本發(fā)明涉及植物生物學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的草莓高效穩(wěn)定的遺傳轉(zhuǎn)化方法。

背景技術(shù)：

根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)法是草莓遺傳轉(zhuǎn)化的重要方法，它是以草莓的葉片、葉柄、原生質(zhì)體和愈傷組織等為外植體，經(jīng)農(nóng)桿菌浸染后，通過(guò)抗生素篩選、器官發(fā)生獲得再生植株，其中以“葉盤法”應(yīng)用的最為普遍。

傳統(tǒng)的“葉盤法”存在遺傳轉(zhuǎn)化效率低、雜菌污染嚴(yán)重、不定芽再生困難、容易產(chǎn)生嵌合體和假陽(yáng)性植株等問(wèn)題，從而導(dǎo)致篩選工作量大、轉(zhuǎn)基因植株獲取困難。而隨著草莓基因組學(xué)研究的深入，揭示基因功能及其表達(dá)時(shí)空性已成為后基因組時(shí)代的重要課題，轉(zhuǎn)基因技術(shù)作為研究基因功能的最有效的手段之一已發(fā)揮著越來(lái)越重要的作用。因此，建立一種高效穩(wěn)定的草莓遺傳轉(zhuǎn)化方法對(duì)批量驗(yàn)證基因功能就顯得尤為重要。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

為克服現(xiàn)有技術(shù)存在的上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明提供了一種根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的草莓高效穩(wěn)定的遺傳轉(zhuǎn)化方法，其優(yōu)化了遺傳轉(zhuǎn)化的步驟，從而大幅度提高了草莓轉(zhuǎn)基因效率，解決了傳統(tǒng)農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化效率低，易產(chǎn)生嵌合體，篩選困難，工作量大的問(wèn)題，極大的提高了遺傳轉(zhuǎn)化效率，同時(shí)顯著降低了再生芽的假陽(yáng)性率。

本發(fā)明解決上述技術(shù)問(wèn)題的技術(shù)方案如下：一種根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的草莓高效穩(wěn)定的遺傳轉(zhuǎn)化方法,其包括：

草莓無(wú)菌苗的預(yù)培養(yǎng)：取草莓無(wú)菌苗，獲得其葉盤或剪成小塊，置于M1培養(yǎng)基中進(jìn)行暗培養(yǎng)，獲得預(yù)培養(yǎng)葉片；

農(nóng)桿菌活化：取根癌農(nóng)桿菌陽(yáng)性單克隆于含抗生素的YEB液體培養(yǎng)基中，黑暗條件下振蕩培養(yǎng)，獲得菌液；取獲得的菌液離心收菌，獲得菌體沉淀；將獲得的菌體沉淀重懸于M2培養(yǎng)基中，振蕩培養(yǎng)，獲得用于侵染的菌液；

侵染：將獲得的所述預(yù)培養(yǎng)葉片置于所述用于侵染的菌液中，進(jìn)行侵染處理；

共培養(yǎng)：吸干經(jīng)侵染處理后的葉片表面的菌液，置于M3培養(yǎng)基中，進(jìn)行暗培養(yǎng)；

延遲篩選：用M4洗滌液洗滌經(jīng)共培養(yǎng)結(jié)束后的葉片，并吸干其表面的菌液，再接種于M5培養(yǎng)基上，進(jìn)行暗培養(yǎng)；

篩選：將延遲篩選結(jié)束后的葉片轉(zhuǎn)移至M6培養(yǎng)基中，光照和黑暗交替培養(yǎng)，培養(yǎng)結(jié)束后，切除壞死組織，將俞傷組織部分轉(zhuǎn)接于M7培養(yǎng)基中，光照和黑暗交替培養(yǎng)，直到分化出不定芽；

生根：待芽長(zhǎng)長(zhǎng)后，將其切下轉(zhuǎn)移至M8培養(yǎng)基中再培養(yǎng)，得到完整植株。

在上述技術(shù)方案的基礎(chǔ)上，本發(fā)明還可以做如下改進(jìn)。

進(jìn)一步，所述根癌農(nóng)桿菌為L(zhǎng)BA4404農(nóng)桿菌或GV3101農(nóng)桿菌。

進(jìn)一步，所述M3培養(yǎng)基的成分包括MS、B5維生素、3％蔗糖、0.25％植物凝膠、0.1～3mg/L激素、100μmol/L乙酰丁香酮及50～150μmol/L的а-硫辛酸，且其PH值為5.5。

