本發(fā)明涉及一種用于分級(jí)富含蛋白質(zhì)微藻的生物質(zhì)的組分的方法。
背景技術(shù)：
本領(lǐng)域普通技術(shù)人員熟知的是，小球藻是潛在的食品來(lái)源，因?yàn)樗鼈兏缓鞍踪|(zhì)和其他必需營(yíng)養(yǎng)素。
它們被描述為含有45％蛋白質(zhì)、20％脂肪、20％碳水化合物、5％纖維和10％礦物質(zhì)和維生素。
鑒于其豐度及其氨基酸譜，微藻蛋白質(zhì)因此被認(rèn)為是食品中的大豆蛋白質(zhì)或豌豆蛋白質(zhì)的替代性來(lái)源。
蛋白質(zhì)級(jí)分也可以被開(kāi)發(fā)為化妝品行業(yè)、或甚至醫(yī)藥行業(yè)中的功能劑。
然而，由于在所述級(jí)分中存在不希望的化合物(例如葉綠素)導(dǎo)致包含它們的食品組合物的顏色、風(fēng)味和結(jié)構(gòu)方面的不希望的變化，所以微藻蛋白質(zhì)的食品應(yīng)用方面的發(fā)展尚不顯著。
為了增加其在食品應(yīng)用中的潛力，并且也為了增加其商業(yè)價(jià)值，因此必須在不影響它們的分子結(jié)構(gòu)的情況下從微藻中提取這些蛋白質(zhì)。
“軟”提取技術(shù)將因此需要分離具有高溶解度和良好技術(shù)和功能特性的蛋白質(zhì)，但是尤其綠色微藻的微藻細(xì)胞壁的剛性根本上與這一點(diǎn)矛盾，因?yàn)樗茐牧思?xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)的提取和完整性。
因此，與其相反，常規(guī)地“硬”的物理或化學(xué)條件被用來(lái)破壞微藻細(xì)胞壁。
因此，許多研究提出了堿溶類型、通過(guò)有機(jī)溶劑提取類型或高壓勻化類型的技術(shù)。
然而，在這些技術(shù)選擇中，蛋白質(zhì)的變性未認(rèn)為是麻煩的，因?yàn)榇蠖鄶?shù)的這些方法被開(kāi)發(fā)用于分析的目的，或旨在提供用于產(chǎn)生水解蛋白質(zhì)的酶消化的底物。
然而，保存細(xì)胞組分完整性的有效崩解方法應(yīng)該不僅最大化產(chǎn)率，而且最大化提取的產(chǎn)物的質(zhì)量。
換言之，用于優(yōu)化崩解壁的方法必須例如避免：
-目標(biāo)產(chǎn)物的化學(xué)污染，
-使用過(guò)高的破裂能；后者可能導(dǎo)致感興趣的細(xì)胞內(nèi)分子的不可逆變性或降解。
此外，對(duì)于大規(guī)模生產(chǎn)而言，對(duì)于選擇的方法，重要的是可轉(zhuǎn)換至這一規(guī)模。
最后，此細(xì)胞崩解步驟的引入必須是容易的，并且必須對(duì)隨后的方法/處理步驟不具有負(fù)面影響。
所有這些限制影響崩解方法的效率并且由于同樣原因影響其能量消耗。
這就是為什么珠磨機(jī)技術(shù)是優(yōu)選的，因?yàn)樗徽J(rèn)為對(duì)于按其天然形式釋放細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)是有效的。
在珠磨機(jī)中，將細(xì)胞與小球形顆粒一起以懸浮液狀態(tài)攪動(dòng)。細(xì)胞的破碎是由剪切力、珠間碾磨以及與珠的碰撞引起的。
例如，專利us5330913中給出了適當(dāng)?shù)闹槟C(jī)的描述。這些珠使細(xì)胞破碎以便從中釋放細(xì)胞內(nèi)容物。然后以“水包油”乳液形式獲得更小尺寸(與起源細(xì)胞相比)的顆粒的懸浮液。
通常霧化此乳液并且消除水，然而留下包含由細(xì)胞碎片、間質(zhì)可溶性化合物和油構(gòu)成的異質(zhì)混合物的干燥粉末。
