本發(fā)明屬于藥物合成領域，涉及映-三白草酮類衍生物及其制備方法和應用，具體涉及一類映-三白草酮2′衍生物及其制備方法，以及該類化合物在制備抗癌轉(zhuǎn)移藥物中的應用。

背景技術：

近年來，腫瘤的發(fā)生發(fā)展已經(jīng)成為危害人類健康的全球公共衛(wèi)生問題之一，研究發(fā)現(xiàn)腫瘤細胞具有以下十大特征：自給自足生長信號，抗生長信號的不敏感，抵抗細胞死亡，潛力無限的復制能力，持續(xù)的血管生成，組織浸潤和轉(zhuǎn)移，避免免疫摧毀，促進腫瘤的炎癥，細胞能量異常，基因組不穩(wěn)定和突變。其中浸潤和轉(zhuǎn)移是惡性腫瘤發(fā)生和演變過程中最危險的階段，也是其最重要的生物學特征。據(jù)文獻報道，超過90％的癌癥患者都是死于腫瘤轉(zhuǎn)移。因此，國內(nèi)外研究學者致力于通過細胞分子生物學手段對與腫瘤細胞侵襲轉(zhuǎn)移相關的分子機制進行深入研究，例如腫瘤干細胞與腫瘤轉(zhuǎn)移，上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化與腫瘤轉(zhuǎn)移，腫瘤凋亡與腫瘤轉(zhuǎn)移，腫瘤微環(huán)境與腫瘤轉(zhuǎn)移等。

目前，對于腫瘤的治療主要是依靠化學藥物和手術加放化療，但由于藥物自身強大的毒副作用和化療對機體免疫力的損害，很多患者術后會出現(xiàn)腫瘤復發(fā)轉(zhuǎn)移的現(xiàn)象。越來越多的研究表明采用中藥進行術后治療不僅可以減少藥物產(chǎn)生的毒副作用還可以預防腫瘤的復發(fā)和轉(zhuǎn)移，延長患者的生存周期，改善患者的生存質(zhì)量。

映-三白草酮(ent-sauchinone)為從三白草科三白草屬植物三白草中分離得到的一種結構獨特的木脂素，結構式如下：

2015版《中華人民共和國藥典》記載其具有清熱解毒、利尿消腫之功效?，F(xiàn)代藥理研究表明映-三白草酮在保肝、抗炎、神經(jīng)保護等方面都有顯著療效。

技術實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一系列含氮基團取代的映-三白草酮類衍生物，并對這些化合物進行抗腫瘤活性測試和抑制腫瘤細胞遷移活性測試，從而提供具有藥用價值的映-三白草酮類似物新化學實體。

本發(fā)明的目的可通過以下措施來達到：

如式I所示的映-三白草酮類衍生物：

其中，R選自羥基或

R₁選自羥基、取代或未取代的含1個或多個N的5-6元雜環(huán)基團；

R₂選自C₁-C₅烷基、苯基或芐基；

R₃、R₄分別獨立的選自C₁-C₅烷基；

所述的含1個或多個N的5-6元雜環(huán)基團的取代基選自C₁-C₃烷基、苯基、鹵素取代的苯基、吡啶基、嘧啶基、

優(yōu)選的，R₁選取代或未取代的含1個或多個N的5-6元雜環(huán)基團；

其中，R₂選自C₂-C₄烷基或芐基；

R₃、R₄分別獨立的選自C₁-C₃烷基；

所述的含1個或多個N的5-6元雜環(huán)基團的取代基選自C₁-C₃烷基、苯基、氟取代的苯基、吡啶基、嘧啶基、

進一步優(yōu)選的，R₁選取代或未取代的含1個或多個N的5-6元雜環(huán)基團；

其中，R₂選自C₂-C₄烷基或芐基；

R₃、R₄分別獨立的選自C₁-C₂烷基；

含1個或多個N的5-6元雜環(huán)基團選自吡咯烷基嗎啉基取代的含1個或多個N的5-6元雜環(huán)基團選自其中R₅選自C₁-C₃烷基、苯基、氟取代的苯基、吡啶基、嘧啶基、

本發(fā)明中C_1-5烷基包括C_1-5的直鏈烷基、C_3-5的支鏈烷基，具體可以選自甲基、乙基、正丙基、異丙基、正丁基、異丁基、正戊基、異戊基或新戊基。C₂-C₄烷基選自乙基、正丙基、異丙基、正丁基或異丁基。

可以選自乙胺基、丙胺基、異丙胺基、丁胺基、二乙胺基或芐胺基；可以選自二甲氨基、二乙氨基、甲乙氨基。

含1個或多個N的雜環(huán)基團可以選自吡咯烷基、嗎啉基、1-甲基哌嗪基、1-乙基哌嗪基、1-苯基哌嗪基、1-(4-氟苯基)哌嗪基、1-(2-吡啶基)哌嗪基、1-(2-嘧啶基)哌嗪基、1-乙氧羰基哌嗪基。

本發(fā)明所述的映-三白草酮類衍生物具體可以選自：2′肟基-映-三白草酮、2′-亞胺基-氧-4"-氧代丁?；?N-乙基-映-三白草酮、2′-亞胺基-4″-氧代丁?；?N-丙基-映-三白草酮、2′-亞胺基-氧-4″-氧代丁?；?N-異丙基-映-三白草酮、2′-亞胺基-氧-4″-氧代丁?；?N-丁基-映-三白草酮、2′-亞胺基-氧-4″-氧代丁?；?N-芐基-映-三白草酮、2′-亞胺基-氧-4"-氧代丁?；?嗎啉基-映-三白草酮、2′-亞胺基-氧-4″-氧代丁?；?1″′-甲基哌嗪基-映-三白草酮、2′-亞胺基-氧-4″-氧代丁?；?1″′-(2″″-吡啶基)哌嗪基-映-三白草酮、2′-亞胺基-氧-4″-氧代丁?；?1″′-(2″″-嘧啶基)哌嗪基-映-三白草酮、2′-亞胺基-氧-4″-氧代丁?；?1″′-(4″″-氟苯基)哌嗪基-映-三白草酮、2′-亞胺基-氧-4″-氧代丁?；?1″′-苯基哌嗪基-映-三白草酮、2′-亞胺基-氧-4"-氧代丁酰基-吡咯烷基-映-三白草酮、2′-亞胺基-氧-4″-氧代丁?；?1″′-乙基哌嗪基-映-三白草酮、2′-亞胺基-氧-4″-氧代丁?；?1″-乙氧羰基哌嗪基-映-三白草酮、2′-亞胺基-氧-4″-氧代丁?；?N-二乙基-映-三白草酮。

