本發(fā)明涉及硒制備技術(shù)領(lǐng)域，尤其是一種納米硒及其制備方法。

背景技術(shù)：

在啤酒釀造行業(yè)中，每生產(chǎn)10000t啤酒，將會(huì)產(chǎn)生100t發(fā)酵廢液，其中富含大量蛋白及維生素，直接處理必將造成大量的資源浪費(fèi)和環(huán)境污染，開發(fā)出一種能重復(fù)利用啤酒發(fā)酵廢液的方法，使其變廢為寶具有重大的意義。

硒是飼料添加劑中一種重要添加元素，具有抗氧化、抗腫瘤等多種生理功能。硒在自然界中常以+6，+4，0，-2四種價(jià)態(tài)為主，目前，我國(guó)飼料行業(yè)中，由于亞硒酸鈉毒性高，安全使用范圍較小，大部分地區(qū)已被禁止使用；而以-2價(jià)的硒代氨基酸為主的酵母硒，由于營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高、生物活性好被廣泛應(yīng)用，但在生產(chǎn)過程中其周期長(zhǎng)，廢液多，儀器設(shè)備成本高，大部分小企業(yè)難以維持，生產(chǎn)困難。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

基于此，本發(fā)明的目的在于克服上述現(xiàn)有技術(shù)的不足之處而提供一種納米硒的制備方法，所述制備方法具有成本低，周期短，單位硒含量高，廢水少。

為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明所采取的技術(shù)方案為：一種納米硒的制備方法，包括如下步驟：

(1)在糖蜜水解液中加入亞硒酸鈉、營(yíng)養(yǎng)鹽，滅菌，得到糖蜜培養(yǎng)基，其中，糖蜜培養(yǎng)基中亞硒酸鈉的濃度為0.1～1.5mg/mL；

(2)離心啤酒發(fā)酵廢液，得到酵母泥；

(3)將步驟(2)所得酵母泥和步驟(1)所得糖蜜培養(yǎng)基按1：3～1：2g/mL的質(zhì)量體積比進(jìn)行混合，在溫度為25～32℃下發(fā)酵2小時(shí)以上，得到發(fā)酵液；

(4)將步驟(3)所得發(fā)酵液進(jìn)行離心分離，得到酵母菌體，將酵母菌體進(jìn)行干燥、粉碎，即得所述納米硒。

本發(fā)明所述納米硒的制備方法，利用啤酒發(fā)酵廢液濃縮發(fā)酵制備納米硒，成本低、制備效率高，具有較大的經(jīng)濟(jì)效益和環(huán)境效益。

優(yōu)選地，所述步驟(1)所得糖蜜培養(yǎng)基中，糖度為3～7°Be′。

糖是提供酵母生長(zhǎng)代謝主要能源物質(zhì)之一，在酶的作用下，被氧化釋放出電子和氫離子，在還原亞硒酸鈉為納米硒中起到重要作用。發(fā)明人經(jīng)過大量嘗試發(fā)現(xiàn)，糖濃度越高，轉(zhuǎn)化的硒含量越高，但單位酵母量逐漸降低，當(dāng)糖分選擇上述含量時(shí)，可以保證單位酵母量和轉(zhuǎn)化的硒含量的統(tǒng)一。

優(yōu)選地，所述步驟(1)所得糖蜜培養(yǎng)基中，糖度為5°Be′，亞硒酸鈉的濃度為1mg/mL。

當(dāng)糖度為上述含量時(shí)，可以進(jìn)一步保證單位酵母量和轉(zhuǎn)化的硒含量的統(tǒng)一，使單位酵母量和轉(zhuǎn)化的硒含量都達(dá)到最高。

亞硒酸鈉的添加濃度是影響硒轉(zhuǎn)化率的最主要因素，添加濃度越高，被吸收轉(zhuǎn)化的納米硒越多，但酵母細(xì)胞適應(yīng)能力和其中的還原物質(zhì)有限，過高的硒濃度會(huì)導(dǎo)致酵母細(xì)胞自溶死亡，而導(dǎo)致硒含量下降。發(fā)明人經(jīng)過大量嘗試，發(fā)現(xiàn)上述濃度的亞硒酸鈉可保證硒含量較高。當(dāng)亞硒酸鈉為上述濃度時(shí)，轉(zhuǎn)化的納米硒含量最高，最高可達(dá)到11470ppm。