在使用這些細(xì)胞崩解技術(shù)時(shí)要解決的困難是單獨(dú)地分離細(xì)胞內(nèi)內(nèi)容物(以便排除細(xì)胞膜碎片、糖、纖維和脂肪)以及尤其是保存蛋白質(zhì)負(fù)載的質(zhì)量。
在四爿藻(tetraselmissp)屬的微藻的情況下，anjaschwenzfeier等人(bioresourcetechnology[生物資源技術(shù)]，2011，102，9121-9127)提出了保證分離的蛋白質(zhì)的溶解度和氨基酸譜質(zhì)量并且其中污染物(例如著色物質(zhì))被除去的方法，該方法包括以下步驟：
-通過(guò)珠磨機(jī)進(jìn)行細(xì)胞崩解，
-將碾磨的微藻懸浮液離心，
-上清液的透析，
-穿過(guò)離子交換樹(shù)脂，
-洗脫物的透析，
-脫色，然后
-洗滌和再懸浮。
然而，這種實(shí)驗(yàn)室方法(用于處理24g的生物質(zhì))不能放大到工業(yè)規(guī)模，其中反而將珠磨機(jī)方法用于回收完整生物質(zhì)。
已經(jīng)提出了替代解決方案，完全地改變了用于釋放微藻細(xì)胞內(nèi)內(nèi)容物的技術(shù)，例如脈沖場(chǎng)電處理。
這是因?yàn)樯锛?xì)胞暴露于高強(qiáng)度脈沖電場(chǎng)會(huì)改變細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)。
外源場(chǎng)引起細(xì)胞膜的充電。在足夠的跨膜電壓(0.5v-1v)下，磷脂的分子排列改變，這導(dǎo)致細(xì)胞膜失去其屏障作用，使得它可滲透。取決于使用的條件，此細(xì)胞膜透化可以是可逆的或不可逆的。
然而，為了有效提取細(xì)胞內(nèi)化合物，使用此技術(shù)的本領(lǐng)域普通技術(shù)人員依然建議造成細(xì)胞膜的不可逆的透化，由此導(dǎo)致其崩解。
然后，細(xì)胞膜的此破裂促進(jìn)釋放細(xì)胞內(nèi)容物，并且在使用補(bǔ)充性溶劑提取技術(shù)的情況下，也促進(jìn)溶劑滲透進(jìn)入細(xì)胞。
盡管是有前景的，但是不幸地，此技術(shù)并不能外推至工業(yè)規(guī)模以處理在1m3至200m3的反應(yīng)器中產(chǎn)生的生物質(zhì)。
其結(jié)果是，對(duì)于提供用于弱化微藻細(xì)胞壁的技術(shù)仍存在未滿足的需求，該技術(shù)能夠釋放細(xì)胞內(nèi)內(nèi)容物，而不崩解細(xì)胞或削弱其組分的質(zhì)量。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本申請(qǐng)人公司已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，這種需求可以通過(guò)將用于微藻細(xì)胞的熱透化的方法與離心和沉淀(通過(guò)改變培養(yǎng)基的特性)的步驟組合得到滿足。
因此，本申請(qǐng)人公司反對(duì)以下技術(shù)偏見(jiàn)，該技術(shù)偏見(jiàn)認(rèn)為，用于細(xì)胞破碎的熱方法，就像由機(jī)械崩解引起的剪切力，是用于降解或變性源自微藻的產(chǎn)物的替代的技術(shù)(richmond，1986，handbookofmicroalgalmassculture[微藻大量培養(yǎng)手冊(cè)]，crc出版有限公司(crcpress,inc)-molinagrima等人，2003，recoveryofmicroalgalbiomassandmetabolites:processoptionsandeconomics[微藻生物質(zhì)和代謝物的回收：方法選項(xiàng)和經(jīng)濟(jì)學(xué)]，biotechnol.adv.[生物技術(shù)進(jìn)步]20:491-515)。