本發(fā)明的另一個目的是提供式I所示映-三白草酮類衍生物的制備方法。

R為羥基時，制備方法為：映-三白草酮與鹽酸羥胺(hydroxylamine hydrochioride)溶于吡啶(pyridine)中加熱回流反應生成2′-肟基-映-三白草酮；其中，所述的映-三白草酮與鹽酸羥胺的物質(zhì)的量之比為1∶1～2，優(yōu)選為1∶1.5。反應以吡啶作為溶劑，反應產(chǎn)率較高，發(fā)明人嘗試用二氯甲烷和4-二甲氨基吡啶代替，但收率較低，且反應過程中會生成大量鹽，沉淀在反應體系中，后處理比較麻煩。

R為R₁為羥基時，制備方法為：(1)、映-三白草酮與鹽酸羥胺溶于吡啶中加熱回流反應生成2′-肟基-映-三白草酮；(2)、2′-肟基-映-三白草酮與丁二酸酐溶于二氯甲烷(DCM)中，以4-二甲氨基吡啶(DMAP)為催化劑，反應得到2′-亞胺基-氧-4″-氧代丁酸-映-三白草酮；其中，所述的映-三白草酮、鹽酸羥胺的物質(zhì)的量之比為1∶1～2，優(yōu)選為1∶1.5；所述的2′-肟基-映-三白草酮與丁二酸酐的物質(zhì)的量之比為1∶1～2，優(yōu)選為1∶1.5～2。

R為R₁不為羥基時，制備方法為：制備方法，包括：(1)、映-三白草酮與鹽酸羥胺溶于吡啶中加熱回流反應生成2′-肟基-映-三白草酮；(2)、2′-肟基-映-三白草酮與丁二酸酐溶于二氯甲烷中，以4-二甲氨基吡啶為催化劑，反應得到2′-亞胺基-氧-4"-氧代丁酸-映-三白草酮；(3)、2′-亞胺基-氧-4"-氧代丁酸-映-三白草酮溶于二氯甲烷，再加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(EDC)和1-羥基苯并三氮唑(HOBT)，使2′-亞胺基-氧-4"-氧代丁酸-映-三白草酮活化生成活性酯后，充分攪拌下加入4-二甲氨基吡啶(DMAP)作為縛酸劑，最后加入R₁H進行反應，得到映-三白草酮類衍生物。反應式為：

其中，R₁選自取代或未取代的含1個或多個N的5-6元雜環(huán)基團；

R₂選自C₁-C₅烷基、苯基或芐基；

R₃、R₄分別獨立的選自C₁-C₅烷基；

所述的含1個或多個N的5-6元雜環(huán)基團的取代基選自C₁-C₃烷基、苯基、鹵素取代的苯基、吡啶基、嘧啶基、

步驟(2)中，2′-肟基-映-三白草酮接近100％反應生成2′-亞胺基-氧-4"-氧代丁酸-映-三白草酮，不需經(jīng)柱色譜純化后，直接進入下一步反應；步驟(3)為關鍵步驟，投料順序和投料比例對反應成敗至關重要，將2′-亞胺基-氧-4"-氧代丁酸-映-三白草酮先溶于二氯甲烷中，加入EDC和HOBT將其活化成為活性酯；充分攪拌下加入縛酸劑DMAP，最后加入R₁H進行反應；其中，2′-肟基-映-三白草酮、R₁H、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽、1-羥基苯并三氮唑、4-二甲氨基吡啶的摩爾比為1∶1～2∶1.5∶1∶0.1。

優(yōu)選的，反應結束通過硅膠柱色譜分離純化得目標產(chǎn)物，洗脫劑為二氯甲烷-甲醇(50∶1～30∶1V/V)混合溶劑。

發(fā)明人對合成的映-三白草酮類衍生物進行了體外肝癌SMMC-7721細胞的細胞毒活性測試，與映-三白草酮相比，均表現(xiàn)出不同程度的細胞毒活性。

發(fā)明人對合成的映-三白草酮類衍生物以非細胞毒劑量進行抗癌細胞遷移活性篩選，與映-三白草酮相比，對SMMC-7721細胞轉(zhuǎn)移均有不同程度的抑制作用；進一步通過濃度梯度考察代表性化合物的抗癌細胞遷移活性，化合物對細胞遷移呈現(xiàn)出濃度依賴性的抑制活性。

因此，本發(fā)明的另一個目的是提供本發(fā)明式I所示映-三白草酮類衍生物在制備治療癌癥藥物方面的應用。

優(yōu)選的，所述的應用為在制備抑制腫瘤細胞生長藥物方面的應用。

優(yōu)選的，所述的應用為式I所示映-三白草酮類衍生物在制備抑制腫瘤細胞遷移和擴散的藥物方面的應用。

優(yōu)選的，所述的腫瘤為肝癌。

本發(fā)明的有益效果：

本發(fā)明通過簡單高效制備方法合成了一系列映-三白草酮類衍生物，從易得的天然產(chǎn)物出發(fā)，以映-三白草酮為起始原料，通過亞胺化反應，酯化反應，酰化反應合成了一系列2′位取代的映-三白草酮類衍生物，合成方法簡單，條件溫和，具有較好的可操作性和反應收率，中間步驟不需要純化處理，簡化了實驗過程，且總收率在20％～30％。這些合成的映-三白草酮類衍生物在抑制腫瘤細胞生長或抑制腫瘤細胞轉(zhuǎn)移方面表現(xiàn)出不同程度的活性。是潛在治療腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移方面的新化學實體，對于相關疾病新藥的開發(fā)具有重要意義。

附圖說明

圖1為化合物體外細胞水平檢測對肝癌細胞SMMC-7721遷移能力的影響；

圖2為化合物抑制癌細胞遷移能力測試結果；

圖3為化合物4不同濃度對抑制細胞遷移能力的影響；

圖4為化合物4不同濃度抑制癌細胞遷移能力測試結果。

具體實施方式

結合具體實施例對本發(fā)明的技術方案做進一步詳細的說明，但本發(fā)明并不限于以下實施例。

實施例1 2′-肟基-映-三白草酮(化合物1)的制備

在100mL單頸瓶中加入映-三白草酮3.5g(0.010mol)，鹽酸羥胺1.0g(0.015mol)，吡啶5mL，攪拌溶解，加熱回流10h。反應液降至室溫，減壓回收溶劑，殘渣加10mL水混懸，用二氯甲烷萃取3次，每次10mL。合并有機層，無水Na₂SO₄干燥，濃縮二氯甲烷，得粘稠狀物。用硅膠柱層析純化，二氯甲烷洗脫，得白色粉末結晶2.1g，產(chǎn)率58.3％。經(jīng)鑒定為2′-肟基-映-三白草酮。

ESI-MS m/z：372.2[M+H]⁺相對分子質(zhì)量：371.2.

