本發(fā)明屬于生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，特別涉及一種體外誘導(dǎo)干細(xì)胞向胰島樣細(xì)胞定向分化的方法及胰島樣細(xì)胞的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：糖尿病是一種慢性代謝性、多因素疾病，由絕對(duì)(I型糖尿病)和相對(duì)的(II型糖尿病)胰島素缺乏導(dǎo)致高血糖癥，兩者之間的共同點(diǎn)均是胰島β細(xì)胞功能不足，臨床早期無明顯癥狀，癥狀期會(huì)出現(xiàn)三多一少現(xiàn)象，常常伴隨身體多系統(tǒng)的損害，嚴(yán)重傷害身體，甚至威脅生命。I型糖尿病的發(fā)病原因主要是自身免疫反應(yīng)導(dǎo)致胰島β細(xì)胞破壞，無法維持葡萄糖水平的穩(wěn)定。胰島移植，特別是對(duì)重癥患者，是一種更直接的治療方法，但由于供體缺乏、胰腺/胰島分離費(fèi)用高、移植產(chǎn)生的炎性反應(yīng)需要多次移植和長(zhǎng)期服用免疫排斥藥物等問題而未能在臨床上廣泛應(yīng)用。糖尿病患者胰島功能的改善對(duì)延緩并發(fā)癥的發(fā)生尤為重要，借助干細(xì)胞技術(shù)，在糖尿病患者體內(nèi)重建內(nèi)源性胰島素分泌系統(tǒng)，成為再生醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中備受關(guān)注的研究方向。干細(xì)胞具有多向分化潛能，其中間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs)是中胚層中具有高度自我更新和多向分化潛能的多能干細(xì)胞，廣泛存在于全身多種組織中，可在體外培養(yǎng)擴(kuò)增，并能在特定條件下分化為神經(jīng)、汗腺、骨、軟骨、脂肪、肝臟等多種組織細(xì)胞。脂肪、臍帶和胎盤來源的MSC具有取材方便，傳代能力強(qiáng)，免疫反應(yīng)低，被污染的概率較小，無倫理學(xué)限制等優(yōu)點(diǎn)，在一定條件下可分化為胰島β細(xì)胞或胰島素生成細(xì)胞(IPCs)，此方法成為替代現(xiàn)有短缺的胰島細(xì)胞、實(shí)現(xiàn)臨床糖尿病治療的重要研究途徑。研究表明，胰腺內(nèi)分泌細(xì)胞來自內(nèi)胚層，并且表達(dá)神經(jīng)元標(biāo)志物，同時(shí)在脊椎動(dòng)物的大腦中發(fā)現(xiàn)胰島素基因轉(zhuǎn)錄，這些結(jié)果都顯示胰島細(xì)胞與神經(jīng)元存在相似之處，因此在神經(jīng)元條件培養(yǎng)基的作用下可能更有益于胰島樣細(xì)胞的生長(zhǎng)。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的是提供一種誘導(dǎo)間充質(zhì)干細(xì)胞分化為胰島樣細(xì)胞的方法，利用新出生的鼠大腦制備腦組織條件培養(yǎng)基(BTCM)，利用阿糖胞苷、尼克酰胺、B27、Conophylline等誘導(dǎo)間充質(zhì)干細(xì)胞分化為胰島樣細(xì)胞，并通過進(jìn)一步的鑒定來探討間充質(zhì)干細(xì)胞的分化潛能，同時(shí)尋找一種高效的胰島樣細(xì)胞的分化體系，為間充質(zhì)干細(xì)胞分化為成熟胰島樣細(xì)胞的臨床應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。