本發(fā)明屬于生物工程領(lǐng)域，更具體的，本發(fā)明公開了一種基于人RNA聚合酶I(hPolI)系統(tǒng)的腸道病毒68型微復(fù)制子的構(gòu)建及應(yīng)用。

背景技術(shù)：

腸道病毒68型(EV-D68)屬于小RNA病毒科(Picornaradae)腸道病毒屬(Enterovirus)的成員，歸屬于人類腸道病毒D組。EV-D68基因組為單股正鏈RNA，長度約為7.5Kb，由單一的開放讀碼框(ORF)及其兩側(cè)非翻譯區(qū)(5’UTR和3’UTR)構(gòu)成。EV-D68基因組編碼一條多聚蛋白，該蛋白被病毒自身編碼的蛋白酶水解為Pl、P2和P3三種前體蛋白，其中P1被進(jìn)一步加工成病毒的結(jié)構(gòu)蛋白VPl～VP4；P2和P3被加工成7個(gè)非結(jié)構(gòu)蛋白。

自1962年首次發(fā)現(xiàn)后，該病毒的分離鑒定罕有報(bào)道。1970-2005年間，在美國只有26例臨床分離株被報(bào)道，占所有報(bào)道的EV家族病例的0.1％，流行病學(xué)數(shù)據(jù)極其有限。然而近年來，日本(2005-2010)，中國(2006-2012)，泰國(2006-2011)，意大利(2008-2009)，英國(2008-2010)，肯尼亞(2008-2011)，法國(2009)，菲律賓(2009-2011)，美國(2009-2010)，新西蘭(2010)，荷蘭(2010)都有EV-D68爆發(fā)，而且出現(xiàn)嚴(yán)重的呼吸困難，四肢癱瘓為主要癥狀的重癥患者，甚至發(fā)現(xiàn)死亡的病例。患者的主要年齡群集中在一歲到四歲的兒童，但有近四分之一的感染者為成年人。因此推斷，隨著檢測數(shù)據(jù)的增加，EV-D68最終可能被認(rèn)定為全年齡組的呼吸系統(tǒng)病原體。因此，EV-D68引起國際衛(wèi)生組織的廣泛關(guān)注。但是，目前仍缺乏特效的治療手段。因此繼續(xù)深入開展相關(guān)研究，如病毒的分子生物學(xué)特征、復(fù)制機(jī)制、致病機(jī)理，將有利于人類更加全面透徹的了解EV-D68，從而設(shè)計(jì)有效的藥物、準(zhǔn)確的診斷方法以及良好的疫苗提供理論依據(jù)。

隨著分子生物學(xué)的不斷發(fā)展，科學(xué)家可以通過反向遺傳學(xué)的手段定向改造病毒，為深入開展相關(guān)病毒的研究提供了良好的工具。

病毒微復(fù)制子是將部分的病毒基因組替換為報(bào)告基因的病毒cDNA結(jié)構(gòu)。由于微復(fù)制子結(jié)構(gòu)簡單且為DNA形式，可方便的用于對(duì)RNA病毒順式作用元件和反式作用蛋白質(zhì)的分析，也可用于抗病毒藥物的篩選。微復(fù)制子本身安全無危害，不需要特殊的實(shí)驗(yàn)場所和設(shè)備，為不同實(shí)驗(yàn)室研究病毒復(fù)制相關(guān)機(jī)制提供了一個(gè)工具。

目前，單鏈正股RNA病毒反向遺傳系統(tǒng)一般基于T7 RNA聚合酶來實(shí)現(xiàn)，將病毒cDNA克隆于T7啟動(dòng)子下游，通過體外轉(zhuǎn)錄的方法，獲得病毒的RNA，再將病毒RNA轉(zhuǎn)染細(xì)胞以獲得重組病毒。這種方法費(fèi)時(shí)費(fèi)力，并且在操作過程中有對(duì)cDNA體外轉(zhuǎn)錄、RNA提純的過程，易被RNA酶污染，造成實(shí)驗(yàn)失敗。pHH21質(zhì)粒上帶有人RNA聚合酶I(hPolI)啟動(dòng)子，可以在細(xì)胞中直接誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄，省去了體外轉(zhuǎn)錄的過程，大大節(jié)省了操作步驟。

目前尚未有對(duì)EV-D68微復(fù)制子構(gòu)建的報(bào)道。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