¹H-NMR(300MHz，DMSO-d₆)δ：8.94(1H，s)，6.87(1H，s)，6.40(1H，s)，6.34(1H，s)，5.95(1H，s)，5.90(1H，s)，5.61(1H，s)，5.54(1H，s)，3.09(1H，d，J＝6.0Hz)，2.81(1H，s)，2.51(1H，d，J＝7.2Hz)，2.30(1H，m)，1.91(1H，m)，1.88(1H，m)，1.68(1H，s)，1.24(3H，d，J＝7.2Hz)，0.77(3H，d，J＝7.2Hz).

實施例2 2′-亞胺基-氧-4″-氧代丁?；?N-乙基-映-三白草酮(化合物2)的制備

在50mL單頸瓶中稱取100mg(0.270mmol)實施例1制得的化合物1，加入丁二酸酐40.5mg(0.405mmol)，4-二甲氨基吡啶3.3mg(0.027mmol)，攪拌過夜。TLC監(jiān)測反應完全，減壓濃縮得白色粘稠物127.1mg，產(chǎn)率基本接近100％。

將此粘稠物溶解在5mL二氯甲烷中，室溫下加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽77.6mg(0.405mmol)，1-羥基苯并三氮唑36.5mg(0.270mmol)，攪拌30分鐘后加入催化量4-二甲氨基吡啶3.3mg(0.027mmol)，攪拌中滴加乙胺溶液30.0μL(0.540mmol)，室溫反應過夜。TLC監(jiān)測至反應完全，減壓濃縮得黃色粘稠物。用硅膠柱層析純化，二氯甲烷/甲醇＝40∶1V/V洗脫，得黃色油狀物30.4mg，產(chǎn)率22.6％。經(jīng)鑒定為2′-亞胺基-氧-4″-氧代丁?；?N-乙基-映-三白草酮。

ESI-MS m/z：521.3[M+Na]⁺，相對分子質(zhì)量為498.3.

¹H-NMR(300MHz，CDCl₃)δ：6.86(1H，s)，6.40(1H，s)，6.19(1H，s)，5.95(1H，s)，5.91(1H，s)，5.83(1H，s)，5.64(1H，s)，5.60(1H，s)，3.29(2H，d，J＝6.0Hz)，3.09(1H，s)，2.94(1H，m)，2.85(2H，d，J＝6.0Hz)，2.53(2H，t，J＝6.0Hz)，2.48(1H，m)，2.35(1H，m)，2.12(1H，m)，1.91(1H，m)，1.89(1H，m)，1.25(3H，d，J＝7.2Hz)，1.14(3H，t，J＝6.0Hz)，0.76(3H，d，J＝7.2Hz).

實施例3 2′-亞胺基-氧-4"-氧代丁酰基-N-丙基-映-三白草酮(化合物3)的制備

在50mL單頸瓶中稱取100mg(0.270mmol)實施例1制得的化合物1，加入丁二酸酐40.5mg(0.405mmol)，4-二甲氨基吡啶3.3mg(0.027mmol)，攪拌過夜。TLC監(jiān)測反應完全，減壓濃縮得白色粘稠物127.1mg，產(chǎn)率接近100％。

將此粘稠物溶解在5mL二氯甲烷中，室溫下加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽77.6mg(0.405mmol)，1-羥基苯并三氮唑36.5mg(0.270mmol)，攪拌30分鐘后加入催化量4-二甲氨基吡啶3.3mg(0.027mmol)，攪拌中滴加正丙胺溶液44.4μL(0.540mmol)，室溫反應過夜。TLC監(jiān)測至反應完全，減壓濃縮得黃色粘稠物。用硅膠柱層析純化，二氯甲烷/甲醇＝40∶1洗脫，得黃色油狀物32.7mg，產(chǎn)率23.7％。經(jīng)鑒定為2′-亞胺基-氧-4"-氧代丁?；?N-丙基-映-三白草酮。

ESI-MS m/z：535.3[M+Na]⁺，相對分子質(zhì)量為512.3.

¹H-NMR(300MHz，CDCl₃)δ：6.85(1H，s)，6.38(1H，s)，6.18(1H，s)，5.93(1H，s)，5.89(1H，s)，5.86(1H，s)，5.62(1H，s)，5.56(1H，s)，3.21(2H，d，J＝6.0Hz)，3.07(1H，d，J＝6.0Hz)，2.93(1H，m)，2.84(2H，t，J＝6.0Hz)，2.54(2H，t，J＝6.0Hz)，2.48(1H，m)，2.35(1H，m)，2.10(1H，m)，1.91(1H，m)，1.87(1H，m)，1.53(2H，m)，1.24(3H，d，J＝7.2Hz)，0.92(3H，t，J＝6.0Hz)，0.76(3H，d，J＝7.2Hz).

實施例4 2′-亞胺基-氧-4″-氧代丁?；?N-異丙基-映-三白草酮(化合物4)的制備

在50mL單頸瓶中稱取100mg(0.270mmol)實施例1制得的化合物1，加入丁二酸酐40.5mg(0.405mmol)，4-二甲氨基吡啶3.3mg(0.027mmol)，攪拌過夜。TLC監(jiān)測反應完全，減壓濃縮得白色粘稠物127.1mg，產(chǎn)率接近100％。

將此粘稠物溶解在5mL二氯甲烷中，室溫下加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽77.6mg(0.405mmol)，1-羥基苯并三氮唑36.5mg(0.270mmol)，攪拌30分鐘后加入催化量4-二甲氨基吡啶3.3mg(0.027mmol)，攪拌中滴加異丙胺溶液46.2μL(0.540mmol)，室溫反應過夜。TLC監(jiān)測至反應完全，減壓濃縮得黃色粘稠物。用硅膠柱層析純化，二氯甲烷/甲醇＝40∶1洗脫，得黃色油狀物29.8mg，產(chǎn)率21.6％。經(jīng)鑒定為2′-亞胺基-氧-4"-氧代丁?；?N-異丙基-映-三白草酮。

ESI-MS m/z：535.3[M+Na]⁺，相對分子質(zhì)量為512.3.