本發(fā)明的一種誘導(dǎo)間充質(zhì)干細(xì)胞分化為胰島樣細(xì)胞的方法，它按照以下步驟進(jìn)行：一、從臍帶、胎盤或脂肪組織中分離獲得間充質(zhì)干細(xì)胞，并傳代培養(yǎng)；二、分化培養(yǎng)基制備所述的分化培養(yǎng)基包括腦組織條件培養(yǎng)基、細(xì)胞分化誘導(dǎo)液和干細(xì)胞條件培養(yǎng)基；所述的腦組織條件培養(yǎng)基制備過程如下：在無菌條件下，取出生6～7天大鼠的大腦，用PBS或鹽水清洗后，1000rpm離心6min，棄上清，用10％FBS的DMEM高糖培養(yǎng)基重懸沉淀，將腦組織搗碎為單個(gè)細(xì)胞，收集腦組織細(xì)胞用10％FBS的DMEM高糖培養(yǎng)1d后，加入濃度為1～2μmol/L的阿糖胞苷培養(yǎng)，在培養(yǎng)的第5d收集培養(yǎng)液，即為BTCM；所述的細(xì)胞分化誘導(dǎo)液成分為：以DMEM/F12為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，內(nèi)含2％FBS、80～100μg/L長(zhǎng)春堿衍生物和2％B27；所述的干細(xì)胞條件培養(yǎng)基制備過程如下：用含2％FBS、10mmol/L尼克酰胺的DMEM/F12培養(yǎng)基培養(yǎng)MSCs，3天后收集培養(yǎng)液即為SCM；三、將步驟一傳代培養(yǎng)后的臍帶、胎盤或脂肪組織間充質(zhì)干細(xì)胞分化為胰島樣細(xì)胞，進(jìn)行鑒定后，即完成所述的誘導(dǎo)間充質(zhì)干細(xì)胞分化為胰島樣細(xì)胞。所述的長(zhǎng)春堿衍生物為Conophylline。本發(fā)明包含以下有益效果：1)本發(fā)明所提供的誘導(dǎo)體系安全、無副作用，采用大鼠腦制備BTCM，其中包含多種天然誘導(dǎo)因子，聯(lián)合尼克酰胺、Conophylline和B27等細(xì)胞因子的協(xié)同作用高效誘導(dǎo)胰島素分泌細(xì)胞的生成。與傳統(tǒng)方法相比，此次誘導(dǎo)體系使用細(xì)胞因子種類少且劑量少，降低臨床使用風(fēng)險(xiǎn)。在最后階段的SCM為胰島素樣細(xì)胞簇提供保護(hù)作用，克服了細(xì)胞易凋亡、分化不成熟、葡萄糖誘導(dǎo)毒性等缺點(diǎn)。2)本發(fā)明獲得的胰島樣細(xì)胞分泌能力強(qiáng)。已報(bào)道的數(shù)據(jù)顯示胰島樣細(xì)胞團(tuán)在高葡萄糖刺激下，胰島素分泌量約為50～70mU/L，而本發(fā)明誘導(dǎo)的胰島樣細(xì)胞團(tuán)具有更高、更快的胰島素分泌能力，在低糖刺激下已達(dá)到(33.88±4.05mU/L)，高糖作用下達(dá)到(105.65±7.43mU/L)，很大程度上提高了胰島樣細(xì)胞的胰島素分泌能力，對(duì)葡萄糖刺激做出快速反應(yīng)，達(dá)到快速降低血糖的功能。本發(fā)明的誘導(dǎo)方法與傳統(tǒng)的多細(xì)胞因子聯(lián)合誘導(dǎo)相比，可獲得更多并且成熟的胰島樣細(xì)胞，顯著提高誘導(dǎo)分化效率，同時(shí)已分化的胰島樣細(xì)胞存活時(shí)間長(zhǎng)、增殖活性高，在葡萄糖刺激下能在較短的時(shí)間內(nèi)作出快速反應(yīng)，達(dá)到快速降糖作用。同時(shí)，本發(fā)明方法無需基因轉(zhuǎn)染，避免基因改變和致瘤風(fēng)險(xiǎn)，具有廣闊的應(yīng)用前景。附圖說明圖1為胰島樣細(xì)胞的雙硫腙染色圖；圖2為基因表達(dá)情況圖；圖3為胰島素的分泌受外環(huán)境糖的調(diào)節(jié)結(jié)果圖；圖4為胰島樣細(xì)胞移植后分別在第3天、10天大鼠血糖水平圖。