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一種誘導(dǎo)間充質(zhì)干細胞分化為胰島樣細胞的方法與流程

文檔序號:12609638閱讀:來源:國知局

技術(shù)特征:

1.一種誘導(dǎo)間充質(zhì)干細胞分化為胰島樣細胞的方法,其特征在于它按照以下步驟進行:

一、從臍帶、胎盤或脂肪組織中分離獲得間充質(zhì)干細胞,并傳代培養(yǎng);

二、分化培養(yǎng)基制備

所述的分化培養(yǎng)基包括腦組織條件培養(yǎng)基、細胞分化誘導(dǎo)液和干細胞條件培養(yǎng)基;

所述的腦組織條件培養(yǎng)基制備過程如下:在無菌條件下,取出生6~7天大鼠的大腦,用PBS或鹽水清洗后,1000rpm離心6min,棄上清,用10%FBS的DMEM高糖培養(yǎng)基重懸沉淀,將腦組織搗碎為單個細胞,收集腦組織細胞用10%FBS的DMEM高糖培養(yǎng)1d后,加入濃度為1~2μmol/L的阿糖胞苷培養(yǎng),在培養(yǎng)的第5d收集培養(yǎng)液,即為BTCM;

所述的細胞分化誘導(dǎo)液成分為:以DMEM/F12為基礎(chǔ)培養(yǎng)基,內(nèi)含2%FBS、80~100μg/L長春堿衍生物和2%B27;

所述的干細胞條件培養(yǎng)基制備過程如下:用含2%FBS、10mmol/L尼克酰胺的DMEM/F12培養(yǎng)基培養(yǎng)MSCs,3天后收集培養(yǎng)液即為SCM;

三、將步驟一傳代培養(yǎng)后的臍帶、胎盤或脂肪組織間充質(zhì)干細胞分化為胰島樣細胞,進行鑒定后,即完成所述的誘導(dǎo)間充質(zhì)干細胞分化為胰島樣細胞。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種誘導(dǎo)間充質(zhì)干細胞分化為胰島樣細胞的方法,其特征在于所述的將步驟一傳代培養(yǎng)后的臍帶、胎盤或脂肪組織間充質(zhì)干細胞分化為胰島樣細胞具體過程如下:

將步驟一傳代培養(yǎng)至P3代的臍帶、胎盤或脂肪組織的間充質(zhì)干細胞以4×104個/mL接種量接種于6孔板中,在含10%FBS的DMEM/F12進行培養(yǎng),培養(yǎng)24h后更換BTCM培養(yǎng)7天,每2日更換一次BTCM,培養(yǎng)7天后,再用細胞分化誘導(dǎo)液培養(yǎng)7天,每2日換一次誘導(dǎo)液,然后用細胞分化誘導(dǎo)液和SCM按體積比為1:1的比例聯(lián)合共同培養(yǎng)14天,即獲得成熟的胰島樣細胞。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種誘導(dǎo)間充質(zhì)干細胞分化為胰島樣細胞的方法,其特征在于所述的臍帶間充質(zhì)干細胞分離及傳代培養(yǎng)過程如下:

取足月胎兒臍帶15~20cm,經(jīng)過生理鹽水和體積百分含量為75%酒精清洗后,剪成長度為2~3cm,分別將動脈和靜脈剝離,將中間的華通氏膠分離出來,在無菌條件下剪成0.5~2mm3組織塊,按照1g/T75瓶接種,采用10%FBS培養(yǎng)基進行培養(yǎng),5d后進行換液,待細胞融合度達到80%以上后,通過體積百分濃度為0.125%的胰酶進行消化,獲取單個細胞,按照8×105個細胞/T75瓶接種,采用10%FBS培養(yǎng)基進行培養(yǎng),置于二氧化碳培養(yǎng)箱,待細胞融合度達到90%以上后進行傳代,同時對臍帶MSCs的免疫標記檢測,檢測合格的留存,即完成所述的臍帶間充質(zhì)干細胞分離及傳代培養(yǎng)。

4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種誘導(dǎo)間充質(zhì)干細胞分化為胰島樣細胞的方法,其特征在于所述的胎盤間充質(zhì)干細胞分離和傳代培養(yǎng)過程如下:

在無菌條件下,先用體積百分含量為75%酒精對胎盤采集袋進行消毒處理,隨后生理鹽水清洗胎盤2遍,剝離羊膜后,取胎盤絨毛層組織,加生理鹽水清洗血漬,清洗后將絨毛層組織置于50mL潔凈離心管內(nèi),剪成0.2~1mm3的組織塊,加入3倍組織塊體積的I型膠原酶,37℃搖床內(nèi)消化30min,加入10mL無血清培養(yǎng)基終止消化,過濾于50mL潔凈離心管內(nèi),1300r/min離心6分鐘,棄上清,取沉淀,按照1×106個細胞/T75瓶接種,采用10%FBS培養(yǎng)基進行培養(yǎng),置于二氧化碳培養(yǎng)箱,待細胞融合度達到90%以上后進行傳代,同時對胎盤MSCs的免疫標記檢測,檢測合格的留存,即完成所述的胎盤間充質(zhì)干細胞分離和傳代培養(yǎng)。

5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種誘導(dǎo)間充質(zhì)干細胞分化為胰島樣細胞的方法,其特征在于所述的脂肪間充質(zhì)干細胞分離和傳代培養(yǎng)過程:

在無菌條件下,先用體積百分含量為75%酒精處理脂肪采集瓶,隨后生理鹽水清洗脂肪2~3遍,轉(zhuǎn)移脂肪組織至50mL離心管中,加入3倍組織塊體積的I型膠原酶,37℃搖床內(nèi)消化35min,加入約15mL無血清培養(yǎng)基終止消化,過濾至50mL離心管內(nèi),1300r/min離心6分鐘,棄上清,取沉淀,按照1×106~1.5×106個細胞/T75瓶接種,采用10%FBS培養(yǎng)基進行培養(yǎng),放置于二氧化碳培養(yǎng)箱,待細胞融合度達到90%以上后進行傳代,同時對脂肪MSCs的免疫標記檢測,檢測合格的留存,即完成所述的脂肪間充質(zhì)干細胞分離和傳代培養(yǎng)。

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