgctcagccagtacctgccgcgcgagtatgagatggtgcgcgcgggggaaatctccagccacccgcaggacctgattcgggcacatatccagcacacgctggaagattacgctgcggcgtgcgggtaa氨基酸序列(seqidno.：2)mfgspaplldmvtaqkqgmargipsicsahpvvlsaachlarrsgaplliettcnqvnhqggysgmtpadfvrflreileregippqqvilggdhlgpypwrkepaetaiaqalemvrayvqagytkihldasmpcadddperplpleriarraaqlcaaaeaaagavqpvyvigsevpppggaqgqearlhvttpqeaqaaldafreaflqagltpvwervialvvqpgvefgvdsihayqreaarplktfiegvpgmvyeahstdyqtraslralvedhfsilkvgpaltfayreavfalehiereilgrqdmplsrlsevldevmlndprhwqgyfagapaeqalarrysfsdriryywhhpaaqeavrrllanlietppplsllsqylpreyemvrageisshpqdlirahiqhtledyaaacg來自caldicellulosiruptorkronotskyensis(uniprotid：e4seh3)的嗜熱f6pe核苷酸序列(seqidno.：3)atgagtcctcaaaatccattgattggtttatttaagaatagagaaaaagagtttaagggtattatttcagtttgttcttcaaatgaaatagtcttagaagcagttttaaaaagaatgaaagatacaaacctaccaattattattgaagccacagcgaaccaggtaaatcaatttggcgggtattctgggttgacaccgtctcagttcaaagaacgagttataaaaattgctcaaaaagttgattttccacttgagagaataattcttggtggggaccatcttggaccatttgtgtggcgtgaccaggaaccagaaattgctattggagtatgctaagcaaatgataaaagaatacataaaagcaggttttaccaaaattcacatcgacacgagtatgcctttaaaaggggagaacagcatagatgatgaaataattgctaaaagaactgctgtgctctgcaggattgcggaggagtgttttgagaagatttctataaacaatccctatattacaaggccagtttatgtgataggagctgatgtgccacctcccggcggagagtcttctatttgtcaaacaattactactaaagatgaattagaaagaagtttagaatatttcaaagaagcatttaaaaaggaaggaattgagcatgtattcgattatgtagttgctgttgttgcaaattttggagttgaatttgggagcgatgaaattgttgattttgatatggaaaaagtaaagccgctaaaagaacttttggcaaagtacaatatagtatttgaaggccattctacagattatcaaacaaaagaaaacttaaaaagaatggtcgaatgtggtattgcaattttaaaggttggtcctgctctaacatttacattgcgcgaagcgttagtagcacttagtcatattgaagaagaaatttatagcaatgaaaaggagaaactgtcaagatttagagaagttttattgaatactatgctaacatgcaaagatcactggagtaaatattttgatgagaatgataagttaattaagtcaaagctcctatatagctatcttgacagatggagatactattttgaaaacgagagtgtgaaaagtgctgtttattctcttattggaaatttagagaatgttaaaattccaccttggcttgtaagtcagtattttccttctcagtaccaaaagatgagaaaaaaagatttaaaaaacggtgctgccgacctaatattggataaaataggggaagtcattgaccattatgtttatgcggtaaaagaataa氨基酸序列(seqidno.：4)mspqnpliglfknrekefkgiisvcssneivleavlkrmkdtnlpiiieatanqvnqfggysgltpsqfkervikiaqkvdfpleriilggdhlgpfvwrdqepeiameyakqmikeyikagftkihidtsmplkgensiddeiiakrtavlcriaeecfekisinnpyitrpvyvigadvpppggessicqtittkdelersleyfkeafkkegiehvfdyvvavvanfgvefgsdeivdfdmekvkplkellakynivfeghstdyqtkenlkrmvecgiailkvgpaltftlrealvalshieeeiysnekeklsrfrevllntmltckdhwskyfdendklikskllysyldrwryyfenesvksavyslignlenvkippwlvsqyfpsqyqkmrkkdlkngaadlildkigevidhyvyavke來自caldilineaaerophila(uniprotid：i0i507)的嗜熱f6pe核苷酸序列(seqidno：5