具體實(shí)施方式具體實(shí)施方式一：本實(shí)施方式的一種誘導(dǎo)間充質(zhì)干細(xì)胞分化為胰島樣細(xì)胞的方法，它按照以下步驟進(jìn)行：一、從臍帶、胎盤或脂肪組織中分離獲得間充質(zhì)干細(xì)胞，并傳代培養(yǎng)；二、分化培養(yǎng)基制備所述的分化培養(yǎng)基為腦組織條件培養(yǎng)基、細(xì)胞分化誘導(dǎo)液和干細(xì)胞條件培養(yǎng)基；所述的腦組織條件培養(yǎng)基制備過程如下：在無菌條件下，取出生6～7天大鼠的大腦，用PBS或鹽水清洗后，1000rpm離心6min，棄上清，用10％FBS的DMEM高糖培養(yǎng)基重懸沉淀，將腦組織搗碎為單個(gè)細(xì)胞，收集腦組織細(xì)胞用10％FBS的DMEM高糖培養(yǎng)1d后，加入濃度為1～2μmol/L的阿糖胞苷培養(yǎng)，在培養(yǎng)的第5d收集培養(yǎng)液，即為BTCM；所述的細(xì)胞分化誘導(dǎo)液成分為：以DMEM/F12為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，內(nèi)含2％FBS、80～100μg/L長(zhǎng)春堿衍生物和2％B27；所述的干細(xì)胞條件培養(yǎng)基制備過程如下：用含2％FBS、10mmol/L尼克酰胺的DMEM/F12培養(yǎng)基培養(yǎng)MSCs，3天后收集培養(yǎng)液即為SCM；三、將步驟一傳代培養(yǎng)后的臍帶、胎盤或脂肪組織間充質(zhì)干細(xì)胞分化為胰島樣細(xì)胞，進(jìn)行鑒定后，即完成所述的誘導(dǎo)間充質(zhì)干細(xì)胞分化為胰島樣細(xì)胞。具體實(shí)施方式二：本實(shí)施方式與具體實(shí)施方式一不同的是：所述的將步驟一傳代培養(yǎng)后的臍帶、胎盤或脂肪組織間充質(zhì)干細(xì)胞分化為胰島樣細(xì)胞具體過程如下：將步驟一傳代培養(yǎng)至P3代的臍帶、胎盤或脂肪組織的間充質(zhì)干細(xì)胞以4×104個(gè)/mL接種量接種于6孔板中，以含10％FBS的DMEM/F12的培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)24h后更換BTCM培養(yǎng)7天，每2日更換一次BTCM，培養(yǎng)7天后，再用細(xì)胞分化誘導(dǎo)液培養(yǎng)7天，每2日換一次誘導(dǎo)液，然后用細(xì)胞分化誘導(dǎo)液和SCM按體積比為1:1的比例聯(lián)合共同培養(yǎng)14天，即獲得成熟的胰島樣細(xì)胞。其它與具體實(shí)施方式一相同。具體實(shí)施方式三：本實(shí)施方式與具體實(shí)施方式一不同的是：所述的臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞分離及傳代培養(yǎng)過程如下：取足月胎兒臍帶15～20cm，經(jīng)過生理鹽水和體積百分含量為75％酒精清洗后，剪成長(zhǎng)度為2～3cm，分別將動(dòng)脈和靜脈剝離，將中間的華通氏膠分離出來，在無菌條件下剪成0.5～2mm3組織塊，按照1g/T75瓶接種，采用10％FBS培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，5d后進(jìn)行換液，待細(xì)胞融合度達(dá)到80％以上后，通過體積百分濃度為0.125％的胰酶進(jìn)行消化，獲取單個(gè)細(xì)胞，按照8×105個(gè)細(xì)胞/T75瓶接種，采用10％FBS培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，置于二氧化碳培養(yǎng)箱，待細(xì)胞融合度達(dá)到90％以上后進(jìn)行傳代，同時(shí)對(duì)臍帶MSCs的免疫標(biāo)記檢測(cè)，檢測(cè)合格的留存，即完成所述的臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞分離及傳代培養(yǎng)。