¹H-NMR(300MHz，CDCl₃)δ：6.85(1H，s)，6.38(1H，s)，6.19(1H，s)，5.93(1H，s)，5.89(1H，s)，5.62(1H，s)，5.60(1H，s)，5.56(1H，s)，4.06(1H，m)，3.07(1H，d，J＝6.0Hz)，2.89(1H，m)，2.83(2H，t，J＝6.0Hz)，2.53(2H，t，J＝6.0Hz)，2.51(1H，m)，2.35(1H，m)，2.12(1H，m)，1.91(1H，m)，1.88(1H，m)，1.24(3H，d，J＝7.2Hz)，1.16(6H，d，J＝6.0Hz)，0.76(3H，d，J＝7.2Hz).

實施例5 2′-亞胺基-氧-4"-氧代丁?；?N-丁基-映-三白草酮(化合物5)的制備

在50mL單頸瓶中稱取100mg(0.270mmol)實施例1制得的化合物1，加入丁二酸酐40.5mg(0.405mmol)，4-二甲氨基吡啶3.3mg(0.027mmol)，攪拌過夜。TLC監(jiān)測反應完全，減壓濃縮得白色粘稠物127.1mg，產(chǎn)率接近100％。

將此粘稠物溶解在5mL二氯甲烷中，室溫下加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽77.6mg(0.405mmol)，1-羥基苯并三氮唑36.5mg(0.270mmol)，攪拌30分鐘后加入催化量4-二甲氨基吡啶3.3mg(0.027mmol)，攪拌中滴加正丁胺溶液53.3μL(0.540mmol)，室溫反應過夜。TLC監(jiān)測至反應完全，減壓濃縮得黃色粘稠物。用硅膠柱層析純化，二氯甲烷/甲醇＝40∶1洗脫，得黃色油狀物34.2mg，產(chǎn)率24.1％。經(jīng)鑒定為2′-亞胺基-氧-4"-氧代丁?；?N-丁基-映-三白草酮。

ESI-MS m/z：549.3[M+Na]⁺，相對分子質(zhì)量為526.3.

¹H-NMR(300MHz，CDCl₃)δ：6.86(1H，s)，6.39(1H，s)，6.19(1H，s)，5.94(1H，s)，5.90(1H，s)，5.74(1H，s)，5.63(1H，s)，5.57(1H，s)，3.26(2H，q，J＝6.0Hz)，3.08(1H，d，J＝6.0Hz)，2.94(1H，m)，2.87(2H，t，J＝6.0Hz)，2.54(2H，t，J＝6.0Hz)，2.49(1H，m)，2.36(1H，m)，2.11(1H，m)，1.92(1H，m)，1.89(1H，m)，1.48(2H，m)，1.36(2H，m)，1.25(3H，d，J＝7.2Hz)，0.93(3H，t，J＝6.0Hz)，0.76(3H，d，J＝7.2Hz).

實施例6 2′-亞胺基-氧-4"-氧代丁?；?N-芐基-映-三白草酮(化合物6)的制備

在50mL單頸瓶中稱取100mg(0.270mmol)實施例1制得的化合物1，加入丁二酸酐40.5mg(0.405mmol)，4-二甲氨基吡啶3.3mg(0.027mmol)，攪拌過夜。TLC監(jiān)測反應完全，減壓濃縮得白色粘稠物127.1mg，產(chǎn)率接近100％。

將此粘稠物溶解在5mL二氯甲烷中，室溫下加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽77.6mg(0.405mmol)，1-羥基苯并三氮唑36.5mg(0.270mmol)，攪拌30分鐘后加入催化量4-二甲氨基吡啶3.3mg(0.027mmol)，攪拌中滴加芐胺溶液58.9μL(0.540mmol)，室溫反應過夜。TLC監(jiān)測至反應完全，減壓濃縮得黃色粘稠物。用硅膠柱層析純化，二氯甲烷/甲醇＝50∶1洗脫，得黃色油狀物30.8mg，產(chǎn)率20.4％。經(jīng)鑒定為2′-亞胺基-氧-4"-氧代丁?；?N-芐基-映-三白草酮。

ESI-MS m/z：583.3[M+Na]⁺，相對分子質(zhì)量為560.3.

¹H-NMR(300MHz，CDCl₃)δ：7.32(5H，m)，6.86(1H，s)，6.39(1H，s)，6.32(1H，s)，6.19(1H，s)，5.93(1H，s)，5.89(1H，s)，5.62(1H，s)，5.56(1H，s)，4.43(2H，d，J＝6.0Hz)，3.08(1H，d，J＝6.0Hz)，2.92(1H，m)，2.86(2H，t，J＝6.0Hz)，2.58(2H，t，J＝6.0Hz)，2.50(1H，m)，2.33(1H，m)，2.10(1H，m)，1.91(1H，m)，1.87(1H，m)，1.24(3H，d，J＝7.2Hz)，0.76(3H，d，J＝7.2Hz).

實施例7 2′-亞胺基-氧-4″-氧代丁?；?嗎啉基-映-三白草酮(化合物7)的制備

在50mL單頸瓶中稱取100mg(0.270mmol)實施例1制得的化合物1，加入丁二酸酐40.5mg(0.405mmol)，4-二甲氨基吡啶3.3mg(0.027mmol)，攪拌過夜。TLC監(jiān)測反應完全，減壓濃縮得白色粘稠物127.1mg，產(chǎn)率接近100％。

將此粘稠物溶解在5mL二氯甲烷中，室溫下加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽77.6mg(0.405mmol)，1-羥基苯并三氮唑36.5mg(0.270mmol)，攪拌30分鐘后加入催化量4-二甲氨基吡啶3.3mg(0.027mmol)，攪拌中滴加嗎啡啉溶液47.0μL(0.540mmol)，室溫反應過夜。TLC監(jiān)測至反應完全，減壓濃縮得黃色粘稠物。用硅膠柱層析純化，二氯甲烷/甲醇＝40∶1洗脫，得黃色油狀物29.5mg，產(chǎn)率20.2％。經(jīng)鑒定為2′-亞胺基-氧-4"-氧代丁?；?嗎啉基-映-三白草酮。

ESI-MS m/z：563.3[M+Na]⁺，相對分子質(zhì)量為540.3.

¹H-NMR(300MHz，CDCl₃)δ：6.86(1H，s)，6.39(1H，s)，6.22(1H，s)，5.94(1H，s)，5.90(1H，s)，5.63(1H，s)，5.57(1H，s)，3.67(4H，m)，3.53(4H，s)，3.07(1H，d，J＝6.0Hz)，2.94(1H，m)，2.86(2H，t，J＝6.0Hz)，2.70(2H，t，J＝6.0Hz)，2.50(1H，m)，2.36(1H，m)，2.15(1H，m)，1.92(1H，m)，1.89(1H，m)，1.25(3H，d，J＝7.2Hz)，0.76(3H，d，J＝7.2Hz).