采用上述進(jìn)一步方案的有益效果是：利用含有上述成分的M3培養(yǎng)基，通過(guò)加入適宜濃度的а-硫辛酸，能夠緩解農(nóng)桿菌浸染植物過(guò)程中產(chǎn)生的“氧爆反應(yīng)”，清除活性氧和自由基，減緩植物組織的褐化，促進(jìn)轉(zhuǎn)基因芽的再生。

進(jìn)一步，所述M5培養(yǎng)基的成分包括MS、B5維生素、3％蔗糖、0.25％植物凝膠、0.1～3mg/L激素、200～500mg/L抗生素及50～150μmol/L井岡霉素A，且其PH值為5.8。

采用上述進(jìn)一步方案的有益效果是：在草莓遺傳轉(zhuǎn)化過(guò)程中添加適宜濃度的а-硫辛酸和井岡霉素A，極大的提高了遺傳轉(zhuǎn)化效率，同時(shí)顯著降低了再生芽的假陽(yáng)性率，轉(zhuǎn)化效率是傳統(tǒng)的農(nóng)桿菌介導(dǎo)法的兩倍以上。

進(jìn)一步，所述M1培養(yǎng)基的成分包括MS、B5維生素、3％蔗糖、0.25％植物凝膠和0.1～3mg/L激素；且其PH值為5.8。

進(jìn)一步，所述M2培養(yǎng)基的成分包括MS、B5維生素、2％蔗糖及100μmol/L的乙酰丁香酮，且其PH值為5.5。

進(jìn)一步，所述M4洗滌液的成分包括MS、B5維生素、3％蔗糖及200～500mg/L抗生素，且其PH值為5.8。

進(jìn)一步，所述M6、M7培養(yǎng)基的成分均包括MS、B5維生素、3％蔗糖、0.25％植物凝膠、0.1～3mg/L激素及200～500mg/L抗生素，且M6、M7培養(yǎng)基的PH值均為5.8；其中所述M6中，所加入的抗生素包括5mg/L的潮霉素或10mg/L的硫酸卡那霉素，所述M7中，所加入的抗生素包括10mg/L潮霉素或30mg/L硫酸卡那霉素。

進(jìn)一步，所述M8培養(yǎng)基的成分包括MS或1/2MS、0～0.5mg/L激素和1～5mg/L抗生素，其PH為5.8。

進(jìn)一步，在延遲篩選培養(yǎng)中，接種于M5培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)的條件是22℃條件下暗培養(yǎng)6天；在篩選培養(yǎng)中，所述光照和黑暗交替培養(yǎng)具體為16小時(shí)的光照培養(yǎng)和8小時(shí)的黑暗培養(yǎng)交替培養(yǎng)15～20天，在交替培養(yǎng)15～20天后再重復(fù)篩選培養(yǎng)過(guò)程一次。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明提供的根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的草莓高效穩(wěn)定的遺傳轉(zhuǎn)化方法，其通過(guò)在共培養(yǎng)和延遲篩選階段加入а-硫辛酸(Lipoic acid)和井岡霉素A(Validamycin A)，同時(shí)優(yōu)化遺傳轉(zhuǎn)化步驟，從而大幅度提高了草莓轉(zhuǎn)基因效率，解決了傳統(tǒng)農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化效率低，易產(chǎn)生嵌合體，篩選困難，工作量大的問(wèn)題，極大的提高了遺傳轉(zhuǎn)化效率，同時(shí)顯著降低了再生芽的假陽(yáng)性率。

附圖說(shuō)明

圖1為本發(fā)明提供的根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的草莓高效穩(wěn)定的遺傳轉(zhuǎn)化方法的流程圖；

圖2為‘紅顏’草莓遺傳轉(zhuǎn)化過(guò)程的效果圖；

圖3為‘豐香’草莓轉(zhuǎn)基因植株的效果圖。

具體實(shí)施方式

以下結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明的原理和特征進(jìn)行描述，所舉實(shí)例只用于解釋本發(fā)明，并非用于限定本發(fā)明的范圍。需要說(shuō)明的是，在不沖突的情況下，本申請(qǐng)的實(shí)施例及實(shí)施例中的特征可以相互組合。