)atgtcaacacttcgccacatcattttgcgactgatcgagctgcgtgaacgagaacagatccatctcacgctgctggccgtctgtcccaactcggcggcggtgctggaggcagcggtgaaggtcgccgcgcgctgccacacgccgatgctcttcgctgccacgctcaatcaagtcgatcgcgacggcggctacaccggttggacgcctgcgcaattcgtcgccgagatgcgtcgctatgccgtccgctatggctgcaccaccccgctctatccttgcctggatcacggcgggccgtggctcaaagatcgccatgcacaggaaaagctaccgctcgaccaggcgatgcatgaggtcaagctgagcctcaccgcctgtctggaggccggctacgcgctgctgcacatcgaccccacggtcgatcgcacgctcccgcccggagaagcgccgctcgtgccgatcgtcgtcgagcgcacggtcgagctgatcgaacatgccgaacaggagcgacagcggctgaacctgccggcggtcgcctatgaagtcggcaccgaagaagtacatggcgggctggtgaatttcgacaattttgtcgccttcttggatttgctcaaggcaaggcttgaacaacgtgccctgatgcacgcctggcccgccttcgtggtggcgcaggtcggcactgacctgcatacaacgtattttgaccccagtgcggcgcaacggctgactgagatcgtgcgccctaccggtgcactgttgaaggggcactacaccgactgggtcgaaaatcccgccgactatccgagggtaggcatgggaggcgccaacgttggtccagagtttacggcggccgagttcgaggcgctggaagcgctggaacggcgggaacaacggctgtgcgccaaccggaaattgcagcccgcctgttttttggctgcactggaagaggcagtagtcgcttcagatcgttggcggaagtggctccagcccgatgagatcggcaagccctttgcagaattaacgcccgcacgccggcgctggctcgtgcagaccggggcacgctacgtctggactgcgccgaaagttatcgccgcacgcgaacagctctatgcgcacctctcccttgtgcaggcggatccacatgcctacgtggtagagtcagtcgcccggtcaatcgagcgctatatcgatgccttcaacttatacgacgccgctacattgcttggatga氨基酸序列(seqidno.：6)mstlrhiilrlielrereqihltllavcpnsaavleaavkvaarchtpmlfaatlnqvdrdggytgwtpaqfvaemryavrygcttplypcldhggpwlkdrhaqeklpldqamhevklsltacleagyallhidptvdrtlppgeaplvpivvertveliehaeqerqrlnlpavayevgteevhgglvnfdnfvafldllkarleqralmhawpafvvaqvgtdlhtttyfdpsaaqrlteivrptgallkghytdwvenpadyprvgmgganvgpeftaaefealealerreqrlcanrklqpacflaaleeavvasdrwrkwlqpdeigkpfaeltparrrwlvqtgaryvwtapkviaareqlyahlslvqadphayvvesvarsieryidafnlydaatllg來自caldithrixabyssi(uniprotid：h1xrg1)的嗜熱f6pe核苷酸序列(seqidno.：7)atgagtctgcatcctttaaataaattaatcgagcgacacaaaaaaggaacgccggtcggtatttattccgtctgttcggccaatccctttgttttgaaagcggccatgctacaggcgcaaaaggatcagtctttgctacttattgaggccacttccaaccaggtagatcaattcggcggttacaccggcatgcggcccgaagattttaaaacaatgacgcttgaactggcagccgaaaacaattacgatccacagggattaatcctgggcggcgaccatctggggcccaaccgctggacaaaactgagcgcctcccgggccatggactacgccagagagcagattgccgcttatgttaaagccggcttttccaaaatccacttagacgccaccatgcccttgcaaaacgatgccacagattccgccggccgccttccagtcgaaacaatcgctcaacgtaccgcagaattatgcgccgtggccgaacaaacttaccggcagagcgaccaactctttccgccgcctgtttacattgtcggcagcgacgtgcccatcccgggcggcgcgcaagaagcgctgaaccagatccatattacggaggtaaaagaggttcaacagaccattgatcacgtgcggcgggcctttgaaaaaaacggcctggaagcggcttacgaaagagtttgcgccgttgtcgtgcagccaggcgttgaattcgccgatcaaatcgtttttgaatacgctcccgacagagcggcggccttaaaagattttattgaaagccattcgcagctggtttatgaagcgcactctactgattaccagaccgcacctcttttgcgccagatggtaaaagatcactttgccattttaaaggtcgggcctgcgctcacctttgccctgcgcgaagccatttttgctctggcctttatggaaaaagagcttttgccattgcacagagcgctcaaaccttctgccattctggaaacgctggaccaaacgatggacaaaaaccctgcttactggcaaaagcattacggcggaacaaaggaagaagtacgctttgcgcagcggtttagcctgagcgaccgcattcgttactactggccgtttccaaaggttcaaaaggccctgcgccaattgctaaaaaacttgcaacaaatttccattcctctaactttggtaagccagttcatgccagaggaataccaacgtattcgccaaggaacgttaaccaacgatccgcaggcgctgattttgaacaaaattcaaagcgtattaaagcaatacgcggaggcgacgcaaattcaaaactctttgacattcacgcaaaatcaaaattcattagcaatggagcgactatga氨基酸序列(seqidno.：8)mslhplnklierhkkgtpvgiysvcsanpfvlkaamlqaqkdqslllieatsnqvdqfggytgmrpedfktmtlelaaennydpqglilggdhlgpnrwtklsasramdyareqiaayvkagfskihldatmplqndatdsagrlpvetiaqrtaelcavaeqtyrqsdqlfpppvyivgsdvpipggaqealnqihitevkevqqtidhvrrafekngleaayervcavvvqpgvefadqivfeyapdraaalkdfieshsqlvyeahstdyqtapllrqmvkdhfailkvgpaltfalreaifalafmekellplhralkpsailetldqtmdknpaywqkhyggtkeevrfaqrfslsdriryywpfpkvqkalrqllknlqqisipltlvsqfmpeeyqrirqgtltndpqalilnkiqsvlkqyaeatqiqnsltftqnqnslamerl來自dictyglomusthermophilum(uniprotid：b5ybd7)的嗜熱f6pe核苷酸序列(seqidno.：9)atgtggcttagtaaagattatttgagaaaaaagggagtttattctatatgtagctctaatccatatgtgattgaggcaagtgttgaatttgctaaggagaagaatgattatattttaattgaggcgacacctcatcagataaaccagtttggtggatattcaggtatgactcccgaagattttaaaaactttgtaatgggaataataaaagaaaagggaatagaagaggatagggtgattcttggaggggaccatttaggccctctcccttggcaagatgaaccttcttcttctgcaatgaaaaaggcaaaagaccttataagggcctttgtggagagtggttataagaagatacaccttgattgtagtatgtctctttctgatgatcctgtagtgctctctcccgagaagatagcagaaagggagagggaacttcttgaggttgcagaagagactgctagaaagtacaattttcagcctgtgtatgtggtgggaactgatgtaccggtagctggaggaggcgaagaggaaggtattacctcagtggaggattttagagtagcaatctcctctttaaaaaaatattttgaggatgttccaaggatatgggataggataattggttttgtaataatgcttggtataggttttaattatgaaaaagtgtttgagtatgacaggattaaggtgagaaaaattttagaggaggtaaagaaagagaatctttttgttgaaggtcactctactgactatcagacaaaacgtgcattgagagatatggtagaggatggagtaagaattcttaaggttggtcctgctttaacagcaagttttagaaggggagtatttttattaagtagcattgaggatgagcttatatcggaagataaaaggtctaatattaagaaagttgtgcttgagactatgttaaaagatgataaatattggagaaagtattataaggattcagaaagattagaattagatatttggtacaacttacttgataggattagatattattgggaatataaagagataaaaatagcttaaataggcttttgaaaatttttcggaaggggttgatattagatacatctatcaatatttttatgattcgtattttaaagtaagagaaggaaaaataagaaatgatccaagggagctaataaagaatgaaataaagaaggtcttggaggactatcactatgctgtaaacttataa密碼子優(yōu)化的核苷酸序列(seqidno.