為了解決現(xiàn)有技術(shù)中存在的問題，本發(fā)明提供一種基于Pol1系統(tǒng)的腸道病毒68型微復(fù)制子體系及其構(gòu)建方法及其應(yīng)用，克服現(xiàn)有技術(shù)中傳統(tǒng)的病毒感染系統(tǒng)時(shí)間長，病毒滴度檢測繁瑣，精確度低的問題。

本發(fā)明的技術(shù)方案為：一種基于Pol1系統(tǒng)的腸道病毒68型微復(fù)制子體系的構(gòu)建方法，包括以下步驟：

(1)合成EV-D68Fermon病毒株的5’UTR cDNA；所述Fermon的5’UTR核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示；

(2)以步驟(1)得到的cDNA為模板，以SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3為引物，PCR擴(kuò)增得到腸道病毒68型毒株Fermon的5’UTR片段；

(3)以實(shí)驗(yàn)室保存pGL3-basic質(zhì)粒為模板，以SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:5為引物，PCR擴(kuò)增得到螢火蟲熒光素酶(Firefly Luciferase，f-Luc)基因片段；

(4)以步驟(2)得到的PCR產(chǎn)物和步驟(3)得到的PCR產(chǎn)物為模板，以SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:7為引物進(jìn)行overlapping-PCR擴(kuò)增；回收混合PCR產(chǎn)物；

(5)以步驟(4)得到的PCR產(chǎn)物為模板，以SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:8為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增；回收PCR產(chǎn)物；

(6)Pst1和Not1雙酶切經(jīng)步驟(5)得到的PCR產(chǎn)物和載體，連接，轉(zhuǎn)化，篩選陽性克?。?/p>

(7)以步驟(6)得到的陽性克隆為模板，以SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:10為引物，PCR擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物經(jīng)DpnI酶37℃處理30分鐘，轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌DH5α，篩選獲得無BsmB1酶切位點(diǎn)的f-Luc微復(fù)制子片段；

(8)以步驟(7)得到的無BsmB1酶切位點(diǎn)的f-Luc微復(fù)制子為模板，以SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:12為引物，PCR擴(kuò)增得到帶有BsmB1酶切位點(diǎn)的f-Luc微復(fù)制子；

(9)BsmB1酶切步驟(8)得到的PCR產(chǎn)物和載體，連接，轉(zhuǎn)化，篩選陽性克隆，即為RNA聚合酶I系統(tǒng)的腸道病毒68型f-Luc微復(fù)制子：pHH21-EV-D68-f-Luc；

(10)以步驟(9)得到的pHH21-EV-D68-f-Luc為模板，以SEQ ID NO:13和SEQ ID NO:14為引物，PCR擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物經(jīng)DpnI酶37℃處理30分鐘，轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌DH5α，得到5’UTR 108-207堿基缺失的EV-D68微復(fù)制子突變體：pHH21-EV-D68_Δ180-207-f-Luc。

在其中一個(gè)實(shí)例中，步驟(4)中所述overlapping-PCR的程序?yàn)?5℃30s，53℃30s，72℃1.5min，五個(gè)循環(huán)，之后95℃30s，53℃30s，72℃1min，25個(gè)循環(huán)。

在其中一個(gè)實(shí)例中，步驟(6)所述載體為VR1012載體。

在其中一個(gè)實(shí)例中，步驟(9)所述載體為pHH21載體。

在其中一個(gè)實(shí)例中，步驟(7)和(10)中所述PCR的程序?yàn)?5℃20s，55℃20s，72℃5min，18個(gè)循環(huán)。

一種基于RNA聚合酶I系統(tǒng)的腸道病毒68型微復(fù)制子體系的構(gòu)建方法得到的腸道病毒68型微復(fù)制子體系。

本發(fā)明還提供了包含上述微復(fù)制子的宿主細(xì)胞，所述宿主細(xì)胞為大腸埃希氏菌(Escherichia coli)DH5α；

本發(fā)明的有益效果是：本發(fā)明合成腸道病毒68型毒株Fermon5，-UTR基因，采用重疊PCR技術(shù)，建立了帶有螢火蟲熒光素酶f-Luc報(bào)告基因的EV D68微復(fù)制子報(bào)告系統(tǒng)，可以定性和定量檢測螢火蟲熒光素酶表達(dá)情況以模擬EV D68復(fù)制和蛋白表達(dá)；獲得的微復(fù)制子在轉(zhuǎn)染細(xì)胞24小時(shí)就可以檢測到明顯的報(bào)告熒光，是一個(gè)穩(wěn)定、安全的熒光報(bào)告體系；獲得的微復(fù)制子不會(huì)產(chǎn)生完整的病毒，可以在普通實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行實(shí)驗(yàn)檢測，為針對(duì)EV D68病毒的復(fù)制機(jī)制研究以及疫苗、藥物的研發(fā)提供了一個(gè)簡單、快速、安全、靈敏的檢測平臺(tái)。