實施例8 2′-亞胺基-氧-4"-氧代丁?；?1″′-甲基哌嗪基-映-三白草酮(化合物8)的制備

在50mL單頸瓶中稱取100mg(0.270mmol)實施例1制得的化合物1，加入丁二酸酐40.5mg(0.405mmol)，4-二甲氨基吡啶3.3mg(0.027mmol)，攪拌過夜。TLC監(jiān)測反應完全，減壓濃縮得白色粘稠物127.1mg，產(chǎn)率接近100％。

將此粘稠物溶解在5mL二氯甲烷中，室溫下加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽77.6mg(0.405mmol)，1-羥基苯并三氮唑36.5mg(0.270mmol)，攪拌30分鐘后加入催化量4-二甲氨基吡啶3.3mg(0.027mmol)，攪拌中滴加N-甲基哌嗪溶液59.9μL(0.540mmol)，室溫反應過夜。TLC監(jiān)測至反應完全，減壓濃縮得黃色粘稠物。用硅膠柱層析純化，二氯甲烷/甲醇＝30∶1洗脫，得黃色油狀物28.1mg，產(chǎn)率18.8％。經(jīng)鑒定為2′-亞胺基-氧-4"-氧代丁?；?1″′-甲基哌嗪基-映-三白草酮。

ESI-MS m/z：554.3[M+H]⁺，相對分子質(zhì)量為553.3.

¹H-NMR(300MHz，CDCl₃)δ：6.85(1H，s)，6.38(1H，s)，6.21(1H，s)，5.93(1H，s)，5.89(1H，s)，5.61(1H，s)，5.55(1H，s)，3.66(2H，s)，3.54(2H，s)，3.06(1H，d，J＝6.0Hz)，2.85(1H，m)，2.83(2H，t，J＝6.0Hz)，2.70(2H，t，J＝6.0Hz)，2.63(1H，m)，2.49(1H，m)，2.42(4H，m)，2.32(3H，s)，2.12(1H，m)，1.91(1H，m)，1.88(1H，m)，1.23(3H，d，J＝7.2Hz)，0.75(3H，d，J＝7.2Hz).

實施例9 2′-亞胺基-氧-4″-氧代丁?；?1″′-(2″″-吡啶基)哌嗪基-映-三白草酮(化合物9)的制備

在50mL單頸瓶中稱取100mg(0.270mmol)實施例1制得的化合物1，加入丁二酸酐40.5mg(0.405mmol)，4-二甲氨基吡啶3.3mg(0.027mmol)，攪拌過夜。TLC監(jiān)測反應完全，減壓濃縮得白色粘稠物127.1mg，產(chǎn)率接近100％。

將此粘稠物溶解在5mL二氯甲烷中，室溫下加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽77.6mg(0.405mmol)，1-羥基苯并三氮唑36.5mg(0.270mmol)，攪拌30分鐘后加入催化量4-二甲氨基吡啶3.3mg(0.027mmol)，攪拌中滴加N-(2-吡啶基)哌嗪溶液82.2μL(0.540mmol)，室溫反應過夜。TLC監(jiān)測至反應完全，減壓濃縮得黃色粘稠物。用硅膠柱層析純化，二氯甲烷/甲醇＝35∶1洗脫，得黃色油狀物30.6mg，產(chǎn)率18.4％。經(jīng)鑒定為2′-亞胺基-氧-4"-氧代丁?；?1″′-(2″″-吡啶基)哌嗪基-映-三白草酮。

ESI-MS m/z：639.3[M+Na]⁺，相對分子質(zhì)量為616.3.

¹H-NMR(300MHz，CDCl₃)δ：8.21(1H，d，J＝3.6Hz)，7.51(1H，t，J＝6.0Hz)，6.85(1H，s)，6.67(2H，t，J＝6.0Hz)，6.38(1H，s)，6.22(1H，s)，5.93(1H，s)，5.89(1H，s)，5.61(1H，s)，5.54(1H，s)，3.76(2H，s)，3.65(4H，s)，3.52(2H，s)，3.07(1H，d，J＝3Hz)，2.92(1H，m)，2.87(2H，t，J＝6.0Hz)，2.76(2H，t，J＝6.0Hz)，2.47(1H，m)，2.35(1H，m)，2.11(1H，m)，1.91(1H，m)，1.88(1H，m)，1.23(3H，d，J＝7.2Hz)，0.75(3H，d，J＝7.2Hz).

實施例10 2′-亞胺基-氧-4"-氧代丁?；?1″′-(2″″-嘧啶基)哌嗪基-映-三白草酮(化合物10)的制備

在50mL單頸瓶中稱取100mg(0.270mmol)實施例1制得的化合物1，加入丁二酸酐40.5mg(0.405mmol)，4-二甲氨基吡啶3.3mg(0.027mmol)，攪拌過夜。TLC監(jiān)測反應完全，減壓濃縮得白色粘稠物127.1mg，產(chǎn)率接近100％。

將此粘稠物溶解在5mL二氯甲烷中，室溫下加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽77.6mg(0.405mmol)，1-羥基苯并三氮唑36.5mg(0.270mmol)，攪拌30分鐘后加入催化量4-二甲氨基吡啶3.3mg(0.027mmol)，攪拌中滴加N-(2-嘧啶基)哌嗪溶液76.5μL(0.540mmol)，室溫反應過夜。TLC監(jiān)測至反應完全，減壓濃縮得黃色粘稠物。用硅膠柱層析純化，二氯甲烷/甲醇＝35∶1洗脫，得黃色油狀物31.7mg，產(chǎn)率19.0％。經(jīng)鑒定為2′-亞胺基-氧-4″-氧代丁?；?1″′-(2″″-嘧啶基)哌嗪基-映-三白草酮。

ESI-MS m/z：640.3[M+Na]⁺，相對分子質(zhì)量為617.3.

¹H-NMR(300MHz，CDCl₃)δ：8.34(2H，d，J＝4.8Hz)，6.86(1H，s)，6.55(1H，t，J＝4.8Hz)，6.39(1H，s)，6.23(1H，s)，5.94(1H，s)，5.90(1H，s)，5.63(1H，s)，5.56(1H，s)，3.90(2H，s)，3.82(2H，s)，3.72(2H，s)，3.60(2H，s)，3.07(1H，d，J＝6.0Hz)，2.93(1H，m)，2.88(2H，t，J＝6.0Hz)，2.78(2H，t，J＝6.0Hz)，2.48(1H，m)，2.36(1H，m)，2.13(1H，m)，1.92(1H，m)，1.89(1H，m)，1.24(3H，d，J＝7.2Hz)，0.77(3H，d，J＝7.2Hz).