：10)atgtggctgagcaaggactacctgcgtaagaagggcgtttacagcatttgcagcagcaacccgtatgttattgaagcgagcgtggagttcgcgaaggagaaaaacgattacatcctgattgaagcgaccccgcaccagatcaaccaatttggtggctatagcggcatgaccccggaggacttcaagaactttgttatgggcatcattaaggaaaaaggtatcgaggaagaccgtgtgattctgggtggcgatcacctgggtccgctgccgtggcaggatgagccgagcagcagcgcgatgaagaaagcgaaagacctgatccgtgcgttcgttgaaagcggttacaagaaaattcacctggattgcagcatgagcctgagcgacgatccggtggttctgagcccggagaagatcgcggaacgtgagcgtgaactgctggaagttgcggaggaaaccgcgcgtaaatacaactttcaaccggtgtatgtggtgggtaccgatgttccggttgcgggtggcggtgaggaagagggtatcaccagcgtggaggacttccgtgttgcgattagcagcctgaagaaatactttgaagacgttccgcgtatttgggatcgtatcattggtttcgtgatcatgctgggcattggtttcaactacgagaaggtgtttgaatatgatcgtatcaaagtgcgtaaaattctggaagaggttaagaaagagaacctgtttgtggaaggccacagcaccgactatcagaccaagcgtgcgctgcgtgacatggtggaggatggcgttcgtatcctgaaagtgggtccggcgctgaccgcgagcttccgtcgtggtgtgtttctgctgagcagcatcgaggacgaactgattagcgaggataaacgtagcaacattaagaaagtggttctggaaaccatgctgaaggacgataaatactggcgtaagtactataaagacagcgagcgtctggaactggatatctggtacaacctgctggaccgtattcgttactactgggagtacaaggaaatcaagattgcgctgaaccgtctgttcgagaactttagcgaaggcgttgatatccgttacatctaccaatacttctacgacagctacttcaaagtgcgtgagggtaaaatccgtaacgacccgcgtgaactgattaagaacgagattaagaaagtgctggaagactaccattatgcggtgaacctgtaa氨基酸序列(seqidno.：11)mwlskdylrkkgvysicssnpyvieasvefakekndyilieatphqinqfggysgmtpedfknfvmgiikekgieedrvilggdhlgplpwqdepsssamkkakdltrafvesgykkihldcsmslsddpvvlspekiaererellevaeetarkynfqpvyvvgtdvpvagggeeegitsvedfrvaisslkkyfedvpriwdriigfvimlgigfnyekvfeydrikvrktleevkkenlfveghstdyqtkralrdmvedgvrilkvgpaltasfrrgvfllssiedelisedkrsnikkvvletmlkddkywrkyykdserleldiwynlldriryyweykeikialnrlfenfsegvdiryiyqyfydsyfkvregkirndprelikneikkvledyhyavnl使用來自archaeoglobusfugidis(uniprotido29805)的6-磷酸塔格糖磷酸酶(t6pp)。50℃下在含有5mmmgcl2和10mmt6p的50mmhepes緩沖溶液(ph7.2)中測(cè)定活性。通過vivaspin2濃縮器(10000mwco)過濾酶來停止反應(yīng)。通過檢測(cè)如f6pe所述的游離磷酸鹽的釋放來檢測(cè)塔過糖的生成。來自archaeoglobusfugidis(uniprotid：029805)的嗜熱t(yī)6pp核苷酸序列(seqidno.：12)atgttcaaaccaaaggccatcgcagttgacatagatggcaccctcaccgacagaaagagggctctgaactgcagggctgttgaagctctccgcaaggtaaaaattcccgtgattttggccactggtaacatatcttgttttgcgagggctgcagcaaagctgattggagtctcagacgtggtaatctgcgagaatgggggcgtggtgaggttcgagtacgatggggaggatattgttttaggagataaagagaaatgcgttgaggctgtgagggtgcttgagaaacactatgaggttgagctgctggacttcgaatacaggaagtcggaagtgtgcatgaggaggagctttgacatcaacgaggcgagaaagctcattgaggggatgggggttaagcttgtggattcaggctttgcctaccacattatggatgctgatgttagcaagggaaaagctttgaagttcgttgccgagaggcttggtatcagttcagcggagtttgcagttatcggcgactcagagaacgacatagacatgttcagagttgctggattcggaattgctgttgccaatgccgatgagaggctgaaggagtatgctgatttagttacgccatcaccagacggcgagggggttgttgaggctttgcagtttctgggattgttgcggtga氨基酸序列(seqidno.