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一種根癌農(nóng)桿菌介導的草莓高效穩(wěn)定的遺傳轉(zhuǎn)化方法與流程

文檔序號:12412200閱讀:來源:國知局

技術(shù)特征:

1.一種根癌農(nóng)桿菌介導的草莓高效穩(wěn)定的遺傳轉(zhuǎn)化方法,其特征在于,包括:

草莓無菌苗的預培養(yǎng):取草莓無菌苗,獲得其葉盤或剪成小塊,置于M1培養(yǎng)基中進行暗培養(yǎng),獲得預培養(yǎng)葉片;

農(nóng)桿菌活化:取根癌農(nóng)桿菌陽性單克隆于含抗生素的YEB液體培養(yǎng)基中,黑暗條件下振蕩培養(yǎng),獲得菌液;取獲得的菌液離心收菌,獲得菌體沉淀;將獲得的菌體沉淀重懸于M2培養(yǎng)基中,振蕩培養(yǎng),獲得用于侵染的菌液;

侵染:將獲得的所述預培養(yǎng)葉片置于所述用于侵染的菌液中,進行侵染處理;

共培養(yǎng):吸干經(jīng)侵染處理后的葉片表面的菌液,置于M3培養(yǎng)基中,進行暗培養(yǎng);

延遲篩選:用M4洗滌液洗滌經(jīng)共培養(yǎng)結(jié)束后的葉片,并吸干其表面的菌液,再接種于M5培養(yǎng)基上,進行暗培養(yǎng);

篩選:將延遲篩選結(jié)束后的葉片轉(zhuǎn)移至M6培養(yǎng)基中,光照和黑暗交替培養(yǎng),培養(yǎng)結(jié)束后,切除壞死組織,將俞傷組織部分轉(zhuǎn)接于M7培養(yǎng)基中,再光照和黑暗交替培養(yǎng),直到分化出不定芽;

生根:待芽長長后,將其切下轉(zhuǎn)移至M8培養(yǎng)基中再培養(yǎng),得到完整植株。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的根癌農(nóng)桿菌介導的草莓高效穩(wěn)定的遺傳轉(zhuǎn)化方法,其特征在于,所述根癌農(nóng)桿菌為LBA4404農(nóng)桿菌或GV3101農(nóng)桿菌。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的根癌農(nóng)桿菌介導的草莓高效穩(wěn)定的遺傳轉(zhuǎn)化方法,其特征在于,所述M3培養(yǎng)基的成分包括MS無機鹽、B5維生素、3%蔗糖、0.25%植物凝膠、0.1~3mg/L激素、100μmol/L乙酰丁香酮及50~150μmol/L的а-硫辛酸,且其PH值為5.5。

4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的根癌農(nóng)桿菌介導的草莓高效穩(wěn)定的遺傳轉(zhuǎn)化方法,其特征在于,所述M5培養(yǎng)基的成分包括MS、B5維生素、3%蔗糖、0.25%植物凝膠、0.1~3mg/L激素、200~500mg/L抗生素及50~150μmol/L井岡霉素A,且其PH值為5.8。

5.根據(jù)權(quán)利要求1至4任一項所述的根癌農(nóng)桿菌介導的草莓高效穩(wěn)定的遺傳轉(zhuǎn)化方法,其特征在于,所述M1培養(yǎng)基的成分包括MS、B5維生素、3%蔗糖、0.25%植物凝膠和0.1~3mg/L激素;且其PH值為5.8。

6.根據(jù)權(quán)利要求1至4任一項所述的根癌農(nóng)桿菌介導的草莓高效穩(wěn)定的遺傳轉(zhuǎn)化方法,其特征在于,所述M2培養(yǎng)基的成分包括MS、B5維生素、2%蔗糖及100μmol/L的乙酰丁香酮,且其PH值為5.5。

7.根據(jù)權(quán)利要求1至4任一項所述的根癌農(nóng)桿菌介導的草莓高效穩(wěn)定的遺傳轉(zhuǎn)化方法,其特征在于,所述M4洗滌液的成分包括MS、B5維生素、3%蔗糖及200~500mg/L抗生素,且其PH值為5.8。

8.根據(jù)權(quán)利要求1至4任一項所述的根癌農(nóng)桿菌介導的草莓高效穩(wěn)定的遺傳轉(zhuǎn)化方法,其特征在于,所述M6、M7培養(yǎng)基的成分均包括MS、B5維生素、3%蔗糖、0.25%植物凝膠、0.1~3mg/L激素及200~500mg/L抗生素,且M6、M7培養(yǎng)基的PH值均為5.8;其中所述M6中,所加入的抗生素包括5mg/L的潮霉素或10mg/L的硫酸卡那霉素,所述M7中,所加入的抗生素包括10mg/L潮霉素或30mg/L硫酸卡那霉素。

9.根據(jù)權(quán)利要求1至4任一項所述的根癌農(nóng)桿菌介導的草莓高效穩(wěn)定的遺傳轉(zhuǎn)化方法,其特征在于,所述M8培養(yǎng)基的成分包括MS或1/2MS、0~0.5mg/L激素和1~5mg/L抗生素,其PH為5.8。

10.根據(jù)權(quán)利要求1至4任一項所述的根癌農(nóng)桿菌介導的草莓高效穩(wěn)定的遺傳轉(zhuǎn)化方法,其特征在于,在延遲篩選培養(yǎng)中,接種于M5培養(yǎng)基上進行培養(yǎng)的條件是22℃條件下暗培養(yǎng)6天;在篩選培養(yǎng)中,所述光照和黑暗交替培養(yǎng)具體為16小時的光照培養(yǎng)和8小時的黑暗培養(yǎng)交替培養(yǎng)15~20天,在交替培養(yǎng)15~20天后再重復篩選培養(yǎng)過程一次。

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