本發(fā)明涉及微生物發(fā)酵領(lǐng)域，具體涉及乳桿菌混合發(fā)酵后應(yīng)用熒光定量PCR (Q-PCR)檢測(cè)混合益生菌中益生菌種類(lèi)和含量的方法。該方法可以用于菌體混合發(fā)酵后，對(duì)發(fā)酵液中各種菌體的生長(zhǎng)情況及生長(zhǎng)量作出定性、定量的有效評(píng)價(jià)。

背景技術(shù)：

益生菌是一類(lèi)定植于人體腸道、生殖系統(tǒng)內(nèi)，能產(chǎn)生確切健康功效從而改善宿主微生態(tài)平衡，對(duì)人體健康有重要作用的活的微生物的總稱(chēng)，廣泛應(yīng)用于食品、保健品和藥品生產(chǎn)中。近年來(lái)，腸道微生物的研究越來(lái)越受到生物界的重視，異軍突起成為了熱門(mén)的研究領(lǐng)域?，F(xiàn)已有大量獻(xiàn)報(bào)道腸道微生物中的有益菌在預(yù)防和治療疾病、改善胃腸環(huán)境等方面有顯著作用。目前世界上研究的功能最強(qiáng)大的產(chǎn)品主要是復(fù)合活性益生菌，其廣泛應(yīng)用于生物工程、工農(nóng)業(yè)、食品安全以及生命健康領(lǐng)域。本發(fā)明研究發(fā)現(xiàn)復(fù)合乳桿菌發(fā)酵能夠調(diào)節(jié)腸道中微生物的平衡并且還能促進(jìn)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收。

在正常的情況下，我們腸道內(nèi)的有益菌群和有害菌群是處于一個(gè)相對(duì)平衡的狀態(tài)的，它們相互制約、相互依賴(lài)地共存，維系著人體微生態(tài)的平衡。一旦腸道內(nèi)菌群失去平衡，即有害菌群占優(yōu)勢(shì)時(shí)，食物中的蛋白質(zhì)及其它物質(zhì)會(huì)被轉(zhuǎn)化成有害物質(zhì)，這些物質(zhì)會(huì)引起一些疾病發(fā)生，最常見(jiàn)的就是便秘、腹瀉等。便秘的發(fā)生與結(jié)腸的PH值息息相關(guān)，有益菌通過(guò)降低結(jié)腸的pH值使之偏向于酸性，降低有害菌群的數(shù)量，調(diào)節(jié)腸道的正常蠕動(dòng)，從而改善便秘。腹瀉是腸道內(nèi)菌群紊亂引起的排泄異常極端癥狀，嚴(yán)重時(shí)腹瀉會(huì)引起脫水和身體電解質(zhì)紊亂等，長(zhǎng)期的慢性腹瀉還會(huì)導(dǎo)致貧血、維生素缺乏、營(yíng)養(yǎng)不良、抵抗力下降等。益生菌可迅速緩解腹瀉，產(chǎn)酸，創(chuàng)造出一個(gè)不利于有害病毒和細(xì)菌存在的環(huán)境，抑制病原微生物的生存與生長(zhǎng)；在腸粘膜形成緊密的微生物膜，阻擋致病菌入侵。

目前對(duì)多菌復(fù)合的發(fā)酵乳樣本中乳桿菌的定性、定量檢測(cè)方面缺乏科學(xué)、合理、快速的檢測(cè)方法。傳統(tǒng)生理生化辦法易受選擇培養(yǎng)基、培養(yǎng)條件、菌種特性等因素影響檢測(cè)效率有限制。乳酸菌活菌數(shù)量是評(píng)價(jià)活性乳酸菌制晶質(zhì)量的重要指標(biāo)，平板菌落計(jì)數(shù)法是微生物學(xué)中最常見(jiàn)、最標(biāo)準(zhǔn)的一種活菌計(jì)數(shù)方法，但操作繁瑣．耗時(shí)費(fèi)力。在分子生物學(xué)檢測(cè)方法中，熒光定量 PCR 技術(shù)更因具有快速、可定量、靈敏度高、重復(fù)性好、能檢出死活細(xì)菌等特點(diǎn)成為了腸道微生態(tài)研究中重要的分子生物學(xué)方法之一。

利用熒光定量PCR檢測(cè)混合益生菌，熒光定量 PCR 技術(shù)因具有快速、可定量、靈敏度高、重復(fù)性好、能檢出死活細(xì)菌等特點(diǎn)成為了腸道微生態(tài)研究中重要的分子生物學(xué)方法之一。雖然國(guó)內(nèi)外已有不少關(guān)于定量 PCR 檢測(cè)方法建立與應(yīng)用的報(bào)道，但系統(tǒng)的建立多種腸道菌群定量 PCR檢測(cè)方法的研究較少。因此，本發(fā)明研究以腸道細(xì)菌16S rRNA為目的基因，引入對(duì) PCR 反應(yīng)影響更小的SYBR-Green I熒光染料，旨在系統(tǒng)的建立用于檢測(cè)唾液乳桿菌、發(fā)酵乳桿菌、植物乳桿菌、鼠李糖乳桿菌、短雙歧桿菌、副干酪乳桿菌、干酪乳桿菌、糞腸乳桿菌、納豆芽孢桿菌、保加利亞乳桿菌以及腸道菌群總量的定量 PCR 方法，以期為腸道菌群的研究提供快速、特異、可定量的檢測(cè)手段，為微生物相關(guān)的衛(wèi)生安全性評(píng)價(jià)，益生菌開(kāi)發(fā)以及其他與腸道菌群有關(guān)的研究提供技術(shù)支持。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