本發(fā)明是基于人RNA聚合酶I(hPolI)系統(tǒng)來實(shí)現(xiàn)的，hPolI是人的RNA聚合酶I，通過這個(gè)系統(tǒng)可以在細(xì)胞中直接將DNA轉(zhuǎn)錄為RNA，從而使得病毒RNA在細(xì)胞內(nèi)直接產(chǎn)生，無需體外轉(zhuǎn)錄先合成病毒RNA,再將病毒RNA轉(zhuǎn)染細(xì)胞，節(jié)省實(shí)驗(yàn)步驟和試劑，避免RNA污染，極大簡化實(shí)驗(yàn)流程。本發(fā)明使用的pHH21質(zhì)粒帶有hPolI序列以及mTer序列，hPolI為人的RNA聚合酶I啟動(dòng)子，用來啟動(dòng)微復(fù)制子的轉(zhuǎn)錄；mTer為鼠源終止子，是給予RNA聚合酶I轉(zhuǎn)錄終止信號(hào)的DNA序列。

附圖說明

圖1中A為EV-D68基因組結(jié)構(gòu)示意圖，B為微復(fù)制子結(jié)構(gòu)示意圖，C為微復(fù)制子在pHH21質(zhì)粒中位置示意圖(hPol1為人Pol1啟動(dòng)子，mTer為45S RNA終止子)；

圖2為微復(fù)制子全長PCR結(jié)果；

圖3中A為轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞24h單報(bào)告檢測結(jié)果，B為轉(zhuǎn)染RD細(xì)胞24h單報(bào)告檢測結(jié)果；

圖4中A和B分別為微復(fù)制子和微復(fù)制子突變體的RNA結(jié)構(gòu)預(yù)測圖(mfold軟件預(yù)測)。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)一步說明。

以下實(shí)施例僅用于說明本說明，但不用來限制本發(fā)明的包含范圍，所屬領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該明白，在本發(fā)明的技術(shù)方案的基礎(chǔ)上，本領(lǐng)域技術(shù)人員不需要付出創(chuàng)造性勞動(dòng)即可做出的各種修改或變形人在本發(fā)明的保護(hù)范圍內(nèi)。若未特別指明，實(shí)施例中所用的技術(shù)手段為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的常規(guī)手段，所用原料均為市售商品。

1材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1細(xì)胞

所用細(xì)胞為人橫紋肌肉瘤細(xì)胞(rhabdomyosarcoma cells，RD，ATCC No.CCL-136)，人胚腎細(xì)胞(Human Embryonic Kidney 293T cells，293T，ATCC No.CRL-3216)。

1.1.2實(shí)驗(yàn)試劑

所用主要試劑為DNA膠回收試劑盒和質(zhì)粒提取試劑盒(QIAGEN公司)；高保真酶TransStart Fastpfu DNA Polymerase、Dpn1酶(Transgen公司)；限制性內(nèi)切酶、轉(zhuǎn)染試劑、細(xì)胞培養(yǎng)基(Thermo公司)；血清(Gbico公司)；基因與引物合成以及測序由蘇州GENEWIZ公司完成。

2實(shí)施例

實(shí)施例1 EV D68F-Luc微復(fù)制子的構(gòu)建

1、擴(kuò)增引物的設(shè)計(jì)與合成

從genebank中選取EV D68Fermon毒株的基因組序列，根據(jù)基因組5’UTR序列，設(shè)計(jì)EV D68Fermon的保守引物5’UTR F2、5’UTR R和5’UTR F1，根據(jù)f-Luc基因序列和Fermon基因組序列，設(shè)計(jì)f-Luc的引物f-Luc F和f-Luc R1、f-Luc R2、f-Luc R3，由GENEWIZ公司合成。具體引物序列如下：

5’UTR F1：5’-aaaactgcagttaatacgactcactataggttaaaacagctctg-3’(SEQ ID NO:6)