：13)mfkpkaiavdidgtltdrkralncravealrkvkipvilatgniscfaraaakligvsdvvicenggvvrfeydgedivlgdkekcveavrvlekhyevelldfeyrksevcmrsfdinearkliegmgvklvdsgfayhimdadvskgkalkfvaerlgissaefavigdsendidmfrvagfgiavanaderlkeyadlvtpspdgegvvealqflgllr來自archaeoglobusprofundus(uniprotidd2rhv2_arcpa)的t6pp核苷酸序列(seqidno.：14)gtgttcaaggctttggtagttgatatagacggaactttgacggataagaagagggcaataaactgcagagcggtcgaagcacttagaaaactaaagattcctgttgtcttggcaaccggaaacatttcatgctttgcaagggctgtagctaagattataggtgtttccgatattgtaatagctgagaacggaggtgttgtcagattcagctacgacggagaggacatagttctgggggatagaagtaaatgcttaagagctttggagacacttagaaaacgcttcaaagtagagcttctcgacaacgaatataggaagtctgaggtctgcatgaggaggaacttccctatagaggaagctagaaagatactgccaaaagatgttagaatagtcgatacaggcttcgcataccacataatcgatgcaaatgtcagcaaggggaaggctttgatgttcatagccgataagcttggcttggacgttaaggatttcattgcgataggtgattccgaaaacgacattgaaatgttggaagttgcaggttttggcgttgcagttgcgaatgcggatgaaaagcttaaggaggtagcggatttggtcacatcgaagcctaatggagacggagttgtcgaagctcttgagttcttgggactcatttag氨基酸序列(seqidno.：15)mfkalvvdidgtltdkkraincravealrklkipvvlatgniscfaravakiigvsdiviaenggvrfsydgedivlgdrskclraletlrkrfkvelldneyrksevcmrrnfpieearkilpkdvrivdtgfayhiidanvskgkalmfiadklgldvkdfiaigdsendiemlevagfgvavanadeklkevadlvtskpngdgvvealeflgli來自archaeoglobusvebeficus(uniprotidf2kmk2_arcvs)的t6pp核苷酸序列(seqidno.：16)atgctccgtccaaagggtctcgccattgacatcgacggaaccataacatacaggaatcgaagcctgaactgtaaggccgttgaagctctcaggaaggtaaaaatccctgtagttcttgcaactggcaacatatcctgtttcgcaagaactgctgcaaagcttataggcgtctcagacattgttatatgcgaaaatggaggtattgttcgattcagctacgatggcgacgacatagtgcttggggacataagcaaatgccttaaagcggctgaaattctcaaagagtactttgaaatcgaattccttgacgctgagtacaggaagtcggaggtctgtcttcgcagaaactttcctattgaagaggcgaggaaaattcttcacgatgcaaagcttgatgttaaaatcgtcgattcaggttttgcgtaccacataatggatgcgaaggtcagcaaaggaagggctcttgagtacatagctgatgaacttggtataagtccgaaggagttcgctgcaattggtgattctgagaacgacatagacctgattaaggctgccggcctcggtattgccgttggagatgctgacttaaagctcaaaatggaggccgacgtggtagtctcgaagaagaatggcgatggagttgttgaagcacttgagcttctgggcttaatttaa氨基酸序列(seqidno.：17)mlrpkglaididgtityrnrslnckavealrkvkipvvlatgniscfartaakligvsdivicenggivrfsydgddivlgdiskclkaaeilkeyfeiefldaeyrksevclrrnfpieearkilhdakldvkivdsgfayhimdakvskgraleyiadelgispkefaaigdsendidlikaaglgiavgdadlklkmeadvvvskkngdgvvealellgliye等人在“spontaneoushigh-yieldproductionofhydrogenfromcellulosicmaterialsandwatercatalyzedbyenzymecocktails，chemsuschem2009；2：149-152”中描述了來自c.thermocellum的重組纖維糊精磷酸化酶和纖維二糖磷酸化酶。