其它與具體實(shí)施方式一相同。本市實(shí)施方式所述的檢測(cè)合格為：檢測(cè)后發(fā)現(xiàn)均表達(dá)典型的MSCs表面抗原：CD13、CD29、CD44、CD54、CD73、CD105，不表達(dá)造血干細(xì)胞表面抗原：CD3、CD14、CD34、CD45和內(nèi)皮細(xì)胞表面抗原CD31，符合干細(xì)胞的特性，即為檢測(cè)合格。具體實(shí)施方式四：本實(shí)施方式與具體實(shí)施方式一不同的是：所述的胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞分離和傳代培養(yǎng)過程如下：在無菌條件下，先用體積百分含量為75％酒精對(duì)胎盤采集袋進(jìn)行消毒處理，隨后生理鹽水清洗胎盤2遍，剝離羊膜后，取胎盤絨毛層組織，加生理鹽水清洗血漬，清洗后將絨毛層組織置于50mL潔凈離心管內(nèi)，剪成0.2～1mm3的組織塊，加入3倍組織塊體積的I型膠原酶，37℃搖床內(nèi)消化30min，加入10mL無血清培養(yǎng)基終止消化，過濾于50mL潔凈離心管內(nèi)，1300r/min離心6分鐘，棄上清，取沉淀，按照1×106個(gè)細(xì)胞/T75瓶接種，采用10％FBS培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，置于二氧化碳培養(yǎng)箱，待細(xì)胞融合度達(dá)到90％以上后進(jìn)行傳代，同時(shí)對(duì)胎盤MSCs的免疫標(biāo)記檢測(cè)，檢測(cè)合格的留存，即完成所述的胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞分離和傳代培養(yǎng)。其它與具體實(shí)施方式一相同。本市實(shí)施方式所述的檢測(cè)合格為：檢測(cè)后發(fā)現(xiàn)均表達(dá)典型的MSCs表面抗原：CD13、CD29、CD44、CD54、CD73、CD105，不表達(dá)造血干細(xì)胞表面抗原：CD3、CD14、CD34、CD45和內(nèi)皮細(xì)胞表面抗原CD31，符合干細(xì)胞的特性，即為檢測(cè)合格。具體實(shí)施方式五：本實(shí)施方式與具體實(shí)施方式一不同的是：所述的脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞分離和傳代培養(yǎng)過程：在無菌條件下，先用體積百分含量為75％酒精處理脂肪采集瓶，隨后生理鹽水清洗脂肪2～3遍，轉(zhuǎn)移脂肪組織至50mL離心管中，加入3倍組織塊體積的I型膠原酶，37℃搖床內(nèi)消化35min，加入約15mL無血清培養(yǎng)基終止消化，過濾至50mL離心管內(nèi)，1300r/min離心6分鐘，棄上清，取沉淀，按照1×106～1.5×106個(gè)細(xì)胞/T75瓶接種，采用10％FBS培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，放置于二氧化碳培養(yǎng)箱，待細(xì)胞融合度達(dá)到90％以上后進(jìn)行傳代，同時(shí)對(duì)脂肪MSCs的免疫標(biāo)記檢測(cè)，檢測(cè)合格的留存，即完成所述的脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞分離和傳代培養(yǎng)。其它與具體實(shí)施方式一相同。本市實(shí)施方式所述的檢測(cè)合格為：檢測(cè)后發(fā)現(xiàn)均表達(dá)典型的MSCs表面抗原：CD13、CD29、CD44、CD54、CD73、CD105，不表達(dá)造血干細(xì)胞表面抗原：CD3、CD14、CD34、CD45和內(nèi)皮細(xì)胞表面抗原CD31，符合干細(xì)胞的特性，即為檢測(cè)合格。本