實施例11 2′-亞胺基-氧-4"-氧代丁?；?1″′-(4″″-氟苯基)哌嗪基-映-三白草酮(化合物11)的制備

在50mL單頸瓶中稱取100mg(0.270mmol)實施例1制得的化合物1，加入丁二酸酐40.5mg(0.405mmol)，4-二甲氨基吡啶3.3mg(0.027mmol)，攪拌過夜。TLC監(jiān)測反應完全，減壓濃縮得白色粘稠物127.1mg，產(chǎn)率接近100％。

將此粘稠物溶解在5mL二氯甲烷中，室溫下加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽77.6mg(0.405mmol)，1-羥基苯并三氮唑36.5mg(0.270mmol)，攪拌30分鐘后加入催化量4-二甲氨基吡啶3.3mg(0.027mmol)，攪拌中滴加N-(4-氟苯基)哌嗪溶液97.3μL(0.540mmol)，室溫反應過夜。TLC監(jiān)測至反應完全，減壓濃縮得黃色粘稠物。用硅膠柱層析純化，二氯甲烷/甲醇＝35∶1洗脫，得黃色油狀物29.4mg，產(chǎn)率17.2％。經(jīng)鑒定為2′-亞胺基-氧-4"-氧代丁?；?1″′-(4″″-氟苯基)哌嗪基-映-三白草酮。

ESI-MS m/z：656.3[M+Na]⁺，相對分子質(zhì)量為633.3.

¹H-NMR(300MHz，CDCl₃)δ：6.94(4H，m)，6.86(1H，s)，6.39(1H，s)，6.22(1H，s)，5.93(1H，s)，5.90(1H，s)，5.62(1H，s)，5.55(1H，s)，3.79(2H，s)，3.68(2H，s)，3.08(5H，m)，2.92(1H，m)，2.88(2H，t，J＝6.0Hz)，2.76(2H，t，J＝6.0Hz)，2.48(1H，m)，2.36(1H，m)，2.12(1H，m)，1.91(1H，m)，1.88(1H，m)，1.24(3H，d，J＝7.2Hz)，0.76(3H，d，J＝7.2Hz).

實施例12 2′-亞胺基-氧-4"-氧代丁?；?1″′-苯基哌嗪基-映-三白草酮(化合物12)的制備

在50mL單頸瓶中稱取100mg(0.270mmol)實施例1制得的化合物1，加入丁二酸酐40.5mg(0.405mmol)，4-二甲氨基吡啶3.3mg(0.027mmol)，攪拌過夜。TLC監(jiān)測反應完全，減壓濃縮得白色粘稠物127.1mg，產(chǎn)率接近100％。

將此粘稠物溶解在5mL二氯甲烷中，室溫下加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽77.6mg(0.405mmol)，1-羥基苯并三氮唑36.5mg(0.270mmol)，攪拌30分鐘后加入催化量4-二甲氨基吡啶3.3mg(0.027mmol)，攪拌中滴加N-苯基哌嗪溶液82.3μL(0.540mmol)，室溫反應過夜。TLC監(jiān)測至反應完全，減壓濃縮得黃色粘稠物。用硅膠柱層析純化，二氯甲烷/甲醇＝35∶1洗脫，得黃色油狀物32.6mg，產(chǎn)率19.5％。經(jīng)鑒定為2′-亞胺基-氧-4″-氧代丁酰基-1″′-苯基哌嗪基-映-三白草酮。

ESI-MS m/z：638.3[M+Na]⁺，相對分子質(zhì)量為615.3.

¹H-NMR(300MHz，CDCl₃)δ：7.32(2H，m)，6.96(3H，m)，6.87(1H，s)，6.40(1H，s)，6.24(1H，s)，5.95(1H，s)，5.91(1H，s)，5.63(1H，s)，5.56(1H，s)，3.80(2H，s)，3.70(2H，s)，3.20(4H，s)，3.09(1H，d，J＝6.0Hz)，2.94(1H，m)，2.88(2H，t，J＝6.0Hz)，2.79(2H，t，J＝6.0Hz)，2.50(1H，m)，2.36(1H，m)，2.15(1H，m)，1.93(1H，m)，1.89(1H，m)，1.26(3H，d，J＝7.2Hz)，0.77(3H，d，J＝7.2Hz).

實施例13 2′-亞胺基-氧-4"-氧代丁?；?吡咯烷基-映-三白草酮(化合物13)的制備

在50mL單頸瓶中稱取100mg(0.270mmol)實施例1制得的化合物1，加入丁二酸酐40.5mg(0.405mmol)，4-二甲氨基吡啶3.3mg(0.027mmol)，攪拌過夜。TLC監(jiān)測反應完全，減壓濃縮得白色粘稠物127.1mg，產(chǎn)率接近100％。

將此粘稠物溶解在5mL二氯甲烷中，室溫下加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽77.6mg(0.405mmol)，1-羥基苯并三氮唑36.5mg(0.270mmol)，攪拌30分鐘后加入催化量4-二甲氨基吡啶3.3mg(0.027mmol)，攪拌中滴加吡咯烷溶液44.3μL(0.540mmol)，室溫反應過夜。TLC監(jiān)測至反應完全，減壓濃縮得黃色粘稠物。用硅膠柱層析純化，二氯甲烷/甲醇＝40∶1洗脫，得黃色油狀物28.3mg，產(chǎn)率20.0％。經(jīng)鑒定為2′-亞胺基-氧-4″-氧代丁酰基-吡咯烷基-映-三白草酮。

ESI-MS m/z：547.3[M+Na]⁺，相對分子質(zhì)量為524.3.

¹H-NMR(300MHz，CDCl₃)δ：6.86(1H，s)，6.39(1H，s)，6.21(1H，s)，5.93(1H，s)，5.90(1H，s)，5.62(1H，s)，5.56(1H，s)，3.48(4H，t，J＝6.3Hz)，3.07(1H，d，J＝6.0Hz)，2.93(1H，m)，2.86(2H，t，J＝6.0Hz)，2.65(2H，t，J＝6.0Hz)，2.48(1H，m)，2.36(1H，m)，2.16(1H，m)，2.00(4H，m)，1.97(1H，m)，1.89(1H，m)，1.24(3H，d，J＝7.2Hz)，0.76(3H，d，J＝7.2Hz).

