本發(fā)明屬于醫(yī)學生物技術領域。更具體地，涉及一種檢測RUNX1rs2268277基因多態(tài)性的引物及其PCR方法。
背景技術：
臨床上，硫嘌呤類藥物（巰基嘌呤類藥物）應用廣泛。但是，該類藥物的不良反應發(fā)生率較高，包括骨髓抑制、肝臟損害、胃腸紊亂、胰腺炎和流行感冒樣癥狀等。
目前的研究認為，巰基嘌呤類藥物的不良反應可能與藥物的代謝途徑及基因多態(tài)性有關。巰基嘌呤甲基轉(zhuǎn)移酶（thiopurine methyltransferase，TPMT）和三磷酸肌苷焦磷酸酶（inosine triphosphate pyrophosphatase，ITPA）是巰基嘌呤類藥物的代謝酶，其中TPMT是巰基嘌呤類藥物代謝的關鍵酶，TPMT和ITPA存在明顯的遺傳多態(tài)性。但是仍然有部分患者的不良反應的發(fā)生，無法解釋。
技術實現(xiàn)要素：
本發(fā)明的目的是提供一種用PCR方法檢測RUNX1rs2268277基因多態(tài)性位點的引物對RUNXF/RUNXR?？梢愿鶕?jù)電泳結果確定RUNX1rs2268277基因多態(tài)性位點的基因型，結合個體的其他生物學指標對于巰基嘌呤類藥物的療效和副作用進行預測，克服了臨床選擇巰基嘌呤類藥物的盲目性，在基因型分析的基礎上可以預測患者使用巰基嘌呤類藥物的有效性和安全性，指導臨床用藥，使患者能夠進行個體化醫(yī)療。
本發(fā)明的另一目的是提供上述引物對RUNXF/RUNXR在制備通過PCR擴增生物樣品檢測RUNX1rs2268277基因多態(tài)性位點的試劑中的應用。
本發(fā)明的再一目的是提供一種包含上述引物對RUNXF/RUNXR的RUNX1rs2268277基因多態(tài)性位點檢測試劑盒。
本發(fā)明上述目的通過以下技術方案實現(xiàn)：
一種用PCR方法檢測RUNX1rs2268277基因多態(tài)性位點的引物對RUNXF/RUNXR，其序列分別如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示。
上述引物對RUNXF/RUNXR在檢測生物樣品RUNX1rs2268277基因多態(tài)性位點方面的應用，也在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。
一種通過PCR擴增生物樣品檢測RUNX1rs2268277基因多態(tài)性位點的方法，是以待測生物樣品的DNA為模板，以上述引物對RUNXF/RUNXR進行PCR擴增，根據(jù)擴增結果確定RUNX1rs2268277基因多態(tài)性位點的基因型。
其中，所述待測生物樣品為患者外周血。
優(yōu)選地，所述PCR擴增的反應體系為25μl，包括：DNA模板3μl，10×Taq buffer 2.5μl，0.25mmol/L dNTPs 2μl，10μmol/L上下游引物各1μl，5U/μl ExTaq? 0.15μl，余量ddH2O。
優(yōu)選地，所述PCR擴增的反應條件為：94℃ 2min；94℃ 30s，62℃ 30s，72℃ 30s，20個循環(huán)；72℃ 7min；4℃保存。
另外，上述引物對RUNXF/RUNXR在制備通過PCR擴增生物樣品檢測RUNX1rs2268277基因多態(tài)性位點的試劑盒中的應用，以及包含上述引物對RUNXF/RUNXR 的RUNX1rs2268277基因多態(tài)性位點檢測試劑盒，也在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。
優(yōu)選地，所述試劑盒還含有dNTPs、ExTaq聚合酶。
優(yōu)選地，所述試劑盒還含有0.25mmol/L的dNTPs、5U/μl的ExTaq聚合酶。
本發(fā)明上述引物對RUNXF/RUNXR以及用PCR方法檢測RUNX1rs2268277基因多態(tài)性位點的方法和試劑盒，可以用于檢測RUNX1rs2268277基因多態(tài)性位點的基因型。