此外，一旦從細(xì)胞內(nèi)區(qū)室釋放，容易地進(jìn)行肽分離物的回收，只要由本申請(qǐng)人公司開(kāi)發(fā)的熱處理不導(dǎo)致細(xì)胞壁的崩解。
最后，本發(fā)明的方法使得有可能尤其是回收和升級(jí)殘余生物質(zhì)，以及還有肽分離物的副產(chǎn)物。
具體實(shí)施方式
本發(fā)明因此涉及一種用于分級(jí)富含蛋白質(zhì)微藻的生物質(zhì)的組分的方法：
-通過(guò)進(jìn)行細(xì)胞膜的熱透化的方法，接著
-回收并升級(jí)如此經(jīng)透化的殘余生物質(zhì)及其副產(chǎn)物。
更確切地說(shuō)，根據(jù)本發(fā)明的方法是用于分級(jí)小球藻(chlorella)屬的富含蛋白質(zhì)微藻的生物質(zhì)的組分的方法，其特征在于該方法包括以下步驟：
-提供通過(guò)發(fā)酵產(chǎn)生的微藻生物質(zhì)，
-任選地，洗滌該生物質(zhì)以便消除間質(zhì)可溶性化合物，
-在50℃與150℃之間、優(yōu)選在約80℃與150℃之間的溫度下將該生物質(zhì)熱透化，持續(xù)在約10秒與約5分鐘之間的時(shí)間、優(yōu)選地持續(xù)在約5秒與約1分鐘之間的時(shí)間，
-在如此經(jīng)透化的生物質(zhì)與可溶性級(jí)分之間通過(guò)離心技術(shù)、更特別是多級(jí)離心進(jìn)行分離，
-任選地，通過(guò)微孔過(guò)濾回收和澄清以此方式獲得的可溶性級(jí)分，以便從中除去殘余不溶性物質(zhì)，
-通過(guò)沉淀純化前述可溶性級(jí)分，以便獲得肽分離物和肽濃縮物。
術(shù)語(yǔ)“大約”旨在意指包括指示的值加或減10％、優(yōu)選地其加或減5％的值范圍。例如，“大約10”意指在9與11之間、優(yōu)選地在9.5與10.5之間。
微藻的選擇
優(yōu)選地，小球藻屬微藻選自由普通小球藻(chlorellavulgaris)、根腐小球藻(chlorellasorokiniana)和原殼小球藻(chlorellaprotothecoides)組成的組，并且更具體地是原殼小球藻。
在一個(gè)具體實(shí)施例中，菌株為原殼小球藻(菌株utex250-theculturecollectionofalgaeattheuniversityoftexasataustin-usa[美國(guó)德克薩斯大學(xué)奧斯汀分校藻類培養(yǎng)物保藏中心])。在另一個(gè)實(shí)施例中，該菌株是菌株ccap211/8d–theculturecollectionofalgaeandprotozoa,scotland,uk[英國(guó)蘇格蘭的藻類和原生動(dòng)物培養(yǎng)物保藏中心])。
發(fā)酵條件的選擇
在異養(yǎng)條件下并且在不存在光的情況下的培養(yǎng)通常導(dǎo)致產(chǎn)生具有按干細(xì)胞的重量計(jì)45％至70％的蛋白質(zhì)含量(通過(guò)測(cè)量氮含量n×6.25進(jìn)行評(píng)估)的小球藻生物質(zhì)。
優(yōu)選的是用富含蛋白質(zhì)微藻的生物質(zhì)開(kāi)始，該生物質(zhì)具有例如大于60％的蛋白質(zhì)含量(表達(dá)為n.6.25)。在這種情況下，本申請(qǐng)人公司建議使用其已經(jīng)開(kāi)發(fā)的新穎方法，并且該新穎方法包括：