如上所述測(cè)定其活性。liao等人在“one-steppurificationandimmobilizationofthermophilicpolyphosphateglucokinasefromthermobiffdafuscayx：glucose-6-phosphategenerationwithoutatp.appl.microbiol.biotechnol.2012；93：1109-1117”中描述了來自thermobifidafuscayx的重組多磷酸鹽葡糖激酶。如上所述測(cè)定其活性。cheng等人在“doublingpoweroutputofstarchbiobatterytreatedbythemostthermostableisoamylasefromanarchaeonsulfolobustokodaii.scientificreports2015；5：13184”中描述了來自sulfolobustokodaii的重組異淀粉酶。如上所述測(cè)定其活性。jeon等人在“4-α-glucanotransferasefromthehyperthermophilicarchaeonthermococcuslitoralis.eur.j.biochem.1997；248：171-178”中描述了來自thermococcuslitoralis的重組4-α-葡聚糖轉(zhuǎn)移酶。如上所述測(cè)定其活性。使用來自caldithrixabyssi(uniproth1xt50)的蔗糖磷酸化酶。在含有10mm蔗糖和12mm有機(jī)磷酸鹽的50mmhepes緩沖溶液(ph7.5)中測(cè)定其活性。使用補(bǔ)充有25u/ml葡萄糖磷酸變位酶和α-葡聚糖磷酸化酶的葡萄糖己糖激酶/g6pdh檢測(cè)試劑盒，檢測(cè)1-磷酸葡萄糖(g1p)。在以下每個(gè)實(shí)例中，根據(jù)需要可以增加或減少使用的酶單位以調(diào)節(jié)反應(yīng)時(shí)間。例如，如果想在8h而不是24h進(jìn)行實(shí)例9，酶的單位將增加約3倍。相反，如果想要在48h而不是24h進(jìn)行實(shí)例9，則酶單位可以減少約2倍。這些實(shí)施例說明了可以如何使用酶單位的量來增加或減少反應(yīng)時(shí)間，同時(shí)保持恒定的生產(chǎn)率。實(shí)例1為了驗(yàn)證采用淀粉酶促生物合成6-磷酸果糖的技術(shù)可行性，重組表達(dá)了三種酶：來自t.maritima(uniprotidg4feh8)的α-葡聚糖磷酸化酶、來自thermococcuskodakaraensis(uniprotidq68bj6)的葡萄糖磷酸變位酶以及來自clostridiumthermocellum(uniprotida3dbx9)的磷酸異構(gòu)酶。重組蛋白質(zhì)在大腸桿菌bl21(de3)中過度表達(dá)并如上所述純化。將含有10g/l可溶性淀粉、50mmph7.2的磷酸鹽緩沖溶液、5mmmgcl2、0.5mmzncl2、0.01uαgp、0.01upgm和0.01upgi的0.20ml反應(yīng)混合物在50℃孵育24h。通過vivaspin2濃縮器(10000mwco)過濾酶來停止反應(yīng)。使用6-磷酸果糖激酶(f6pk)/丙酮酸脫氫酶(pk)/乳酸脫氫酶(ld)偶聯(lián)酶檢測(cè)法檢測(cè)產(chǎn)物6-磷酸果糖(f6p)，其中在340nm處吸光度的降低表明生成了如上所述的f6p。24h后f6p的最終濃度為3.6g/l。實(shí)例2在40-80℃進(jìn)行與實(shí)例1(除反應(yīng)溫度外)相同的試驗(yàn)。發(fā)現(xiàn)在40℃反應(yīng)40h后，10g/l可溶性淀粉生成0.9g/lf6p，在80℃反應(yīng)40h后，10g/l可溶性淀粉生成3.6g/lf6p。這些結(jié)果表明，提高這一組酶的反應(yīng)溫度會(huì)增加f6p的產(chǎn)量，但太高的溫度可能會(huì)損害一些酶的活性。實(shí)例3發(fā)現(xiàn)在80℃，αgp：pgm：pgi的酶比率約為1：1：1導(dǎo)致f6p快速生成。注意，如果反應(yīng)時(shí)間足夠長，則酶比率對(duì)最終f6p濃度的影響不會(huì)太大。然而，酶比率影響反應(yīng)速率和系統(tǒng)中使用的酶的總成本。實(shí)例4將含有10g/l麥芽糖糊精、50mmph7.2的磷酸鹽緩沖溶液、5mmmgcl2、0.5mmzncl2、0.01uαgp、0.01upgm和0.01upgi的0.20ml反應(yīng)混合物在50℃孵育24h。通過vivaspin2濃縮器(10000mwco)過濾酶來停止反應(yīng)。使用6-磷酸果糖激酶(f6pk)/丙酮酸脫氫酶(pk)/乳酸脫氫酶(ld)偶聯(lián)酶檢測(cè)法檢測(cè)產(chǎn)物6-磷酸果糖(f6p)，其中在340nm處吸光度的降低表明生成了如上所述的f6p。24h后f6p的最終濃度為3.6g/l。實(shí)例5為了測(cè)試由avicel生成了f6p，使用sigma的纖維素酶在50℃水解纖維素。為了從商業(yè)的纖維素酶中除去β-葡糖苷酶，在冰水浴中，將10濾紙單位/ml的纖維素酶與10g/lavicel混合10分鐘。4℃離心后，倒出含有β-葡糖苷酶的上清液。將與纖維素酶結(jié)合的avicel重懸于檸檬酸鹽緩沖溶液(ph4.8)中，在50℃水解3天，該纖維素酶含有內(nèi)切葡聚糖酶和外切纖維素酶。