如圖1所示，本實(shí)施例示例性地給出了根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的草莓高效穩(wěn)定的遺傳轉(zhuǎn)化方法,具體包括：

S1：草莓無(wú)菌苗的預(yù)培養(yǎng)：取草莓無(wú)菌苗，獲得其葉盤或剪成小塊，置于M1培養(yǎng)基中進(jìn)行暗培養(yǎng)，獲得預(yù)培養(yǎng)葉片；

S2：農(nóng)桿菌活化：取根癌農(nóng)桿菌陽(yáng)性單克隆于含抗生素的YEB液體培養(yǎng)基中，黑暗條件下振蕩培養(yǎng)，獲得菌液；取獲得的菌液離心收菌，獲得菌體沉淀；將獲得的菌體沉淀重懸于M2培養(yǎng)基中，振蕩培養(yǎng)，獲得用于侵染的菌液；

S3：侵染：將獲得的所述預(yù)培養(yǎng)葉片置于所述用于侵染的菌液中，進(jìn)行侵染處理；

S4：共培養(yǎng)：吸干經(jīng)侵染處理后的葉片表面的菌液，置于M3培養(yǎng)基中，進(jìn)行暗培養(yǎng)；

S5：延遲篩選：用M4洗滌液洗滌經(jīng)共培養(yǎng)結(jié)束后的葉片，并吸干其表面的菌液，再接種于M5培養(yǎng)基上，進(jìn)行暗培養(yǎng)；

S6：篩選：將延遲篩選結(jié)束后的葉片轉(zhuǎn)移至M6培養(yǎng)基中，光照和黑暗交替培養(yǎng)，培養(yǎng)結(jié)束后，切除壞死組織，將俞傷組織部分轉(zhuǎn)接于M7培養(yǎng)基中，再光照和黑暗交替培養(yǎng)，直到分化出不定芽；

S7：生根：待芽長(zhǎng)長(zhǎng)后，將其切下轉(zhuǎn)移至M8培養(yǎng)基中再培養(yǎng)，得到完整植株。

具體地，在預(yù)培養(yǎng)階段，取10～30天葉齡的草莓無(wú)菌組培苗，沿垂直于主葉脈的方向剪成5毫米x 3毫米的條狀小塊或用打孔器打出直徑約為5毫米的葉盤，置于含25毫升M1培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中，以葉片遠(yuǎn)軸面與培養(yǎng)基接觸，每個(gè)培養(yǎng)皿中放10-16個(gè)，封口，25℃暗培養(yǎng)3天。

在農(nóng)桿菌活化階段，挑農(nóng)桿菌陽(yáng)性單克隆于25毫升含抗生素的YEB液體培養(yǎng)基中，黑暗條件下28℃，150轉(zhuǎn)/分鐘振蕩培養(yǎng)20-24小時(shí)，取6毫升菌液于6000轉(zhuǎn)/分鐘離心5分鐘收菌，將菌體沉淀重懸于25毫升M2培養(yǎng)基中，28℃，150轉(zhuǎn)/分鐘振蕩培養(yǎng)3-4小時(shí)至OD₆₀₀＝0.1～0.3(約10⁸cfu/ml)，此即為用于浸染的菌液。

在侵染階段，將預(yù)培養(yǎng)3天后的葉片放入制備好的農(nóng)桿菌懸浮液中，浸染15-20分鐘，每隔5分鐘輕輕搖動(dòng)幾次。

在共培養(yǎng)階段，將浸染結(jié)束后葉片放在濾紙上吸干表面的菌液，置于含25毫升M3培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中，每個(gè)培養(yǎng)皿放10-16個(gè)，封口，25℃暗培養(yǎng)2-3天。

在延遲篩選階段，將共培養(yǎng)結(jié)束后的葉片用M4洗滌液洗滌3次，每次20分鐘，期間輕搖一次，然后置于濾紙上吸干表面菌液，接種于含25毫升M5培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿上，每個(gè)培養(yǎng)皿放10-16個(gè)，封口，22℃暗培養(yǎng)6天。