優(yōu)選地，所述步驟(1)所得糖蜜培養(yǎng)基中，營(yíng)養(yǎng)鹽包含硫酸銨、維生素營(yíng)養(yǎng)液，所述硫酸銨在所述糖蜜培養(yǎng)基中的質(zhì)量百分比為0.5～2.5％，所述維生素營(yíng)養(yǎng)液在所述糖蜜培養(yǎng)基中的質(zhì)量百分比為0.1～1％。所述營(yíng)養(yǎng)鹽補(bǔ)充發(fā)酵過程中酵母菌生長(zhǎng)所需要的氮源、維生素等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，所述維生素營(yíng)養(yǎng)液中包含多種酵母菌生長(zhǎng)所需要的維生素。

優(yōu)選地，所述步驟(3)中，發(fā)酵時(shí)間為3～12小時(shí)。

發(fā)明人在對(duì)發(fā)酵時(shí)間的研究中，發(fā)現(xiàn)在前3小時(shí)內(nèi)，單位硒含量急劇上升，在3～12小時(shí)緩慢上升至平穩(wěn)狀態(tài)，這可能是酵母細(xì)胞中本身存在大量的某一還原性物質(zhì)，在迅速的將有毒亞硒酸鈉還原為單質(zhì)硒吸附在細(xì)胞內(nèi)，而后由于還原性物質(zhì)的缺乏，通過酵母細(xì)胞的生長(zhǎng)代謝作用緩慢的將亞硒酸鈉富集到細(xì)胞中。

優(yōu)選地，所述步驟(3)中，酵母泥和糖蜜培養(yǎng)基的質(zhì)量體積比為1：2.5g/mL。

酵母泥添加量越多，單位消耗的培養(yǎng)基成本越低，但是酵母泥添加量太高，會(huì)使酵母在培養(yǎng)基中缺氧，導(dǎo)致厭氧發(fā)酵，進(jìn)而產(chǎn)生酒精，影響產(chǎn)率。

優(yōu)選地，所述步驟(3)中，在pH值為4～8的條件下進(jìn)行發(fā)酵。

發(fā)明人經(jīng)過大量嘗試，發(fā)現(xiàn)在不同pH下處理后，硒濃度變化不明顯，酵母細(xì)胞包裹效果好，在作為飼料添加劑中穩(wěn)定，但是發(fā)現(xiàn)隨著pH的增大硒含量先增加后下降，pH在4～8時(shí)硒含量總體變化不大，在實(shí)際發(fā)酵過程中要求低，便于生產(chǎn)。

優(yōu)選地，所述步驟(3)中，在pH值為7、溫度為30℃的條件下發(fā)酵3小時(shí)。

溫度是影響酵母中各類酶活性的重要因素之一，酶在生長(zhǎng)代謝中起關(guān)鍵性作用，不同溫度下酶的活性表現(xiàn)不同，發(fā)明人經(jīng)過大量嘗試，發(fā)現(xiàn)隨著溫度的升高，在30℃以后酵母的產(chǎn)量急速下降，而硒含量在30℃時(shí)達(dá)到最高值，因此，選用30℃作為發(fā)酵溫度；考慮到發(fā)酵成本，故選擇3小時(shí)最佳；同時(shí)在pH為7時(shí)，硒含量最高，因此選擇pH為7。

值得注意的是，所述步驟(4)中離心分離出的上清液，可以回收，繼續(xù)應(yīng)用到糖蜜培養(yǎng)基的制備中，以進(jìn)一步降低成本，提高原料利用率。

同時(shí)，本發(fā)明還提供一種上述制備方法制備得到的納米硒。所述納米硒為由酵母細(xì)胞包裹的活性納米硒，在高溫下仍能表現(xiàn)具有活性的紅色納米硒，穩(wěn)定性好。

優(yōu)選地，所述納米硒顆粒大小為30～40nm。

相對(duì)于現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明的有益效果為：

本發(fā)明所述制備方法利用啤酒發(fā)酵廢液濃縮發(fā)酵制備納米硒，發(fā)酵周期極短，一定程度上可以省去滅菌這一環(huán)節(jié)，大幅度降低了設(shè)備要求及成本投入，同時(shí)資源再利用，為環(huán)境減輕了壓力，變廢為寶、成本低、制備效率高，亞硒酸鈉轉(zhuǎn)化率高達(dá)90％以上，最高單位硒含量11470ppm，具有較大的經(jīng)濟(jì)效益和環(huán)境效益。