發(fā)明內(nèi)容不僅限于上述各實(shí)施方式的內(nèi)容，其中一個(gè)或幾個(gè)具體實(shí)施方式的組合同樣也可以實(shí)現(xiàn)發(fā)明的目的。通過以下實(shí)施例驗(yàn)證本發(fā)明的有益效果：實(shí)施例1：間充質(zhì)干細(xì)胞的制備1.1臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的制備無菌條件下取足月胎兒臍帶15～20cm，經(jīng)過生理鹽水和體積百分含量為75％酒精清洗后，剪成長(zhǎng)度為2～3cm小段，分別將動(dòng)脈和靜脈剝離，將中間的華通氏膠分離出來，在無菌條件下解剖成0.5～2mm3小組織塊，按照1g/T75瓶接種，采用10％FBS培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，5d后進(jìn)行換液，待細(xì)胞融合度達(dá)到80％以上后，通過體積百分濃度為0.125％的胰酶進(jìn)行消化，獲取單個(gè)細(xì)胞，按照8×105個(gè)細(xì)胞/T75瓶接種，采用10％FBS培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，放置于二氧化碳培養(yǎng)箱，待細(xì)胞融合度達(dá)到90％以上后進(jìn)行傳代，同時(shí)對(duì)臍帶MSCs的免疫標(biāo)記檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)它們均表達(dá)典型的MSCs表面抗原：CD13、CD29、CD44、CD54、CD73、CD105，不表達(dá)造血干細(xì)胞表面抗原：CD3、CD14、CD34、CD45和內(nèi)皮細(xì)胞表面抗原CD31，符合干細(xì)胞的特性。1.2胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞的制備在無菌條件下，先用75％酒精對(duì)胎盤采集袋進(jìn)行消毒處理，隨后生理鹽水清洗胎盤2遍，剝離羊膜后，取胎盤絨毛層組織，加生理鹽水清洗血漬，清洗后將絨毛層組織置于50mL潔凈離心管內(nèi)，剪成0.2～1mm3大小組織塊，加入3倍組織塊體積的I型膠原酶，37℃搖床內(nèi)消化30min，加入10mL無血清培養(yǎng)基終止消化，過濾于50mL潔凈離心管內(nèi)，1300r/min離心6分鐘，棄上清，取沉淀，按照1×106個(gè)細(xì)胞/T75瓶接種，采用10％FBS培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，置于二氧化碳培養(yǎng)箱，待細(xì)胞融合度達(dá)到90％以上后進(jìn)行傳代，同時(shí)對(duì)胎盤MSCs的免疫標(biāo)記檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)它們均表達(dá)典型的MSCs表面抗原：CD13、CD29、CD44、CD54、CD73、CD105，不表達(dá)造血干細(xì)胞表面抗原：CD3、CD14、CD34、CD45和內(nèi)皮細(xì)胞表面抗原CD31，符合干細(xì)胞的特性。