在篩選階段，將延遲篩選結(jié)束后的葉片轉(zhuǎn)移至含40毫升M6篩選培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中，每個(gè)培養(yǎng)瓶放10個(gè)，培養(yǎng)條件為16小時(shí)(光)/8小時(shí)(暗)，光強(qiáng)約為2200勒克斯，溫度22℃，培養(yǎng)15-20天，重復(fù)該操作一次，即，將培養(yǎng)15-20天后的葉片再轉(zhuǎn)移至含40毫升M6篩選培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中，每個(gè)培養(yǎng)瓶放10個(gè)，培養(yǎng)條件為16小時(shí)(光)/8小時(shí)(暗)，光強(qiáng)約為2200勒克斯，溫度22℃，培養(yǎng)15-20天，完成培養(yǎng)。培養(yǎng)結(jié)束后，切除壞死的組織，將綠色的愈傷組織部分轉(zhuǎn)接于新的篩選培養(yǎng)基M7中，培養(yǎng)條件相同，培養(yǎng)15-20天，之后每15-20天轉(zhuǎn)一次瓶，直到分化出不定芽。

在生根培養(yǎng)階段，待再生芽長(zhǎng)到2cm以上，則將其從基部切下轉(zhuǎn)移至M8培養(yǎng)基中再培養(yǎng)，得到完整植株。

在本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方式中，所采用的根癌農(nóng)桿菌為L(zhǎng)BA4404農(nóng)桿菌或GV3101農(nóng)桿菌。在草莓無(wú)菌苗的預(yù)培養(yǎng)階段，所采用的M1培養(yǎng)基的成分包括MS、B5維生素、3％蔗糖、0.25％植物凝膠和0.1～3mg/L激素；且其PH值為5.8。在農(nóng)桿菌活化階段，所采用的M2培養(yǎng)基的成分包括MS、B5維生素、2％蔗糖及100μmol/L的乙酰丁香酮，且其PH值為5.5。在共培養(yǎng)階段，所采用的M3培養(yǎng)基的成分包括MS無(wú)機(jī)鹽、B5維生素、3％蔗糖、0.25％植物凝膠、0.1～3mg/L激素、100μmol/L乙酰丁香酮及50～150μmol/L的а-硫辛酸，且其PH值為5.5。在延遲篩選階段，所采用的M4洗滌液的成分包括MS、B5維生素、3％蔗糖及200～500mg/L抗生素，且其PH值為5.8；所采用的M5培養(yǎng)基的成分包括MS、B5維生素、3％蔗糖、0.25％植物凝膠、0.1～3mg/L激素、200～500mg/L抗生素及50～150μmol/L井岡霉素A，且其PH值為5.8。在篩選階段，所采用的M6培養(yǎng)基的成分包括MS、B5維生素、3％蔗糖、0.25％植物凝膠、0.1～3mg/L激素、200～500mg/L抗生素及5mg/L潮霉素或10mg/L硫酸卡那霉素；所采用的M7培養(yǎng)基的成分包括MS、B5維生素、3％蔗糖、0.25％植物凝膠、0.1～3mg/L激素、200～500mg/L抗生素及10mg/L潮霉素或30mg/L硫酸卡那霉素。在生根階段，所采用的M8培養(yǎng)基的成分包括MS或1/2MS、0～0.5mg/L激素和1～5mg/L抗生素，其PH為5.8。

需要說(shuō)明的是，在上述階段中，抗生素、а-硫辛酸和井岡霉素A全部采用過(guò)濾滅菌后待培養(yǎng)基冷卻至60℃左右加入。所使用的根癌農(nóng)桿菌為L(zhǎng)BA4404或GV3101；轉(zhuǎn)基因的質(zhì)粒為pBI121(硫酸卡那霉素抗性)、pCAMBIA1301(潮霉素抗性)、pCAMBIA1302(潮霉素抗性)或以其為骨架改造而成的質(zhì)粒，使用其它抗性的質(zhì)粒時(shí)需要改變?yōu)閷?duì)應(yīng)的抗生素。

采用本發(fā)明提供的遺傳轉(zhuǎn)化方法，本實(shí)施例分別以‘紅顏’草莓和‘豐香’草莓的轉(zhuǎn)基因遺傳轉(zhuǎn)化為例，實(shí)驗(yàn)其遺傳轉(zhuǎn)化效果。