-第一發(fā)酵步驟，有限的氮，其中用nh3/koh混合物進(jìn)行ph調(diào)節(jié)，并然后
-通過(guò)用單獨(dú)nh3進(jìn)行的ph調(diào)節(jié)來(lái)除去此氮限制的第二步驟。
因此，這些操作條件使得有可能快速獲得具有大于60％的n.6.25、約65％的n.6.25的蛋白質(zhì)含量以及低著色的生物質(zhì)。產(chǎn)率是按固體重量計(jì)從45％至50％，并且生物質(zhì)的最終濃度是在80g/l與120g/l之間。
生物質(zhì)的處理
然后通過(guò)固液分離、通過(guò)正面過(guò)濾或切向過(guò)濾、或通過(guò)另外為本領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知的任何手段收集生物質(zhì)。
任選地，本申請(qǐng)人公司然后建議以這樣一種方式洗滌該生物質(zhì)，該方式是通過(guò)生物質(zhì)的一系列的濃縮(通過(guò)離心)/稀釋來(lái)消除間質(zhì)可溶性化合物。
出于本發(fā)明的目的，術(shù)語(yǔ)“間質(zhì)可溶性化合物”意指發(fā)酵培養(yǎng)基中的所有可溶性有機(jī)污染物，例如水溶性化合物如鹽、殘余葡萄糖、具有2或3的聚合度(或dp)的寡糖、或肽。
然后將以此方式純化了其間質(zhì)可溶性化合物的此生物質(zhì)優(yōu)先調(diào)節(jié)至按重量計(jì)在15％與30％之間的固體含量，優(yōu)選調(diào)節(jié)至在20％與30％之間的固體含量。
生物質(zhì)的熱透化
在50℃與150℃之間、優(yōu)選在約80℃與150℃之間的溫度下進(jìn)行熱處理，持續(xù)約10秒與約5分鐘之間的時(shí)間、優(yōu)選地持續(xù)約5秒與約5分鐘之間的時(shí)間、優(yōu)選地持續(xù)約10秒與約1分鐘之間的時(shí)間。在優(yōu)選的實(shí)施例中，該熱處理在約140℃的溫度下進(jìn)行約10秒。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施例中，該熱處理在約85℃的溫度下進(jìn)行約1分鐘。
此處理使得有可能允許細(xì)胞內(nèi)組分?jǐn)U散進(jìn)反應(yīng)介質(zhì)。
最后，這些步驟結(jié)束時(shí)，將該生物質(zhì)優(yōu)選地冷卻至低于40℃的溫度，或甚至在約4℃下冷凍。
不希望受具體理論束縛，本申請(qǐng)人公司認(rèn)為，在這些操作條件下進(jìn)行的熱處理可以因此充當(dāng)細(xì)胞膜弱化方法，該方法允許自發(fā)釋放細(xì)胞內(nèi)區(qū)室的可溶性組分，或甚至釋放細(xì)胞外基質(zhì)。
除了離子物質(zhì)，有機(jī)物質(zhì)例如碳水化合物(主要是dp1和dp2)、肽和多肽也從細(xì)胞排出。
相反地，脂質(zhì)和疏水有機(jī)化合物保留在細(xì)胞中，由此清晰地證明，細(xì)胞被透化并且未被裂解或破壞。
因此，根據(jù)本發(fā)明的方法不導(dǎo)致乳液形成，而是的確形成水性懸浮液。
所有這些可溶性物質(zhì)通過(guò)經(jīng)透化的細(xì)胞膜的釋放類似于透析類型的自由擴(kuò)散的過(guò)程。
因此，時(shí)滯可能是必需的以便允許在透化細(xì)胞膜的熱處理后充分的擴(kuò)散。
在文獻(xiàn)中，用于脈沖場(chǎng)透化酵母細(xì)胞膜(為了從其提取蛋白質(zhì))的方法需要從4h至6h(ganeva等人，2003，analyticalbiochemistry[分析生物化學(xué)]，315，77-84)。