1.3脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞的制備在無菌條件下，先用75％酒精處理脂肪采集瓶，隨后生理鹽水清洗脂肪2～3遍，轉(zhuǎn)移脂肪組織至50mL離心管中，加入3倍組織塊體積的I型膠原酶，37℃搖床內(nèi)消化35min，加入約15mL無血清培養(yǎng)基終止消化，過濾至50mL離心管內(nèi)，1300r/min離心6分鐘，棄上清，取沉淀，按照1×106～1.5×106個(gè)細(xì)胞/T75瓶接種，采用10％FBS培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，放置于二氧化碳培養(yǎng)箱，待細(xì)胞融合度達(dá)到90％以上后進(jìn)行傳代，同時(shí)對(duì)脂肪MSCs的免疫標(biāo)記檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)它們均表達(dá)典型的MSCs表面抗原：CD13、CD29、CD44、CD54、CD73、CD105，不表達(dá)造血干細(xì)胞表面抗原：CD3、CD14、CD34、CD45和內(nèi)皮細(xì)胞表面抗原CD31，符合干細(xì)胞的特性。實(shí)施例2：分化培養(yǎng)基制備2.1腦組織條件培養(yǎng)基(BTCM)制備在無菌條件下，取出生6～7天大鼠的大腦，用PBS或鹽水清洗后1000rpm離心6min，棄上清，用10％FBS-DMEM重懸沉淀(腦組織)，將腦組織搗碎為單個(gè)細(xì)胞，收集腦組織細(xì)胞用10％FBS-DMEM培養(yǎng)，第二天加入2μmol/L的阿糖胞苷，在培養(yǎng)的第五天收集培養(yǎng)液即為BTCM。2.2細(xì)胞分化誘導(dǎo)液制備以DMEM/F12為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，內(nèi)含2％FBS、10mmol/L尼克酰胺、β細(xì)胞調(diào)節(jié)素、Conophylline100μg/L。2.3干細(xì)胞條件培養(yǎng)基(SCM)制備用含2％FBS、10mmol/L尼克酰胺和2％B27的DMEM/F12培養(yǎng)基培養(yǎng)MSCs，3天后收集培養(yǎng)液即為SCM。實(shí)施例3：體外誘導(dǎo)間充質(zhì)干細(xì)胞分化為胰島樣細(xì)胞3.1體外誘導(dǎo)分化為胰島樣細(xì)胞將P3代臍帶、胎盤或脂肪來源的間充質(zhì)干細(xì)胞以4×104個(gè)/ml接種于6孔板中，培養(yǎng)基為含10％FBS的DMEM/F12，24h后更換BTCM培養(yǎng)7天，每2日更換一次BTCM。細(xì)胞分化誘導(dǎo)液再培養(yǎng)7天，每2日換一次液，然后細(xì)胞分化誘導(dǎo)液和SCM聯(lián)合共同培養(yǎng)14天，即可獲得成熟的胰島樣細(xì)胞。3.2體外誘導(dǎo)胰島樣細(xì)胞的鑒定(1)雙硫腙染色鑒定對(duì)誘導(dǎo)后的胰島樣細(xì)胞進(jìn)行雙硫腙染色，移除細(xì)胞培養(yǎng)基，用PBS清洗2次，然后加入1mlPBS和50μl雙硫腙工作液，37℃孵育20min，移出雙硫腙染液，用PBS洗2次，在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞著色情況并拍照記錄。結(jié)果表明誘導(dǎo)后的細(xì)胞由間充質(zhì)干細(xì)胞的長(zhǎng)梭形變?yōu)閳A形，細(xì)胞被染成磚紅色，為陽性胰島樣細(xì)胞，結(jié)果見圖1。(2)RT-PCR特異性基因檢測(cè)用Trizol試劑提取間充質(zhì)干細(xì)胞和誘導(dǎo)后胰島樣細(xì)胞的總RNA，經(jīng)RT-PCR檢測(cè)人胰島素(Insulin)和胰高血糖素(Glucagon)基因的表達(dá)，同時(shí)以β-actin基因?yàn)閰⒄?，引物見?，RT-PCR結(jié)果見圖2。