示例1，以‘紅顏’草莓為例，采用本發(fā)明提供的遺傳轉(zhuǎn)化方法，實(shí)驗(yàn)其遺傳轉(zhuǎn)化效果。

1)預(yù)培養(yǎng)：取10-30天葉齡的‘紅顏’草莓無(wú)菌組培苗，用打孔器打出直徑約為5毫米的葉盤，置于含25毫升M1培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中，以葉片遠(yuǎn)軸面與培養(yǎng)基接觸，每個(gè)培養(yǎng)皿中放16個(gè)，封口，25℃暗培養(yǎng)3天；如圖2中的a所示，為預(yù)培養(yǎng)階段的‘紅顏’草莓遺傳轉(zhuǎn)化效果圖。

2)農(nóng)桿菌活化：挑農(nóng)桿菌GV3101陽(yáng)性單克隆于25毫升含抗生素(50mg/L硫酸卡那霉素+20mg/L利福平)的YEB液體培養(yǎng)基中，黑暗條件下28℃，150轉(zhuǎn)/分鐘振蕩培養(yǎng)20小時(shí)，取6毫升菌液于6000轉(zhuǎn)/分鐘離心5分鐘收菌，將菌體沉淀重懸于25毫升M2培養(yǎng)基中，28℃，150轉(zhuǎn)/分鐘振蕩培養(yǎng)3-4小時(shí)至OD₆₀₀＝0.1(約10⁸cfu/ml)，此即為用于浸染的菌液；

3)浸染：將預(yù)培養(yǎng)3天后的葉片放入制備好的農(nóng)桿菌懸浮液中，浸染20分鐘，每隔5分鐘輕輕搖動(dòng)幾次；

4)共培養(yǎng)：浸染結(jié)束后將葉片放在濾紙上吸干表面的菌液，置于含25毫升M3培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中，每個(gè)培養(yǎng)皿放16個(gè)，封口，25℃暗培養(yǎng)2天；如圖2中的b所示，為共培養(yǎng)階段的‘紅顏’草莓遺傳轉(zhuǎn)化效果圖。

5)延遲篩選：將共培養(yǎng)結(jié)束后的葉片用M4洗滌3次，每次20分鐘，期間輕搖一次，然后置于濾紙上吸干表面菌液，接種于含25毫升M5培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿上，每個(gè)培養(yǎng)皿放16個(gè)，封口，22℃暗培養(yǎng)6天；如圖2中的c所示，為延遲篩選階段的‘紅顏’草莓遺傳轉(zhuǎn)化效果圖。

6)篩選：將延遲篩選結(jié)束后的葉片轉(zhuǎn)移至含40毫升M6篩選培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中，每個(gè)培養(yǎng)瓶放10個(gè)，培養(yǎng)條件為16小時(shí)(光)/8小時(shí)(暗)，光強(qiáng)約為2200勒克斯，溫度22℃，培養(yǎng)20天，重復(fù)該操作一次。培養(yǎng)結(jié)束后，切除壞死的組織，將綠色的愈傷組織部分轉(zhuǎn)接于新的M7篩選培養(yǎng)基中，培養(yǎng)條件相同，培養(yǎng)20天，之后每20天轉(zhuǎn)一次瓶，直到分化出不定芽；如圖2中的d所示，為篩選階段的‘紅顏’草莓遺傳轉(zhuǎn)化效果圖。

7)生根：待再生芽長(zhǎng)到2cm以上，則將其從基部切下轉(zhuǎn)移至M8培養(yǎng)基中再培養(yǎng)，得到完整植株。如圖2中的e所示，為再生芽的培養(yǎng)及生根階段的‘紅顏’草莓遺傳轉(zhuǎn)化效果圖。如圖2中的f所示，為獲得的‘紅顏’草莓轉(zhuǎn)基因植株。