根據(jù)本發(fā)明，使用在約5秒與約5分鐘之間的短得多的反應(yīng)時(shí)間。
經(jīng)透化的生物質(zhì)和可溶性級(jí)分的分離
然后通過(guò)離心技術(shù)、更特別是多級(jí)離心在如此經(jīng)透化的生物質(zhì)與可溶性級(jí)分之間進(jìn)行分離。
必要的話，如此獲得的可溶性級(jí)分可以通過(guò)微孔過(guò)濾來(lái)澄清，以便使其不含殘余不溶性物質(zhì)，并且取決于其固體含量，通過(guò)蒸發(fā)或通過(guò)本領(lǐng)域普通技術(shù)人員另外已知的任何其他手段的濃縮可以在接著的純化之前進(jìn)行。
所得可溶性級(jí)分最后基本上由蛋白質(zhì)(50％-80％w/w)和碳水化合物(5％-25％w/w)構(gòu)成。
殘余生物質(zhì)的升級(jí)
可溶性物質(zhì)已經(jīng)從其分離的殘余生物質(zhì)可以作為其營(yíng)養(yǎng)分布被重新校準(zhǔn)的整個(gè)成分經(jīng)受升級(jí)。
確切地，蛋白質(zhì)含量降低-因?yàn)樗徊糠值匾噪牡男问綂A帶在可溶性物質(zhì)中-并且這有利地重新平衡了碳水化合物和脂質(zhì)級(jí)分的平衡。
通過(guò)離心分離之后的殘余生物質(zhì)可以“還被碾磨”(根據(jù)希望的應(yīng)用特性)，優(yōu)先通過(guò)機(jī)械碾磨。
常規(guī)地，將生物質(zhì)穩(wěn)定(ph調(diào)節(jié)(約7)，添加抗氧化劑等)，并且然后在通過(guò)霧化干燥之前進(jìn)行熱處理(巴氏殺菌，出于細(xì)菌控制的目的)。通過(guò)蒸發(fā)濃縮的步驟可以在該熱處理之前(與干燥偶聯(lián)的優(yōu)化)。
通過(guò)沉淀的蛋白質(zhì)分離物的純化
本發(fā)明的方法在此通過(guò)經(jīng)由改變培養(yǎng)基的特性的沉淀導(dǎo)致感興趣的肽的分離。
因此，本申請(qǐng)人公司建議如以下進(jìn)行：
-通過(guò)改變培養(yǎng)基的物理化學(xué)特性促進(jìn)所有的或一部分肽級(jí)分的沉淀。
如前述步驟中描述的獲得的粗可溶性物質(zhì)的冷卻引發(fā)一部分的可溶性肽沉淀的現(xiàn)象。
觀察到沉淀對(duì)較高分子量具有相當(dāng)選擇性。冷卻溫度低于10℃，優(yōu)選地低于4℃。
某些操作條件使得有可能促進(jìn)此現(xiàn)象：除了溫度，ph必須在2.5與6.5之間并優(yōu)選地接近phi，即在3與5之間。
類似地，培養(yǎng)基的離子強(qiáng)度可以適配為促進(jìn)沉淀。因此，通過(guò)大大降低離子強(qiáng)度，“鹽溶”現(xiàn)象可能被減弱，并且蛋白質(zhì)的溶解度因此可以降低(通過(guò)降低溶劑化層)。
因此，在沉淀之前可以添加脫礦質(zhì)操作。這在陽(yáng)離子和陰離子樹(shù)脂上進(jìn)行，透析、過(guò)濾或通過(guò)本領(lǐng)域普通技術(shù)人員另外已知的任何手段進(jìn)行。
相反地，通過(guò)大大增加離子強(qiáng)度，經(jīng)由“鹽析”現(xiàn)象可利用的水降低，并且以此方式蛋白質(zhì)具有沉淀的傾向。該方法不是優(yōu)選的，因此對(duì)于如此提取的蛋白質(zhì)分離物而言，然后顯著的脫礦質(zhì)將是必需的。
在調(diào)制溶劑化層的同一視角下，可以通過(guò)添加溶劑(如乙醇)來(lái)降低培養(yǎng)基的極性(其中培養(yǎng)基脫水)，這將使得有可能通過(guò)大大降低其溶解度而產(chǎn)生更定量的蛋白質(zhì)級(jí)分的沉淀。