5’UTR F2:5’-gactcactataggttaaaacagctctggggttgttcccac tc-3’(SEQ ID NO:2)

5’UTR R:：5’-gtttttggcgtcttccattgttataaataagtttaaac-3’(SEQ ID NO:3)

f-Luc F:5’-gtttaaacttatttataacaatggaagacgccaaaaac-3’(SEQ ID NO:4)

f-Luc R1:5’-gaaagtaactgtaacttgggtttcaattagagttatttacacggcgatctttccgcc-3’(SEQ ID NO:5)

f-Luc R2:5’-ggtccccaagtgaccaaaatttacctctaagtgaaagtaactgtaacttgggtttc-3’(SEQ ID NO:7)

f-Luc R3:5’-ttttccttttgcggccgctttttttttttttttttttttttttggtccccaagtgaccaaaatttac-3’(SEQ ID NO:8)

G394C F：5’-ctcatggtgaaaaccatcagacgctagacatgaac-3’(SEQ ID NO:9)

G394C R：5’-gttcatgtctagcgtctgatggttttcaccatgag-3’(SEQ ID NO:10)

pHH21F：5’-atcggtctcctattttaaaacagctctggggttg-3’(SEQ ID NO:11)

pHH21R：5’-atcgcgtctccgggatttttttttttttttttttttttttggtccccaagtgaccaaaatttacc-3’(SEQ ID NO:12)

5’UTR 180-207F：5’-gagcaagcacttctgtctacggttgaaaacaactta-3’(SEQ ID NO:13)

5’UTR 180-207R：5’-taagttgttttcaaccgtagacagaagtgcttgctc-3’(SEQ ID NO:14)

2、PCR擴(kuò)增與克隆

得到公司合成的病毒基因組5’UTR cDNA后，PCR擴(kuò)增的引物為正向引物5’UTR F2和反向引物5’UTR R，按照TransStart Fastpfu DNA Polymerase(Transgen公司)說明書構(gòu)建50μL反應(yīng)體系，擴(kuò)增得到EV D68的5’UTR片段。

以實(shí)驗(yàn)室保存pcDNA3.1-f-Luc質(zhì)粒為模板，f-Luc F和f-Luc R1為引物，擴(kuò)增得到f-Luc片段，再用f-LUC F和f-Luc R2為引物，擴(kuò)增得到PCR產(chǎn)物，最后以F-Luc F和f-Luc R3為引物，擴(kuò)增得到f-Luc-3’UTR片段。

以得到的5’UTR片段和f-Luc-3’UTR片段，5’UTR F1和f-Luc R3為引物，overlapping-PCR擴(kuò)增得到完整的f-Luc微復(fù)制子片段(5’UTR-f-Luc-3’UTR-polyA)(如圖2所示)。

將f-Luc微復(fù)制子片段與VR1012質(zhì)粒進(jìn)行Pst1和Not1雙酶切，酶切片段回收后，進(jìn)行T4連接獲得VR1012-f-Luc微復(fù)制子。

以VR1012-f-Luc微復(fù)制子為模板，利用G394C F和G394C R引物進(jìn)行點(diǎn)突變，使5’UTR區(qū)的BsmB1酶切位點(diǎn)消失。

以突變后的VR1012-f-Luc微為模板，pHH21 F和pHH21 R為引物，擴(kuò)增得到帶有BsmB1酶切位點(diǎn)的f-Luc微復(fù)制子片段。

將帶有BsmB1酶切位點(diǎn)的f-Luc微復(fù)制子片段與pHH21質(zhì)粒進(jìn)行BsmB1酶切，酶切片段回收，連接，轉(zhuǎn)化，獲得EV-D68微復(fù)制子：pHH21-EV-D68-f-Luc(如圖1所示)。

實(shí)施例2 EV-D68微復(fù)制子突變體構(gòu)建。

經(jīng)mfold軟件分析發(fā)現(xiàn)5UTR 180-207缺失會(huì)使RNA結(jié)構(gòu)發(fā)生變化(如圖4所示)，因此突變5UTR 180-207區(qū)域可能會(huì)使5UTR功能發(fā)生變化。以pHH21-EV-D68-f-Luc為模板，5UTR 180-207 F(SEQ ID NO:13)和5UTR 180-207 R(SEQ ID NO:14)為引物，PCR反應(yīng)，條件如下：95℃20s，55℃20s，72℃5min，18個(gè)循環(huán)。PCR產(chǎn)物經(jīng)DpnI酶37℃處理30分鐘，轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌DH5α，獲得5’UTR 108-207堿基缺失的EV-D68微復(fù)制子突變體：pHH21-EV-D68_Δ180-207-f-Luc。