需要說(shuō)明的是：本示例的方法中使用的根癌農(nóng)桿菌為GV3101；轉(zhuǎn)基因的質(zhì)粒為pCAMBIA1301。

上述示例的方法中，M1培養(yǎng)基的組成為：MS無(wú)機(jī)鹽+B5維生素+3％蔗糖+0.25％植物凝膠+噻苯隆(TDZ)2.0mg/L+吲哚丁酸(IBA)0.5mg/L，pH＝5.8；M2培養(yǎng)基的組成為：MS無(wú)機(jī)鹽+B5維生素+2％蔗糖+100微摩爾/升乙酰丁香酮，pH＝5.5；M3培養(yǎng)基的組成為：MS無(wú)機(jī)鹽+B5維生素+3％蔗糖+0.25％植物凝膠+TDZ 2.0mg/L+IBA 0.5mg/L+100μmol/L乙酰丁香酮+50μmol/Lа-硫辛酸，pH＝5.5；M4洗滌液的組成為：MS無(wú)機(jī)鹽+B5維生素+3％蔗糖+250mg/L 特美汀(Timentin)+250mg/L頭孢噻肟鈉(Cefotaxime)，pH＝5.8；M5培養(yǎng)基的組成為：MS無(wú)機(jī)鹽+B5維生素+3％蔗糖+0.25％植物凝膠+TDZ 2.0mg/L+IBA 0.5mg/L+250mg/L Timentin+250mg/L Cefotaxime+100μmol/L井岡霉素A，pH＝5.8；M6培養(yǎng)基的組成為：MS無(wú)機(jī)鹽+B5維生素+3％蔗糖+0.25％植物凝膠+TDZ 2.0mg/L+IBA 0.5mg/L+250mg/L Timentin+250mg/L Cefotaxime+5mg/L潮霉素，pH＝5.8；M7培養(yǎng)基的組成為：MS無(wú)機(jī)鹽+B5維生素+3％蔗糖+0.25％植物凝膠+TDZ 2.0mg/L+IBA 0.5mg/L+250mg/L Timentin+250mg/L Cefotaxime+10mg/L潮霉素，pH＝5.8；M8培養(yǎng)基的組成為：MS+0.5mg/L的6-芐氨基腺嘌呤(6-BA)+0.1mg/L的萘乙酸(NAA)+1mg/L潮霉素，pH＝5.8。

示例2，以‘豐香’草莓為例，采用本發(fā)明提供的遺傳轉(zhuǎn)化方法，實(shí)驗(yàn)其遺傳轉(zhuǎn)化效果。

1)預(yù)培養(yǎng)：取10-30天葉齡的‘豐香’草莓無(wú)菌組培苗，用打孔器打出直徑約為5毫米的葉盤，置于含25毫升M1培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中，以葉片遠(yuǎn)軸面與培養(yǎng)基接觸，每個(gè)培養(yǎng)皿中放16個(gè)，封口，25℃暗培養(yǎng)3天；

2)農(nóng)桿菌活化：挑農(nóng)桿菌LBA4404陽(yáng)性單克隆于25毫升含抗生素(50mg/L硫酸卡那霉素+20mg/L利福平)的YEB液體培養(yǎng)基中，黑暗條件下28℃，150轉(zhuǎn)/分鐘振蕩培養(yǎng)24小時(shí)，取6毫升菌液于6000轉(zhuǎn)/分鐘離心5分鐘收菌，將菌體沉淀重懸于25毫升M2培養(yǎng)基中，28℃，150轉(zhuǎn)/分鐘振蕩培養(yǎng)3-4小時(shí)至OD₆₀₀＝0.3(約10⁸cfu/ml)，此即為用于浸染的菌液；

3)浸染：將預(yù)培養(yǎng)3天后的葉片放入制備好的農(nóng)桿菌懸浮液中，浸染15分鐘，每隔5分鐘輕輕搖動(dòng)幾次；

4)共培養(yǎng)：浸染結(jié)束后將葉片放在濾紙上吸干表面的菌液，置于含25毫升M3培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中，每個(gè)培養(yǎng)皿放16個(gè)，封口，25℃暗培養(yǎng)3天；

5)延遲篩選：將共培養(yǎng)結(jié)束后的葉片用M4洗滌3次，每次20分鐘，期間輕搖一次，然后置于濾紙上吸干表面菌液，接種于含25毫升M5培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿上，每個(gè)培養(yǎng)皿放16個(gè)，封口，22℃暗培養(yǎng)6天；

6)篩選：將延遲篩選結(jié)束后的葉片轉(zhuǎn)移至含40毫升M6篩選培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中，每個(gè)培養(yǎng)瓶放10個(gè)，培養(yǎng)條件為16小時(shí)(光)/8小時(shí)(暗)，光強(qiáng)約為2200勒克斯，溫度22℃，培養(yǎng)15天，重復(fù)該操作一次。培養(yǎng)結(jié)束后，切除壞死的組織，將綠色的愈傷組織部分轉(zhuǎn)接于新的M7篩選培養(yǎng)基中，培養(yǎng)條件相同，培養(yǎng)15天，之后每15天轉(zhuǎn)一次瓶，直到分化出不定芽；