-通過(guò)回收沉淀的級(jí)分，該級(jí)分然后任選地在干燥之前濃縮。
該沉淀的級(jí)分的分離通過(guò)簡(jiǎn)單的傾析和重相的回收或任選地通過(guò)在最佳溫度條件下的離心來(lái)進(jìn)行。
可以任選地在干燥之前重新調(diào)節(jié)ph。
通過(guò)霧化、冷凍干燥或通過(guò)本領(lǐng)域普通技術(shù)人員另外已知的任何其他手段進(jìn)行干燥。
在干燥之前，通過(guò)蒸發(fā)濃縮的步驟的結(jié)合可以使得有可能在能量方面優(yōu)化操作。如果使用溶劑如乙醇來(lái)進(jìn)行其再循環(huán)，則其可以是尤其合理的。
利用這些方法使得有可能從殘余的鹽和糖中純化具有高含量的肽和多肽的級(jí)分。
然后以按重量計(jì)大于90％獲得可溶性蛋白質(zhì)分離物。
殘余物的升級(jí)
當(dāng)分離物已經(jīng)被如此提取時(shí)，可溶性相(分離之后的輕相)可以原樣升級(jí)為蛋白質(zhì)濃縮物(取決于其殘余的蛋白質(zhì)含量)或可以經(jīng)受新的純化過(guò)程以從其萃取殘余肽。
當(dāng)沉淀是部分的(例如在水相中部分沉淀)時(shí)，這可能取決于實(shí)驗(yàn)條件而是尤其合理的。在這種情況下，可以通過(guò)以與對(duì)于蛋白質(zhì)分離物描述的相同的方式改變物理化學(xué)環(huán)境來(lái)提取通常具有較低分子量(更可溶)的殘余肽。
例如，可以在此階段進(jìn)行溶劑如乙醇的結(jié)合，以通過(guò)大大降低其溶解度而產(chǎn)生此殘余蛋白質(zhì)級(jí)分的沉淀。
如果殘余物被預(yù)先脫水，則溶劑的作用將更為有效。這可以進(jìn)行到某一固體含量(通過(guò)蒸發(fā))或進(jìn)行到完全干燥(例如通過(guò)霧化)。
在沉淀之后，此級(jí)分的ph可以任選地再調(diào)節(jié)，并且然后在通過(guò)霧化、冷凍干燥或通過(guò)本領(lǐng)域普通技術(shù)人員另外已知的任何手段干燥之前，任選地進(jìn)行通過(guò)蒸發(fā)的濃縮(這可以允許溶劑的再循環(huán))。
從以下實(shí)例將更清楚地理解本發(fā)明，所述實(shí)例旨在是說(shuō)明性的，并且是非限制性的。
實(shí)例
實(shí)例1.：具有高蛋白質(zhì)含量的原殼小球藻的生產(chǎn)
所用菌株是原殼小球藻(菌株ccap211/8d-英國(guó)蘇格蘭的藻類和原生動(dòng)物培養(yǎng)物保藏中心)。
預(yù)培養(yǎng)：
-在500ml錐形瓶中150ml培養(yǎng)基；
-該培養(yǎng)基的組成：40g/l葡萄糖+10g/l酵母提取物。
在以下條件下進(jìn)行培育：
-時(shí)間：72h；
-溫度：28℃；
-振蕩：110rpm(伊孚森莫特頓(inforsmultitron)培育器)。
分批并然后分批補(bǔ)料模式的培養(yǎng)
制備和初始分批培養(yǎng)基
-制備并過(guò)濾koh(在400g/l(41％))/nh3(在20％v/v(59％))的混合物；
-以121℃/20min滅菌20l發(fā)酵罐；
-用2個(gè)500ml的錐形瓶的預(yù)培養(yǎng)物接種(15的od600nm)；
-用20％v/vnh3使達(dá)到ph4.5；
-300rpm的起始振蕩速度；
-通風(fēng)：20l/min的空氣；
-po2調(diào)節(jié)為30％；
進(jìn)料
-葡萄糖：500g/l
-硫酸銨：5g/l
-磷酸氫二銨：20g/l
-磷酸：16g/l
-七水硫酸鎂：12g/l
-硫酸鐵：170mg/l
-硝酸鈣：610mg/l
-微量元素的溶液：45ml/l