本發(fā)明所制備得到的納米硒在高溫下仍能表現(xiàn)具有活性的紅色納米硒，穩(wěn)定性好，適于工業(yè)生產(chǎn)與應(yīng)用。

附圖說明

圖1為本發(fā)明所述納米硒實(shí)拍圖；

圖2為破碎提取得到的納米硒掃描電鏡圖；

圖3為酵母細(xì)胞透射電鏡圖；

圖4為糖濃度對(duì)納米硒轉(zhuǎn)化的影響圖；

圖5為亞硒酸鈉添加量對(duì)納米硒轉(zhuǎn)化的影響圖；

圖6為發(fā)酵時(shí)間對(duì)納米硒轉(zhuǎn)化的影響圖。

具體實(shí)施方式

為更好的說明本發(fā)明的目的、技術(shù)方案和優(yōu)點(diǎn)，下面將結(jié)合附圖和具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說明。

實(shí)施例1

本發(fā)明所述納米硒的制備方法的一種實(shí)施例，本實(shí)施例所述納米硒的制備方法，包括如下步驟：

(1)在糖蜜質(zhì)量百分比為10％的糖蜜水解液中加入亞硒酸鈉、硫酸銨、維生素營(yíng)養(yǎng)液，121℃高溫滅菌，得到糖蜜培養(yǎng)基；所述培養(yǎng)基中，糖度為5°Be′，亞硒酸鈉的濃度為1mg/mL，硫酸銨的質(zhì)量百分比為2.5％，維生素營(yíng)養(yǎng)液的質(zhì)量百分比為0.5％；

(2)將啤酒發(fā)酵廢液在低速離心機(jī)下進(jìn)行分離，得到沉淀酵母泥；

(3)將步驟(2)所得酵母泥和步驟(1)所得糖蜜培養(yǎng)基按(1：2.5)g/mL的質(zhì)量體積比進(jìn)行混合，使用1mol/L鹽酸調(diào)節(jié)pH至7，逐漸升溫至30℃，持續(xù)發(fā)酵3h；得到發(fā)酵液；

(4)以3000r/min離心5min得到菌體，重復(fù)清洗3次洗去表面硒鹽，高溫下干燥，粉碎，即得所述納米硒。

由本實(shí)施例所述制備方法制備得到的納米硒，為由酵母細(xì)胞包裹的活性納米硒，顆粒大小為30nm。

實(shí)施例2

本發(fā)明所述納米硒的制備方法的一種實(shí)施例，本實(shí)施例所述納米硒的制備方法，包括如下步驟：

(1)在糖蜜質(zhì)量百分比為10％的糖蜜水解液中加入亞硒酸鈉、硫酸銨、維生素營(yíng)養(yǎng)液，121℃高溫滅菌，得到糖蜜培養(yǎng)基；所述培養(yǎng)基中，糖度為3°Be′，亞硒酸鈉的濃度為0.1mg/mL，硫酸銨的質(zhì)量百分比為2％，維生素營(yíng)養(yǎng)液的質(zhì)量百分比為0.1％；

(2)將啤酒發(fā)酵廢液在低速離心機(jī)下進(jìn)行分離，得到沉淀酵母泥；

(3)將步驟(2)所得酵母泥和步驟(1)所得糖蜜培養(yǎng)基按(1：2)g/mL的質(zhì)量體積比進(jìn)行混合，使用1mol/L鹽酸調(diào)節(jié)pH至4，逐漸升溫至25℃，持續(xù)發(fā)酵2h；得到發(fā)酵液；

(4)以3000r/min離心5min得到菌體，重復(fù)清洗3次洗去表面硒鹽，高溫下干燥，粉碎，即得所述納米硒。

由本實(shí)施例所述制備方法制備得到的納米硒，為由酵母細(xì)胞包裹的活性納米硒，顆粒大小為40nm。

實(shí)施例3

本發(fā)明所述納米硒的制備方法的一種實(shí)施例，本實(shí)施例所述納米硒的制備方法，包括如下步驟：

(1)在糖蜜質(zhì)量百分比為10％的糖蜜水解液中加入亞硒酸鈉、硫酸銨、維生素營(yíng)養(yǎng)液，121℃高溫滅菌，得到糖蜜培養(yǎng)基；所述培養(yǎng)基中，糖度為7°Be′，亞硒酸鈉的濃度為1.5mg/mL，硫酸銨的質(zhì)量百分比為0.5％，維生素營(yíng)養(yǎng)液的質(zhì)量百分比為1％；