在含有10mm磷酸鹽、5mmmgcl2和0.5mmzncl2的100mmhepes緩沖溶液(ph7.2)中，將纖維素水解產(chǎn)物與5u/ml纖維糊精磷酸化酶、5u/ml纖維二糖磷酸化酶、5u/mlαgp、5u/mlpgm和5u/mlpgi混合。反應(yīng)在60℃進(jìn)行72h，發(fā)現(xiàn)高濃度的f6p(少量葡萄糖而無纖維二糖)。使用上述的偶聯(lián)酶檢測(cè)法檢測(cè)f6p。使用如上所述的己糖激酶/g6pdh檢測(cè)試劑盒檢測(cè)葡萄糖。實(shí)例6為了提高由avicel生成f6p的產(chǎn)量，用濃磷酸預(yù)處理avicel以生成無定形纖維素(rac)，如zhang等人在“atransitionfromcelluloseswellingtocellulosedissolutionbyo-phosphoricacid:evidencefromenzymatichydrolysisandsupramolecularstructure.biomacromolecules2006；7：644-648)”中所述。為了從商業(yè)的纖維素酶中除去β-葡糖苷酶，在冰水浴中，將10濾紙單位/ml的纖維素酶與10g/l的rac混合5分鐘。4℃離心后，倒出含有β-葡糖苷酶的上清液。將與纖維素酶結(jié)合的rac重新懸浮于檸檬酸鹽緩沖溶液(ph4.8)中，在50℃水解12小時(shí)，該纖維素酶含有內(nèi)切葡聚糖酶和外切纖維素酶。在含有10mm磷酸鹽、5mmmgcl2和0.5mmzncl2的100mmhepes緩沖溶液(ph7.2)中，將rac水解產(chǎn)物與5u/ml纖維糊精磷酸化酶、5u/ml纖維二糖磷酸化酶、5u/mlαgp、5u/mlpgm和5umlpgi混合。反應(yīng)在60℃進(jìn)行72小時(shí)。獲得高濃度的f6p和葡萄糖，因?yàn)闆]有添加酶將葡萄糖轉(zhuǎn)化為f6p。使用上述的偶聯(lián)酶檢測(cè)法檢測(cè)f6p。使用如上所述的己糖激酶/g6pdh檢測(cè)試劑盒檢測(cè)葡萄糖。實(shí)例7為了進(jìn)一步提高由rac生成f6p的產(chǎn)量，加入多磷酸鹽葡糖激酶和多磷酸鹽。為了從商業(yè)的纖維素酶中除去β-葡糖苷酶，在冰水浴中，將10濾紙單位/ml的纖維素酶與10g/l的rac混合5分鐘。4℃離心后，倒出含有β-葡糖苷酶的上清液。將與纖維素酶結(jié)合的rac重懸于檸檬酸鹽緩沖溶液(ph4.8)中在50℃水解，該纖維素酶含有內(nèi)切葡聚糖酶和外切纖維素酶，并在檸檬酸鹽緩沖溶液(ph4.8)中孵育以在50℃水解12h。在含有50mm多磷酸鹽、10mm磷酸鹽、5mmmgcl2和0.5mmzncl2的100mmhepes緩沖溶液(ph7.2)中，將rac水解產(chǎn)物與5u/ml多磷酸鹽葡糖激酶、5u/ml纖維糊精磷酸化酶、5u/ml纖維二糖磷酸化酶、5u/mlαgp、5u/mlpgm和5u/mlpgi混合。反應(yīng)在50℃進(jìn)行72h。發(fā)現(xiàn)高濃度的f6p及少量葡萄糖存在。使用上述的偶聯(lián)酶檢測(cè)法檢測(cè)f6p。使用如上所述的己糖激酶/g6pdh檢測(cè)試劑盒檢測(cè)葡萄糖。實(shí)例8為了驗(yàn)證由f6p生成了塔格糖，在含有5mmmgcl2的50mmhepes緩沖溶液(ph7.2)中，將2g/lf6p與1u/ml6-磷酸果糖差向異構(gòu)酶(f6pe)和1u/ml6-磷酸塔格糖磷酸酶(t6pp)混合。將反應(yīng)在50℃孵育16h。使用agilenthi-plexh柱和折光率檢測(cè)器，通過hplc(agilent1100系列)觀察到f6p100％轉(zhuǎn)化為塔格糖。樣品在5mlh2so4中以0.6ml/min運(yùn)行。實(shí)例9為了驗(yàn)證由麥芽糖糊精生成了塔格糖，將含有20g/l麥芽糖糊精、50mmph7.2的磷酸鹽緩沖溶液、5mmmgcl2、0.05uαgp、0.05upgm、0.05upgi、0.05uf6pe和0.05ut6pp的0.20ml反應(yīng)混合物在50℃孵育24小時(shí)。通過vivaspin2濃縮器(10000mwco)過濾酶來停止反應(yīng)。使用具有折光率檢測(cè)器和agilenthi-plexh柱的agilent1100系列hplc檢測(cè)和定量塔格糖。流動(dòng)相為5mmh2so4，以0.6ml/min運(yùn)行。得到9.2g/l的塔格糖產(chǎn)量。這相當(dāng)于理論產(chǎn)量的92％，這是由于不含酶(如異淀粉酶或4-轉(zhuǎn)葡糖苷酶)的麥芽糖糊精降解的限制。使用各種濃度的塔格糖的標(biāo)準(zhǔn)來量化我們的產(chǎn)量。實(shí)例10將含有200g/l麥芽糖糊精、10mm乙酸鹽緩沖溶液(ph5.5)、5mmmgcl2和0.1g/l異淀粉酶的反應(yīng)混合物在80℃孵育24小時(shí)。將其用于生成其他的反應(yīng)混合物，該反應(yīng)混合物含有20g/l異淀粉酶處理的麥芽糖糊精、50mmph7.2的磷酸鹽緩沖溶液、5mmmgcl2、0.05uαgp、0.05upgm、0.05upgi、0.05uf6pe和0.05ut6pp，在50℃孵育24小時(shí)。如實(shí)例9定量生成的塔格糖。通過異淀粉酶預(yù)處理麥芽糖糊精，塔格糖的產(chǎn)量提高至16g/l。這相當(dāng)于理論產(chǎn)量的80％。實(shí)例11為了進(jìn)一步提高由麥芽糖糊精生成塔格糖的產(chǎn)量，將0.05u4-轉(zhuǎn)葡糖苷酶(4gt)加入實(shí)例9所述的反應(yīng)中。