為了解決現(xiàn)有技術(shù)存在的問(wèn)題，本發(fā)明的目的是提供一種檢測(cè)混合益生菌中菌種類(lèi)型和含量的方法。

為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明目的，本發(fā)明提供了一種利用Q-PCR檢測(cè)混合益生菌中菌種類(lèi)型和含量的方法，所述方法為：將混合益生菌在MRS培養(yǎng)基中發(fā)酵，進(jìn)行Q-PCR檢測(cè)。

前述方法具體技術(shù)方案包括以下步驟：

（1）MRS培養(yǎng)基配置：準(zhǔn)確稱(chēng)量葡萄糖、蛋白胨、牛肉膏、酵母膏 、乙酸鈉、磷酸氫二鉀、檸檬酸氫二銨、硫酸鎂、硫酸錳、吐溫-80 等藥品，攪拌至溶解，115 ℃滅菌30 min；

（2）益生菌的發(fā)酵培養(yǎng)：將各菌種單獨(dú)培養(yǎng)得種子液，將種子液等比混合后加至滅菌MRS培養(yǎng)基中；

（3）引物的設(shè)計(jì)：根據(jù)每種益生菌16S rRNA中DNA特異性基因片段設(shè)計(jì)引物；

（4）基因組的提?。豪?Easy Bacteria Genomic DNA Kit提取混合菌基因組

（5）熒光定量PCR：設(shè)置熒光閾值、PCR條件等參數(shù)，測(cè)量得到Ct值，換算成活菌數(shù)。

本發(fā)明以利用熒光定量PCR方法在混合益生菌中精確檢測(cè)益生菌。設(shè)計(jì)特異性引物，能夠準(zhǔn)確的檢測(cè)益生菌的生長(zhǎng)和活菌數(shù)，從而為之后制備益生菌微生態(tài)制劑提供定量依據(jù)。

附圖說(shuō)明

圖1：植物乳桿菌、干酪乳桿菌、保加利亞乳桿菌，糞腸乳桿菌、發(fā)酵乳桿菌、唾液乳桿菌、納豆芽孢桿菌單菌發(fā)酵菌的活菌數(shù)。

圖2: 植物乳桿菌、干酪乳桿菌、保加利亞乳桿菌，糞腸乳桿菌、發(fā)酵乳桿菌、唾液乳桿菌、納豆芽孢桿菌PCR后結(jié)果。

圖3: 熒光定量PCR方法檢測(cè)混合益生菌的結(jié)果。

具體實(shí)施方式

以下通過(guò)實(shí)例形式的具體實(shí)施方式對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的詳細(xì)說(shuō)明。

實(shí)施例1:

（1）混合益生菌的發(fā)酵：精準(zhǔn)稱(chēng)量MRS培養(yǎng)基中成分（葡萄糖、蛋白胨、牛肉膏、酵母膏、乙酸鈉、磷酸氫二鉀、檸檬酸氫二銨、硫酸鎂、硫酸錳、吐溫-80） 115 ℃滅菌30 min。將各菌種單獨(dú)培養(yǎng)得種子液，將種子液等比混合后，按照3%（V:V）的接種比接種到MRS發(fā)酵培養(yǎng)基中，發(fā)酵12小時(shí)；

（2）基因組提取：將步驟(1)制備得到的發(fā)酵溶液取出1ml，12000轉(zhuǎn)/min離心1分鐘，棄上清。先用500 μL 70%乙醇將菌體重懸，冰浴20min，加入溶菌酶重懸，37 ℃孵育60 min，加入蛋白酶，55℃孵育15min，加入RnaseA靜置2 min，加入Binding Buffer 400μL混勻，加入到離心柱中，棄掉流出液，先后用Wash Buffer和Clean Buffer洗滌兩次，用Elution Buffer 洗脫DNA。提取的基因組用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)；

（3）引物的設(shè)計(jì)：通過(guò)網(wǎng)站NCBI獲得各種菌體的16SrDNA序列，根據(jù)BLAET對(duì)比結(jié)果尋找出各個(gè)益生菌的特異性片段，使用軟件Primer5設(shè)計(jì)相應(yīng)引物；

（4）標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的建立：以鼠李糖乳桿菌為例，使用鼠李糖乳桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株，按照1）中所述培養(yǎng)方法培養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)菌株，按照2）中提取基因組的具體方法，獲得鼠李糖乳桿菌基因組。使用鼠李糖乳桿菌特異引物進(jìn)行PCR，獲得大量鼠李糖乳桿菌特異DNA片段，2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR條帶大小，并準(zhǔn)確切割條帶，通過(guò)膠回收以獲得高純度的PCR條帶。使用NANODROP 1000^TM UV/VIS Spectrophotometer 測(cè)定膠回收產(chǎn)物濃度。對(duì)該膠回收產(chǎn)物進(jìn)行梯度稀釋?zhuān)♂尯蟮母魈荻韧瑫r(shí)進(jìn)行熒光定量PCR，建立以log(DNA拷貝數(shù)/μL)為橫坐標(biāo)、Ct值為縱坐標(biāo)的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)；拷貝數(shù)計(jì)算公式如下：拷貝數(shù)=【6.02×10²³×膠回收產(chǎn)物濃度（g/μL）×模板體積（μL）】/【660×PCR片段堿基數(shù)（bp）】

（5）熒光定量PCR檢測(cè)：將混合基因組稀釋10⁵倍，熒光定量PCR反應(yīng)體系為模板1μL、10μM上游引物0.4μL、10μM下游引物0.4μL、superReal PreMix plus10μL、RoXReference Dye 0.4μL、ddH2O 7.8μL。PCR體積20μL。熒光定量PCR：94℃預(yù)變性30秒、94℃變性5秒、60℃退火34秒、72℃延伸10秒，變性退火延伸循環(huán)40次，得到Ct值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)和陽(yáng)性對(duì)照得活菌數(shù)。