-維生素的溶液：4.5ml/l
重要的是注意到銨鹽、鎂鹽和磷酸的原料被開(kāi)發(fā)以便限制發(fā)酵培養(yǎng)基的鹽含量并被優(yōu)化以便維持最終脫色的生物質(zhì)的n.6.25含量。
發(fā)酵程序
-在接種之前提供20g/l的當(dāng)量
-當(dāng)葡萄糖濃度是0g/l時(shí)，以指數(shù)分布形式開(kāi)始進(jìn)料(μ＝0.07h-1)；
-用41％koh/59％nh3混合物調(diào)節(jié)ph為5.2
-當(dāng)2kg的葡萄糖已經(jīng)被微藻消耗時(shí)，轉(zhuǎn)化系統(tǒng)至用單獨(dú)的nh3的ph調(diào)節(jié)。
結(jié)果：
此發(fā)酵程序使得有可能獲得具有超過(guò)65％蛋白質(zhì)(表達(dá)為n.6.25)的生物質(zhì)。
實(shí)例2.原殼小球藻生物質(zhì)的熱透化和通過(guò)沉淀回收可溶性級(jí)分
根據(jù)實(shí)例1生產(chǎn)的生物質(zhì)以105g/l的細(xì)胞固體含量收獲，其中純度為80％(純度由生物質(zhì)的固體含量與總固體含量的比例定義)。
該生物質(zhì)然后：
-通過(guò)在線稀釋[1:1](v水v必須(vwatervmust))洗滌并濃縮并在alfalavalfeux510板式離心機(jī)上離心，并使達(dá)到220g/l的固體含量和93％的純度(純度由生物質(zhì)的固體含量與總固體含量的比例定義)，并然后
-用氫氧化鉀將ph調(diào)節(jié)至7，
-在間接蒸汽板式換熱器上用htst進(jìn)行熱處理使生物質(zhì)達(dá)到85℃、通過(guò)保溫維持1分鐘，接著在二醇-水板式換熱器上冷卻至4℃。
以中等規(guī)模進(jìn)行該熱處理以便限制生物質(zhì)的部分溶解，其純度降低至68％。
根據(jù)定義，細(xì)胞外介質(zhì)中可溶性物質(zhì)的鹽析導(dǎo)致該級(jí)分中細(xì)胞固體相對(duì)于總固體含量的降低。
在這個(gè)階段，生物質(zhì)的組成如下：
-總氨基酸：48.73％
-總糖：27.02％
-總脂肪酸：15.10％
-灰分和其他：9.15％
粗可溶性物質(zhì)的分離
通過(guò)生物質(zhì)的熱透化源于鹽析的可溶性物質(zhì)的分離通過(guò)離心分離進(jìn)行。
為了優(yōu)化分離產(chǎn)率和質(zhì)量，在第二階段在線地進(jìn)行輕微的稀釋[0.5:1](v水v必須)(以具有串聯(lián)的兩個(gè)alfalavalfeux510離心機(jī)的配置)，其中將來(lái)自該第二階段的上清液再循環(huán)到第一階段。因此回收來(lái)自該第一階段的上清液，并濃縮澄清的可溶性物質(zhì)。
此“粗”可溶性物質(zhì)具有以下組成：
-總氨基酸：77.3％
-總糖：17.6％
-灰分和其他：5.1％
蛋白質(zhì)分離物的純化
分離后取的可溶性物質(zhì)的樣品用于針對(duì)獲得蛋白質(zhì)分離物的純化。
為了選擇性沉淀肽級(jí)分，在攪拌下將750g的具有9.5％固體含量的粗可溶性物質(zhì)置于夾套反應(yīng)器中。
用磷酸將該粗可溶性物質(zhì)的ph調(diào)節(jié)至4.5。
在停止攪拌之后，將溫度降低至4℃。
將這些條件維持8小時(shí)。
因此進(jìn)行富含較高分子量肽的重相的傾析。
然后通過(guò)在分液漏斗中簡(jiǎn)單相分離提取重相，其中質(zhì)量產(chǎn)率為28％并具有37.2％的固體含量。
將此提取物凍干至97％的固體含量。
此分離物的組成詳細(xì)如下：
-總氨基酸：95.9％
-總糖：2.44％