將含有20g/l異淀粉酶處理的麥芽糖糊精(參見實(shí)例9)、50mmph7.2的磷酸鹽緩沖溶液、5mmmgcl2、0.05uαgp、0.05upgm、0.05upgi、0.05uf6pe、0.05ut6pp和0.05u4gt的0.2ml反應(yīng)混合物在50℃孵育24h。如實(shí)例9定量塔格糖的生產(chǎn)量。通過向ia處理的麥芽糖糊精中加入4gt，塔格糖的產(chǎn)量提高至17.7g/l。這相當(dāng)于理論產(chǎn)量的88.5％。實(shí)例12為了確定磷酸鹽緩沖溶液(pbs)的濃度范圍，將含有50g/l麥芽糖糊精、(6.25mm、12.5mm、25mm、37.5mm或50mm)ph7.2的磷酸鹽緩沖溶液、5mmmgcl2、0.1uαgp、0.1upgm、0.1upgi、0.1uf6pe和0.1ut6pp的0.20ml反應(yīng)混合物在50℃孵育6h。短期內(nèi)確保反應(yīng)未能完全，因此可以清楚地看到效率的差異。如實(shí)例9定量塔格糖的生產(chǎn)量。對(duì)于含有6.25mm、12.5mm、25mm、37.5mm或50mmph7.2的磷酸鹽緩沖溶液的反應(yīng)，分別獲得4.5g/l、5.1g/l、5.6g/l、4.8g/l或4.9g/l的塔格糖(表1)。這些結(jié)果表明，濃度為25mm的ph7.2pbs對(duì)于這些特定的反應(yīng)條件是理想的。重點(diǎn)注意的是，由于磷酸鹽循環(huán)利用，即使使用6.25mmph7.2的pbs也會(huì)實(shí)現(xiàn)明顯降低。這表明即使在工業(yè)水平的體積產(chǎn)量(例如，200-300g/l麥芽糖糊精)，所公開的磷酸鹽循環(huán)利用方法也能夠降低磷酸鹽水平。表1ph7.2的pbs的濃度(mm)塔格糖g/l6.254.512.55.1255.637.54.8504.9實(shí)例13為了確定級(jí)聯(lián)反應(yīng)的ph范圍，將含有50g/l麥芽糖糊精、50mm磷酸鹽緩沖溶液(ph6.0、6.2、6.4、6.6、6.8、7.0、7.2或7.3)、5mmmgcl2、0.02uαgp、0.02upgm、0.02upgi、0.02uf6pe和0.02ut6pp的20ml反應(yīng)混合物在50℃孵育16h。降低單位以確保反應(yīng)未能完全，因此可以清楚地看到效率的差異。如實(shí)例8定量塔格糖的產(chǎn)量。對(duì)于含有50mmph6.0、6.2、6.4、6.6、6.8、7.0、7.2或7.3磷酸鹽緩沖溶液的反應(yīng)，分別獲得4.0g/l、4.1g/l、4.2g/l、4.1g/l、4.4g/l、4.1g/l、3.8g/l或4.0g/l的塔格糖(表2)。這些結(jié)果表明，對(duì)于這些特定的反應(yīng)條件，ph6.8是理想的，盡管該體系可以在寬的ph范圍內(nèi)反應(yīng)。表2pbs的ph塔格糖g/l6.04.06.24.16.44.26.64.16.84.47.04.17.23.87.34.0實(shí)例14為了研究放大，將含有50g/l異淀粉酶處理的麥芽糖糊精(參見實(shí)例9)、50mmph7.2磷酸鹽緩沖溶液、5mmmgcl2、10uαgp、10upgm、10upgi、10uf6pe和10ut6pp的20ml反應(yīng)混合物在50℃孵育24小時(shí)。如實(shí)例8定量塔格糖的生產(chǎn)量。對(duì)20ml規(guī)模和50g/l麥芽糖糊精，塔格糖的產(chǎn)量為37.6g/l。這相當(dāng)于理論產(chǎn)量的75％。這些結(jié)果表明，放大到更大的反應(yīng)體積不會(huì)導(dǎo)致產(chǎn)量的顯著降低。實(shí)例15為了進(jìn)一步提高由麥芽糖糊精生成塔格糖的產(chǎn)量，將0.05u麥芽糖磷酸化酶加入到實(shí)例9所述的反應(yīng)中。實(shí)例16為了進(jìn)一步提高由麥芽糖糊精生成塔格糖的產(chǎn)量，將0.05u多磷酸鹽葡糖激酶和75mm多磷酸鹽加入到實(shí)例9所述的反應(yīng)中。實(shí)例17為了從果糖生成塔格糖，將含有10g/l果糖、50mmph7.0的tris緩沖溶液、75mm多磷酸鹽、5mmmgcl2、0.05u果糖多磷酸鹽激酶、0.05uf6pe和0.05ut6pp的反應(yīng)混合物在50℃孵育24h。如實(shí)例9定量塔格糖的生產(chǎn)量。實(shí)例18為了從葡萄糖生成塔格糖，將含有10g/l葡萄糖、50mmph7.0的tris緩沖溶液、75mm多磷酸鹽、5mmmgcl2、0.05u葡萄糖多磷酸鹽激酶、0.05upgi、0.05uf6pe和0.05ut6pp的反應(yīng)混合物在50℃孵育24h。如實(shí)例9定量塔格糖的生產(chǎn)量。實(shí)例19為了從蔗糖生成塔格糖，將含有10g/l蔗糖、50mmph7.0的磷酸鹽緩沖溶液、5mmmgcl2、0.05u蔗糖磷酸化酶、0.05upgm、0.05upgi、0.05uf6pe和0.05ut6pp的反應(yīng)混合物在50℃孵育24h。如實(shí)例9定量塔格糖的生產(chǎn)量。實(shí)例20為了進(jìn)一步提高從蔗糖生成塔格糖的產(chǎn)量，將75mm多磷酸鹽和0.05多磷酸鹽果糖激酶加入到實(shí)例15的反應(yīng)混合物中。如實(shí)例9定量塔格糖的生產(chǎn)量。當(dāng)前第1頁12當(dāng)前第1頁12