實施例14 2′-亞胺基-氧-4"-氧代丁酰基-1″′-乙基哌嗪基-映-三白草酮(化合物14)的制備

在50mL單頸瓶中稱取100mg(0.270mmol)實施例1制得的化合物1，加入丁二酸酐40.5mg(0.405mmol)，4-二甲氨基吡啶3.3mg(0.027mmol)，攪拌過夜。TLC監(jiān)測反應完全，減壓濃縮得白色粘稠物127.1mg，產(chǎn)率接近100％。

將此粘稠物溶解在5mL二氯甲烷中，室溫下加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽77.6mg(0.405mmol)，1-羥基苯并三氮唑36.5mg(0.270mmol)，攪拌30分鐘后加入催化量4-二甲氨基吡啶3.3mg(0.027mmol)，攪拌中滴加N-乙基哌嗪溶液68.6μL(0.540mmol)，室溫反應過夜。TLC監(jiān)測至反應完全，減壓濃縮得黃色粘稠物。用硅膠柱層析純化，二氯甲烷/甲醇＝35∶1洗脫，得黃色油狀物29.8mg，產(chǎn)率19.5％。經(jīng)鑒定為2′-亞胺基-氧-4"-氧代丁?；?1″′-乙基哌嗪基-映-三白草酮。

ESI-MS m/z：590.3[M+Na]⁺，相對分子質(zhì)量為567.3.

¹H-NMR(300MHz，CDCl₃)δ：6.86(1H，s)，6.39(1H，s)，6.22(1H，s)，5.93(1H，s)，5.89(1H，s)，5.63(1H，s)，5.56(1H，s)，3.67(2H，m)，3.55(2H，m)，3.10(1H，d，J＝6.0Hz)，2.90(1H，m)，2.85(2H，t，J＝6.0Hz)，2.71(2H，t，J＝6.0Hz)，2.67(1H，m)，2.47(4H，m)，2.45(2H，m)，2.32(1H，m)，2.12(1H，m)，1.92(1H，m)，1.89(1H，m)，1.24(3H，d，J＝7.2Hz)，1.12(3H，t，J＝6.0Hz)，0.76(3H，d，J＝7.2Hz).

實施例15 2′-亞胺基-氧-4"-氧代丁?；?1″′-乙氧羰基哌嗪基-映-三白草酮(化合物15)的制備

在50mL單頸瓶中稱取100mg(0.270mmol)實施例1制得的化合物1，加入丁二酸酐40.5mg(0.405mmol)，4-二甲氨基吡啶3.3mg(0.027mmol)，攪拌過夜。TLC監(jiān)測反應完全，減壓濃縮得白色粘稠物127.1mg，產(chǎn)率接近100％。

將此粘稠物溶解在5mL二氯甲烷中，室溫下加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽77.6mg(0.405mmol)，1-羥基苯并三氮唑36.5mg(0.270mmol)，攪拌30分鐘后加入催化量4-二甲氨基吡啶3.3mg(0.027mmol)，攪拌中滴加N-乙氧羰基哌嗪溶液79.1μL(0.540mmol)，室溫反應過夜。TLC監(jiān)測至反應完全，減壓濃縮得黃色粘稠物。用硅膠柱層析純化，二氯甲烷/甲醇＝35∶1洗脫，得黃色油狀物30.0mg，產(chǎn)率18.2％。經(jīng)鑒定為2′-亞胺基-氧-4″-氧代丁?；?1″′-乙氧羰基哌嗪基-映-三白草酮。

ESI-MS m/z：634.4[M+Na]⁺，相對分子質(zhì)量為611.4.

¹H-NMR(300MHz，CDCl₃)δ：6.84(1H，s)，6.37(1H，s)，6.20(1H，s)，5.92(1H，s)，5.88(1H，s)，5.61(1H，s)，5.55(1H，s)，4.15(2H，q，J＝6.9Hz)，3.61(2H，s)，3.51(6H，m)，3.06(1H，d，J＝6.0Hz)，2.90(1H，m)，2.84(2H，t，J＝6Hz)，2.71(2H，t，J＝6Hz)，2.49(1H，m)，2.32(1H，m)，2.14(1H，m)，1.90(1H，m)，1.87(1H，m)，1.25(3H，d，J＝7.2Hz)，1.23(3H，m)，0.74(3H，d，J＝7.2Hz).

實施例16 2′-亞胺基-氧-4"-氧代丁?；?N-二乙基-映-三白草酮(化合物16)的制備

在50mL單頸瓶中稱取100mg(0.270mmol)實施例1制得的化合物1，加入丁二酸酐40.5mg(0.405mmol)，4-二甲氨基吡啶3.3mg(0.027mmol)，攪拌過夜。TLC監(jiān)測反應完全，減壓濃縮得白色粘稠物。

將此粘稠物溶解在5mL二氯甲烷中，室溫下加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽77.6mg(0.405mmol)，1-羥基苯并三氮唑36.5mg(0.270mmol)，攪拌30分鐘后加入催化量4-二甲氨基吡啶3.3mg(0.027mmol)，攪拌中滴加二乙胺溶液55.8μL(0.540mmol)，室溫反應過夜。TLC監(jiān)測至反應完全，減壓濃縮得黃色粘稠物。用硅膠柱層析純化，二氯甲烷/甲醇＝40∶1洗脫，得黃色油狀物31.3mg，產(chǎn)率22.0％。經(jīng)鑒定為2′-亞胺基-氧-4"-氧代丁?；?N-二乙基-映-三白草酮。

ESI-MS m/z：549.3[M+Na]⁺，相對分子質(zhì)量為526.3.

¹H-NMR(300MHz，CDCl₃)δ：6.86(1H，s)，6.39(1H，s)，6.22(1H，s)，5.94(1H，s)，5.90(1H，s)，5.63(1H，s)，5.56(1H，s)，3.37(4H，m)，3.08(1H，d，J＝6.0Hz)，2.88(1H，m)，2.86(2H，t，J＝6.0Hz)，2.70(2H，t，J＝6.0Hz)，2.48(1H，m)，2.32(1H，m)，2.13(1H，m)，1.92(1H，m)，1.89(1H，m)，1.22(3H，d，J＝7.2Hz)，1.13(6H，m)，0.75(3H，d，J＝7.2Hz).