7)生根：待再生芽長(zhǎng)到2cm以上，則將其從基部切下轉(zhuǎn)移至M8培養(yǎng)基中再培養(yǎng)，得到完整植株。如圖3所示，為獲得的‘豐香’草莓轉(zhuǎn)基因植株。

需要說(shuō)明的是：本示例中的方法所使用的根癌農(nóng)桿菌為L(zhǎng)BA4404；轉(zhuǎn)基因的質(zhì)粒為pBI121。

上述方法中，M1培養(yǎng)基的組成為：MS無(wú)機(jī)鹽+B5維生素+3％蔗糖+0.25％植物凝膠+TDZ 2.0mg/L+IBA 0.6mg/L，pH＝5.8；M2培養(yǎng)基的組成為：MS無(wú)機(jī)鹽+B5維生素+2％蔗糖+100微摩爾/升乙酰丁香酮，pH＝5.5；M3培養(yǎng)基的組成為：MS無(wú)機(jī)鹽+B5維生素+3％蔗糖+0.25％植物凝膠+TDZ 2.0mg/L+IBA0.6mg/L+100微摩爾/升乙酰丁香酮+50微摩爾/升а-硫辛酸，pH＝5.5；M4洗滌液的組成為：MS無(wú)機(jī)鹽+B5維生素+3％蔗糖+250mg/LTimentin+250mg/LCefotaxime，pH＝5.8；M5培養(yǎng)基的組成為：MS無(wú)機(jī)鹽+B5維生素+3％蔗糖+0.25％植物凝膠+TDZ 2.0mg/L+IBA 0.6mg/L+250mg/LTimentin+250mg/LCefotaxime+100微摩爾/升井岡霉素A，pH＝5.8；M6培養(yǎng)基的組成為：MS無(wú)機(jī)鹽+B5維生素+3％蔗糖+0.25％植物凝膠+TDZ 2.0mg/L+IBA 0.6mg/L+250mg/LTimentin+250mg/LCefotaxime+10mg/L硫酸卡那霉素，pH＝5.8；M7培養(yǎng)基的組成為：MS無(wú)機(jī)鹽+B5維生素+3％蔗糖+0.25％植物凝膠+TDZ 0.6mg/L+IBA 0.6mg/L+250mg/L Timentin+250mg/L Cefotaxime+30mg/L硫酸卡那霉素，pH＝5.8；M8培養(yǎng)基的組成為：MS+6-BA 0.5mg/L+IBA 0.1mg/L+5mg/L硫酸卡那霉素，pH＝5.8。

綜上，本發(fā)明提出的草莓遺傳轉(zhuǎn)化方法，其優(yōu)點(diǎn)是：

1.遺傳轉(zhuǎn)化效率高，假陽(yáng)性率低。本發(fā)明通過(guò)在草莓遺傳轉(zhuǎn)化過(guò)程中添加適宜濃度的а-硫辛酸和井岡霉素A，極大的提高了遺傳轉(zhuǎn)化效率，同時(shí)顯著降低了再生芽的假陽(yáng)性率，轉(zhuǎn)化效率是傳統(tǒng)的農(nóng)桿菌介導(dǎo)法的兩倍以上。

2.促進(jìn)轉(zhuǎn)基因芽的再生。本發(fā)明中添加的а-硫辛酸能夠緩解農(nóng)桿菌浸染植物過(guò)程中產(chǎn)生的“氧爆反應(yīng)”，清除活性氧和自由基，減緩植物組織的褐化，促進(jìn)轉(zhuǎn)基因芽的再生。

3.降低嵌合體的產(chǎn)生。本發(fā)明中采用逐步提高篩選抗生素濃度的方法，能夠較好的避免嵌合體的產(chǎn)生，同時(shí)又不會(huì)對(duì)不定芽的誘導(dǎo)產(chǎn)生顯著影響。

以上所述僅為本發(fā)明的較佳實(shí)施例，并不用以限制本發(fā)明，凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)，所作的任何修改、等同替換、改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。