實(shí)施例3 EV-D68微復(fù)制子活性檢測

使用PEI轉(zhuǎn)染試劑將1μg pHH21、EV-D68微復(fù)制子和EV-D68微復(fù)制子突變體分別轉(zhuǎn)染細(xì)胞。轉(zhuǎn)染24或48小時(shí)后，收集轉(zhuǎn)染細(xì)胞，用PBS輕輕漂洗兩次，每孔加入500μLPBS吹起細(xì)胞并收集到離心管中。取100μL上清液加入96孔板。按照Luciferase Assay System(Promeg,Cat No:N1120)說明書操作步驟，使用LB960多功能檢測儀檢測熒光素酶數(shù)值，分析firefly luciferase數(shù)據(jù)，獲得報(bào)告基因活化值(如圖3所示)。

實(shí)施例4 EV-D68 5’UTR RNA二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測

使用mfold軟件(網(wǎng)址)對(duì)微復(fù)制子和微復(fù)制子突變體的RNA結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測。

序列表

<110> 天津大學(xué)

<120> 基于RNA 聚合酶I系統(tǒng)的腸道病毒68型微復(fù)制子的構(gòu)建及應(yīng)用

<130>

<160> 14

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 732

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

ttaaaacagc tctggggttg ttcccactca agggcccacg tggcggctag tactctggta 60

tctcggtacc tttgtacgcc tgttttaatt ccctccccaa cgtaacttag aagcttttaa 120

accaaagctc aataggtgga gcgcaaacca gcgctcttat gagcaagcac ttctgtctcc 180

ccggtgtggt tgtatagact gtccccacgg ttgaaaacaa cttatccgtt aaccgctata 240

gtacttcgag aaacctagta ttgccttcgg agtgttgatg cgttgcgctc agcacactaa 300

cccgtgtgta gcttgggtcg atgagtctgg acgtacccca ctggcgacag tggtccaggc 360

tgcgttggcg gcctactcat ggtgaaaacc atgagacgct agacatgaac aaggtgtgaa 420

gagtctattg agctgctata gagtcctccg gcccctgaat gcggctaatc ctaaccatgg 480

agcaagtgct cacaaaccag tgagttactt gtcgtaacgc gcaagtccgt ggcggaaccg 540

actactttgg gtgtccgtgt ttcacttttt acttttatga ctgctaatgg tgacaattta 600

atattgttac catttggctt gtcgaattga tcacataaga tctatagttt tgttcactga 660

tttgctttga aataatctca cctcaaaacc tccagtacat aacatttaaa gagtttaaac 720

ttatttataa ca 732

<210> 2

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

gactcactat aggttaaaac agctctgggg ttgttcccac tc 42

<210> 3

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

gtttttggcg tcttccattg ttataaataa gtttaaac 38

<210> 4

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

gtttaaactt atttataaca atggaagacg ccaaaaac 38

<210> 5

<211> 57

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

gaaagtaact gtaacttggg tttcaattag agttatttac acggcgatct ttccgcc 57

<210> 6

<211> 44

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

aaaactgcag ttaatacgac tcactatagg ttaaaacagc tctg 44

<210> 7

<211> 56

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

ggtccccaag tgaccaaaat ttacctctaa gtgaaagtaa ctgtaacttg ggtttc 56

<210> 8

<211> 67

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

ttttcctttt gcggccgctt tttttttttt tttttttttt tttggtcccc aagtgaccaa 60

aatttac 67

<210> 9

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

ctcatggtga aaaccatcag acgctagaca tgaac 35

<210> 10

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 10

gttcatgtct agcgtctgat ggttttcacc atgag 35

<210> 11

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 11

atcggtctcc tattttaaaa cagctctggg gttg 34

<210> 12

<211> 65

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 12

atcgcgtctc cgggattttt tttttttttt tttttttttt ggtccccaag tgaccaaaat 60

ttacc 65

<210> 13

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 13

gagcaagcac ttctgtctac ggttgaaaac aactta 36

<210> 14

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 14

taagttgttt tcaaccgtag acagaagtgc ttgctc 36