本發(fā)明的引物對RUNXF/RUNXR以及用PCR方法可以檢測RUNX1rs2268277基因多態(tài)性，RUNX1rs2268277基因多態(tài)性與巰嘌呤類藥物不良反應有關，可根據(jù)擴增電泳結果確定RUNX1rs2268277基因多態(tài)性位點的基因型，對巰基嘌呤類藥物的療效和副作用進行預測，預測患者使用巰基嘌呤類藥物的有效性和安全性，指導臨床用藥，使患者能夠進行個體化醫(yī)療。
本發(fā)明具有以下有益效果：
本發(fā)明公開了一種用PCR方法檢測RUNX1rs2268277基因多態(tài)性位點的引物對RUNXF/RUNXR，其序列分別如SEQ ID NO.1和2所示。利用本發(fā)明的引物對及其PCR方法，可以根據(jù)擴增電泳結果確定RUNX1rs2268277基因多態(tài)性位點的基因型，對巰基嘌呤類藥物的療效和副作用進行預測，在基因型分析的基礎上可以預測患者使用巰基嘌呤類藥物的有效性和安全性，指導臨床用藥，使患者能夠進行個體化醫(yī)療，克服臨床選擇巰基嘌呤類藥物的盲目性，避免用藥不良反應。
而且，本發(fā)明的方法簡單易行，應用前景廣泛。
附圖說明
圖1為基因分型結果的基因型電泳圖譜（PCR-RFLP）；HW為野生型純合子，HM為突變型純合子，HT為突變雜合子。
具體實施方式
以下結合說明書附圖和具體實施例來進一步說明本發(fā)明，但實施例并不對本發(fā)明做任何形式的限定。除非特別說明，本發(fā)明采用的試劑、方法和設備為本技術領域常規(guī)試劑、方法和設備。
除非特別說明，本發(fā)明所用試劑和材料均為市購。
實施例1 檢測RUNX1rs2268277基因多態(tài)性的引物及其PCR方法
1、實驗所需試劑及其配置
（1）DNA提取試劑
6mol/L NaI（上海生工生物工程技術服務有限公司，上海），氯仿，異丙醇，異戊醇，乙醇均為市售分析純產(chǎn)品。
（2）PCR擴增試劑
Ex Taq?酶（Takara公司，日本），合成引物（上海生工生物工程技術服務有限公司，上海）。
（3）瓊脂糖凝膠電泳試劑
普通瓊脂糖（Biowest 公司，西班牙），低熔點瓊脂糖（上海生物工程技術服務有限公司，上海），5×TBE電泳液儲存液（0.45 mol/L Tris堿，0.45 mol/L硼酸，0.01 mol/L EDTA，調(diào)pH至8.0；Tris、硼酸、EDTA購自上海生工生物工程技術服務有限公司）稀釋10倍使用，GoldviewTM Nucleic Acid stain（北京賽百盛生物工程公司，北京）。
（4）DL1000、DL2000 DNA Ladder Marker（Takara公司，日本）。
（5）0.5 M EDTA溶液
稱取186.1 g EDTA·2H2O于1 L燒杯中，加800 ml去離子水，充分攪拌，加NaOH調(diào)節(jié)pH至8.0，攪拌至完全溶解，加去離子水定容至1 L，高溫高壓滅菌。
（6）5×TBE溶液
稱取54 g Tris，27.5 g硼酸，置于燒杯，加適量雙蒸水攪拌溶解；加入0.5 M EDTA溶液20 ml，加雙蒸水定容至1 L，制成5×TBE儲備液。儲備液將稀釋10倍為0.5×TBE溶液使用。
（7）6 M NaI溶液
稱取45 g NaI置于燒杯中，加雙蒸水攪拌溶解，定容至50 ml，避光保存。
2、實驗所需主要儀器
ABI GeneAmp? PCR System 2700 ( Applied Biosystems公司，美國)
Eppendorf MasterCycler? epGradient PCR儀（Eppendorf公司，德國）
DYY－11131C 型水平電泳槽（北京六一儀器廠，北京）
DYY－6C 型穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀（北京六一儀器廠，北京）
EC3凝膠成像系統(tǒng)（UVP 公司，美國）
Eppendorf 5417R低溫離心機（Eppendorf公司，德國）
富華SHA-C型恒溫振蕩水浴器（常州菲普實驗儀器廠，江蘇）