表1：RT-PCR基因引物基因上游引物下游引物Insulin5’-GCCTTTGTGAACCAACACCTG-3’5’-GTTGCAGTAGTTCTCCAGCTG-3’Glucagon5’-AGGCAGACCCACTCAGTGA-3’5’-AACAATGGCGACCTCTTCTG-3’β-actin5’-TGGCACCCAGCACAATGAA-3’5’-TAAGTCATAGTCCGCCTAGAAGCA-3’結(jié)果顯示，間充質(zhì)干細(xì)胞和胰島樣細(xì)胞均表達(dá)內(nèi)參基因，間充質(zhì)干細(xì)胞不表達(dá)胰島素和胰高血糖素基因，而誘導(dǎo)后產(chǎn)生的胰島樣細(xì)胞表達(dá)胰島素和胰高血糖素基因，說明間充質(zhì)干細(xì)胞已誘導(dǎo)分化為胰島樣細(xì)胞。(3)葡萄糖刺激胰島素分泌實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)分組：對(duì)照組為未誘導(dǎo)間充質(zhì)干細(xì)胞；實(shí)驗(yàn)1組為誘導(dǎo)后胰島樣細(xì)胞在5.8mmol/L葡萄糖DMEM中培養(yǎng)；實(shí)驗(yàn)2組為誘導(dǎo)后胰島樣細(xì)胞在18.7mmol/L葡萄糖DMEM中培養(yǎng)。挑取約50個(gè)誘導(dǎo)后的細(xì)胞團(tuán)(50～150μm)至1.5ml離心管中，PBS清洗2遍后加入1ml無糖DMEM預(yù)培養(yǎng)3～6h。然后以300μl含5.8mmol/L葡萄糖、25mmol/L葡萄糖的DMEM在37度下依次培養(yǎng)2h。收集上清液，用ELISA法檢測(cè)上清中不同濃度葡萄糖刺激下胰島素的分泌量。結(jié)果顯示對(duì)照組細(xì)胞上清中幾乎檢測(cè)不到胰島素，而經(jīng)誘導(dǎo)后的細(xì)胞團(tuán)在5.8mmol/L葡萄糖刺激下胰島素分泌量為(33.88±4.05mU/L)，經(jīng)25mmol/L葡萄糖孵育2h后胰島素分泌量為(105.65±7.43mU/L)，隨著葡萄糖濃度的增加其胰島素分泌量增加，差異極顯著。由此可知，誘導(dǎo)后胰島樣細(xì)胞團(tuán)對(duì)葡萄糖刺激敏感，其胰島素的分泌受外環(huán)境糖的調(diào)節(jié)(見圖3)。實(shí)施例4：體內(nèi)移植實(shí)驗(yàn)糖尿病大鼠造模，本研究采用SD大鼠，雌雄各半，體重250g左右，空腹12h(禁食不禁水)后尾靜脈取血，血糖儀測(cè)血糖，空腹血糖>11.1mmol/L者剔除，排除造模前的高血糖。大鼠單次腹膜內(nèi)注射溶于0.1M檸檬酸鈉緩沖液(pH＝4.5)的鏈脲佐菌素，劑量為50mg/kg。糖尿病的誘導(dǎo)通過鏈脲霉素注射4天后血糖的評(píng)估來確認(rèn)，血糖高于16.7mmol/L并出現(xiàn)多飲、多食、多尿的大鼠認(rèn)為造模成功。選擇糖尿病造模成功的大鼠隨機(jī)分為三組，即正常組、糖尿病對(duì)照組和胰島樣細(xì)胞移植組。胰島樣細(xì)胞移植后分別在第3天、10天檢測(cè)兩組大鼠血糖水平，結(jié)果見表2和圖4。具體的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組如下：正常組：5只健康大鼠糖尿病對(duì)照組：接受鏈脲菌素誘導(dǎo)I型糖尿病的5只大鼠，不做任何處理；胰島樣細(xì)胞移植組：5只糖尿病大鼠接受胰島樣細(xì)胞移植(102-103細(xì)胞靜脈注射一次)表2各組大鼠血糖水平(mmol/L)(差(x±s，％)由表2和圖4結(jié)果顯示，糖尿病組大鼠血糖普遍較高，胰島樣細(xì)胞移植后大鼠血糖出現(xiàn)下降，并且差異顯著。隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，胰島樣細(xì)胞移植組血糖進(jìn)一步降低，且差異顯著，以上結(jié)果表明已分化的胰島樣細(xì)胞對(duì)糖尿病大鼠具有一定的降糖作用。當(dāng)前第1頁1 2 3