實施例17

化合物體外抑制腫瘤細胞增殖實驗(MTT法)

(1)細胞株及試劑

人肝癌細胞株SMMC-7721，購自中國科學院上海生命科學研究院細胞庫；

高糖DMEM培養(yǎng)液，購自美國Gibco公司；

胎牛血清，購自杭州四季青公司；

胰酶細胞消化液，購自上海碧云天生物技術有限公司；

噻唑藍(MTT)，購自sigma公司。

PBS緩沖鹽溶液：磷酸二氫鉀(KH₂PO₄)0.27g，磷酸氫二鈉(Na₂HPO₄)1.42g，氯化鈉(NaCl)8g，氯化鉀(KCl)0.2g，加去離子水約800mL充分攪拌溶解，然后加入濃鹽酸調(diào)pH至7.4，最后定容到1L，高溫高壓滅菌后置于4℃冰箱保存待用。

(2)受試藥品溶液

以姜黃素、映-三白草酮為對照藥，姜黃素、映-三白草酮、化合物1-16分別用DMSO溶解配制成80mM的溶液，用高糖DMEM培養(yǎng)液稀釋為80μM的母液，在此基礎上依次用高糖DMEM培養(yǎng)液稀釋得80，60，40，20，10μM的受試藥品溶液，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

(3)細胞培養(yǎng)

人肝癌細胞SMMC-7721在含10％胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)液中，37℃、5％CO₂保持飽和濕度培養(yǎng)，2-3天傳代一次。

分別取對數(shù)生長期癌細胞一瓶，加入胰酶細胞消化液消化，使貼壁細胞脫落，配制成濃度為5×10⁴個/mL的細胞懸液，96孔細胞培養(yǎng)板中每孔加入100μL細胞懸液(每孔5×10³個細胞)，板置于37℃，5％CO₂培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時。棄去培養(yǎng)液，PBS緩沖鹽溶液清洗2次，受試組每孔加入100μL相應的含不同濃度受試藥品溶液的高糖DMEM培養(yǎng)液；陰性對照組只加等量高糖DMEM培養(yǎng)液。

96孔板置于37℃，5％CO₂培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72小時，每孔加入10μL MTT溶液(5mg/mL)，在培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)4小時。棄去培養(yǎng)基，每孔加入150μL DMSO溶解，搖床10分鐘輕輕混勻；每孔的吸光度(OD值)用1500酶標儀在490nm波長下進行檢測，計算抑制率和IC₅₀值。

抑制率(％)＝(陰性對照組OD值-受試組OD值)/陰性對照組OD值×100％

應用GraphPad Prism 5軟件計算IC₅₀。

表1化合物1-16對癌細胞SMMC-7721的細胞毒活力測試結果

由表1可知，與陽性對照藥姜黃素相比，化合物1-16對肝癌SMMC-7721細胞表現(xiàn)出不同程度的抑制腫瘤細胞增殖作用。其中化合物2-10，14，15，16的活性均強于映-三白草酮，化合物2，5，7，14，15，16的活性均強于陽性藥，化合物7具有最強的抗腫瘤活性，這些化合物的取代基R₁均為伯胺基或仲胺基，或R₅為烷烴基的哌嗪基取代。可以初步判定，在映-三白草酮結構中引入有機胺基片段，可以顯著增強其細胞毒活性，其中烷基鏈長度以C2-C4為宜。構效關系初步探討：R₂為烷烴基時，化合物的活性并不隨烷烴鏈長度的增加而呈規(guī)律性變化：C2烷烴鏈的活性最強，C4烷烴鏈的活性次之，其余各長度烷烴鏈的活性均有所下降；R₁為含氮雜環(huán)基時，化合物活性順序為嗎啉基＞哌嗪基＞吡咯烷基；根據(jù)哌嗪基上取代基R₅的不同，化合物的活性順序為烷烴基＞含氮苯基＞苯基及鹵素取代苯基，在一定范圍內(nèi)(C1-C2)烷基鏈越長活性越強。

根據(jù)MTT實驗結果，我們選取低于IC₅₀值的濃度20μM作為化合物的安全濃度，對抑制肝癌細胞SMMC-7721遷移能力進行檢測。

體外細胞水平檢測化合物對肝癌細胞SMMC-7721遷移能力的影響

1、實驗方法

運用細胞劃痕法，以姜黃素作、映-三白草酮為對照藥，對化合物1-16進行體外抗肝癌細胞SMMC-7721遷移活性篩選。具體實驗步驟為：用marker筆在6孔板背后，用直尺比著均勻的劃橫線；將培養(yǎng)在含10％胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)基中細胞接種于6孔板中，培養(yǎng)單層細胞至100％，使用無菌槍頭(100μL)尖端比著直尺，盡量垂直于背后的橫線劃痕，槍頭要垂直，不能傾斜；用PBS清洗細胞3次，棄去劃下的細胞，分別加入含有不同化合物濃度為20μM的受試藥品溶液，并設置不加藥物的對照孔，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h后，放在光學顯微鏡上于固定位置取樣，拍照，記錄劃痕兩端細胞間距的變化。

2、實驗結果

體外細胞水平檢測化合物對肝癌細胞SMMC-7721遷移能力的影響實驗結果見圖1、圖2，大部分化合物表現(xiàn)出不同程度的抑制細胞遷移活性。1-4，7-13，16這12個化合物抑制細胞遷移的活性強于映-三白草酮，其中化合物1，4，8，16的抑制細胞遷移活性強于陽性藥。

化合物1-16中抑制細胞遷移活性最強的為化合物4，因此以化合物4為代表，檢測不同濃度的化合物4對肝癌細胞SMMC-7721遷移能力的影響。圖3、圖4表示抑制細胞遷移活性隨著化合物4濃度的上升而呈現(xiàn)梯度增強，即化合物對細胞遷移呈現(xiàn)出濃度依賴性的抑制活性。

由于本發(fā)明首先經(jīng)過細胞毒性篩選，排除細胞毒性對抗腫瘤細胞遷移活性的影響，經(jīng)活性測定的衍生物均為在非細胞毒劑量下，具有較強的抗肝癌細胞遷移作用。16個映-三白草酮類衍生物中，2-4，7-10，16這8個化合物在細胞毒性和抑制細胞遷移活性方面均強于映-三白草酮，但細胞毒性最強的衍生物7并沒有表現(xiàn)出最強的抑制肝癌細胞遷移活性，這也間接說明了化合物可能不完全是通過細胞毒性來發(fā)揮抗腫瘤細胞遷移活性的。這種在一定濃度下不具有或具有較低細胞毒性卻具有抗肝癌細胞遷移活性的化合物能夠滿足臨床上預防癌癥轉(zhuǎn)移所需要的長期給藥需求。