-灰分和其他：1.66％
該蛋白質(zhì)分離物的氨基酸譜分布如下：
-谷氨酸：49.9％
-精氨酸：47.21％
-其他：2.89％
因此，該分離物的特征在于約95％的基本上由精氨酸和谷氨酸形成的氨基酸豐度(基于總氨基酸的分布分析)。
殘余物的純化
分離物的沉淀和分離后的輕相可以經(jīng)受純化，以便濃縮尚未沉淀的蛋白質(zhì)級(jí)分(具有較低分子量)。
在分離之后(具有72％的質(zhì)量產(chǎn)率)，最初具有8.9％固體含量的此相通過(guò)蒸發(fā)濃縮(15毫巴，-43℃，在buchir-215實(shí)驗(yàn)室旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上)至45.4％的固體含量，以便使培養(yǎng)基部分脫水以便隨后促進(jìn)乙醇的作用。
在此階段，該濃縮物具有以下組成：
-總氨基酸：68.5％
-總糖：23.46％
-灰分和其他：8.04％
為了沉淀蛋白質(zhì)級(jí)分，進(jìn)行通過(guò)添加乙醇的脫水。
添加一體積的乙醇(每體積濃縮物)，并且由培養(yǎng)基中溶解度的損失導(dǎo)致的蛋白質(zhì)聚集幾乎瞬間發(fā)生。
通過(guò)以4000g離心10分鐘回收粒料(beckmancoulteravantij-20xp)。
然后將其在真空烘箱中持續(xù)24小時(shí)干燥至92.3％的固體含量。
如此獲得的提取物的組成詳細(xì)如下：
-總氨基酸：73.19％
-總糖：20.45％
-灰分和其他：6.36％
然后可將此提取物作為蛋白質(zhì)濃縮物升級(jí)。
實(shí)例3.在溶解之后殘余生物質(zhì)的處理
將在實(shí)例2中獲得的富含蛋白質(zhì)的粗不溶性物質(zhì)從殘余生物質(zhì)分離，該殘余生物質(zhì)可以用允許其升級(jí)的方法進(jìn)行處理。
將提取的生物質(zhì)(處于22％的細(xì)胞固體含量)在水平珠磨機(jī)模塊(netzschlme500-0.6mm硅酸鋯珠)上碾磨至85％的碾磨度。
然后用50％氫氧化鉀將碾磨的細(xì)胞材料調(diào)節(jié)至ph7。
在spx強(qiáng)制循環(huán)蒸發(fā)器上的濃縮通過(guò)環(huán)連續(xù)進(jìn)料進(jìn)行，其中進(jìn)入在真空下的具有維持在40℃下的溫度的閃蒸器之前將溫度調(diào)節(jié)至75℃，在該閃蒸器中發(fā)生蒸發(fā)。
將濃縮的生物質(zhì)從該閃蒸器中連續(xù)地取出至spxuht模塊，以便用在70℃下預(yù)熱、接著在140℃下以約10秒的規(guī)模直接注入蒸汽并在真空下快速冷卻至40℃進(jìn)行熱處理。
然后將生物質(zhì)在geafiltermatfmd200霧化器上霧化至95％的固體含量。
如此獲得的生物質(zhì)具有以下組成：
-總氨基酸：27.1％
-總脂肪酸：27.1％
-總糖：35.8％
-灰分和其他：10％
如此獲得的生物質(zhì)具有的優(yōu)點(diǎn)為具有在碳水化合物、蛋白質(zhì)和脂質(zhì)級(jí)分中的平衡的營(yíng)養(yǎng)分布。如下所示，氨基酸譜此外通過(guò)選擇性上游除去富含精氨酸和谷氨酸的可溶性級(jí)分而重新平衡。
該生物質(zhì)中的氨基酸分布如下：
-天冬氨酸：6.05
-蘇氨酸：3.91％
-絲氨酸：3.56％
-谷氨酸：23.84％
-甘氨酸：3.56％
-丙氨酸：5.69％
-纈氨酸：4.27％
-異亮氨酸：2.31％
-亮氨酸：5.87％
-酪氨酸：2.49％
-苯丙氨酸：3.20％
-賴氨酸：3.74％
-組氨酸：1.60％
-精氨酸：25.98％
-脯氨酸：3.91％