DZF-6050真空干燥箱（上海一恒科技有限公司，上海）
超低溫冰箱（-80℃）（Thermo公司，德國）
3、實驗方法
（1）外周血DNA提取
1）取EDTA抗凝全血100 μl，加無菌雙蒸水200 μl混勻；
2）加入6 mol/L碘化鈉200 μl，混勻；
3）加入氯仿/異戊醇（24:1，v/v）400 μl，反復混勻；然后12000 rpm離心10 min，小心吸出上清液置另一離心管；
4）向上清液加入異丙醇300 μl混勻，室溫靜置3 min，然后于12000 rpm離心10 min，棄上清；
5）加入70%乙醇500 μl，12000 rpm離心3 min，倒掉乙醇；
6）重復步驟（5）一次，倒置片刻；
7）待管壁晾干后，加入TE緩沖液40 μl溶解DNA，用吸管吹打使DNA充分溶解。
（2）DNA濃度測定及純化
取樣品20 μl，加超純水至600 μl，充分混勻，用紫外分光光度計測定波長分別為260 nm、280 nm、320 nm時的OD值，計算DNA的濃度和純度。
DNA濃度 (μg/ml)=(OD260-OD320)×50μg/ml×稀釋倍數(shù)(30)
DNA純度=(OD260-OD320)/(OD280-OD320)
DNA純度為1.8時表示純度好；<1.6時表示蛋白含量太高，應用氯仿/異戊醇抽提純化；>1.9時表示有RNA污染，可用RNA酶進行處理。
（3）PCR反應
1）引物設計
設計RUNX1rs2268277的PCR擴增引物，如表1所示。所有引物序列均經(jīng)NCBI Blast驗證其合理性與特異性。
表1 引物序列
2）PCR反應體系
PCR反應體系為25μl，包括DNA模板3μl，10×Taq buffer 2.5μl，dNTPs 2μl (0.25mmol/L)，上、下游引物各1μl(10μmol/L)，ExTaq? 0.15μl (5U/μl)，用ddH2O補充總體積至25μl。
3）PCR反應條件如表2所示
表2 PCR 反應條件
4、PCR產(chǎn)物的檢測：瓊脂糖凝膠電泳
制膠：稱取適量瓊脂糖，加入0.5×TBE溶液配制成1%的混懸液，在微波爐中加熱至完全溶解，加入終濃度為0.05 μl/ml的Goldview，充分混勻后倒入水平放置的膠模中，凝膠厚度約為5 mm，插上梳子，靜止20~30 min。
上樣：將制好的凝膠放入電泳槽，電泳緩沖液（同批次0.5×TBE）液面高出凝膠表面1~2 mm，取5 μl擴增產(chǎn)物與1 μl 6×Loading buffer混合后，依次加入加樣孔中；190 V電泳15 min。
5、結果
紫外燈下觀察電泳結果，并于凝膠成像系統(tǒng)上自動成像，結果如附圖1所示，利用本發(fā)明的引物對RUNXF/RUNXR及PCR方法，可以檢測鑒定RUNX1rs2268277基因多態(tài)性位點的基因型。
從臨床觀察來看，突變純合子對巰基嘌呤類藥物的不良反應發(fā)生率明顯高于突變雜合子，而突變純合子和突變雜合子這兩者的藥物不良反應發(fā)生率均強于野生型。
因此，可以利用本發(fā)明的引物對RUNXF/RUNXR及PCR方法檢測RUNX1rs2268277基因多態(tài)性位點的基因型，從而判斷檢測對象對巰基嘌呤類藥物的不良反應情況，進而指導個性化用藥。本發(fā)明提供了一種簡單易行且具有很強臨床應用價值的PCR方法及引物。
SEQUENCE LISTING
<110> 中山大學
<120> 一種檢測RUNX1rs2268277基因多態(tài)性的引物及其PCR方法
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<170> PatentIn version 3.3
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<212> DNA
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<213> 引物RUNXR
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