(2)將啤酒發(fā)酵廢液在低速離心機(jī)下進(jìn)行分離，得到沉淀酵母泥；

(3)將步驟(2)所得酵母泥和步驟(1)所得糖蜜培養(yǎng)基按(1：0.5)g/mL的質(zhì)量體積比進(jìn)行混合，使用1mol/L鹽酸調(diào)節(jié)pH至8，逐漸升溫至32℃，持續(xù)發(fā)酵4h；得到發(fā)酵液；

(4)以3000r/min離心5min得到菌體，重復(fù)清洗3次洗去表面硒鹽，高溫下干燥，粉碎，即得所述納米硒。

由本實(shí)施例所述制備方法制備得到的納米硒，為由酵母細(xì)胞包裹的活性納米硒，顆粒大小為35nm。

實(shí)施例4

本實(shí)施例利用透射電鏡和掃描電鏡對(duì)實(shí)施例1～3所制備得到的納米硒的結(jié)構(gòu)、形態(tài)及粒徑進(jìn)行進(jìn)一步的觀察、表征、分析。

通過表征觀察圖3中酵母細(xì)胞周圍及胞質(zhì)中存在大量的密集顆粒，其酵母細(xì)胞大小約為3～4um，其中顆粒大小約為30～40nm顆粒，通過破碎提取得到納米硒沉淀通過掃描電鏡觀察，如圖2所示，其顆粒大約為40nm左右顆粒，與圖3中的判斷一致，通過對(duì)產(chǎn)品烘干粉碎得到產(chǎn)品置于空氣中放置1月后(效果圖如圖1)為鮮紅色，是紅色活性納米硒的特征顏色，由此判斷通過該種方法制備的納米硒為活性納米硒。

實(shí)施例5

本實(shí)施例對(duì)本發(fā)明所述納米硒制備方法中糖度、硒添加量、發(fā)酵時(shí)間的選擇進(jìn)行研究，研究采用控制單一變量的方法，具體研究數(shù)據(jù)如圖4～6所示。

由圖4可以看出，糖度越高，轉(zhuǎn)化的硒含量越高，但酵母量隨著糖度的增加，呈現(xiàn)先增后減的趨勢(shì)，當(dāng)糖度為5°Be′時(shí)，單位酵母量最大。

由圖5可知，隨著亞硒酸鈉濃度的增加，轉(zhuǎn)化的硒含量呈現(xiàn)先增后減的趨勢(shì)，酵母量隨著亞硒酸鈉濃度的增加緩慢下降，當(dāng)亞硒酸鈉的添加量為1mg/mL時(shí)，轉(zhuǎn)化的納米硒含量最高，最高可達(dá)到11470ppm，酵母量又下降的不明顯。

由圖6可知，發(fā)明人在對(duì)發(fā)酵時(shí)間的研究中，發(fā)現(xiàn)在前3小時(shí)內(nèi)，單位硒含量急劇上升，在3～12小時(shí)緩慢上升至平穩(wěn)狀態(tài)，這可能是酵母細(xì)胞中本身存在大量的某一還原性物質(zhì)，在迅速的將有毒亞硒酸鈉還原為單質(zhì)硒吸附在細(xì)胞內(nèi)，而后由于還原性物質(zhì)的缺乏，通過酵母細(xì)胞的生長(zhǎng)代謝作用緩慢的將亞硒酸鈉富集到細(xì)胞中。同時(shí)，干酵母的量隨著發(fā)酵時(shí)間的增加有緩慢下降的趨勢(shì)，因此發(fā)酵時(shí)間選擇3～12小時(shí)，此時(shí)單位硒含量基本達(dá)到最大值，而酵母含量又下降的不明顯，同時(shí)圖6也進(jìn)一步說明本發(fā)明所述方法的發(fā)酵時(shí)間短的優(yōu)勢(shì)。

最后所應(yīng)當(dāng)說明的是，以上實(shí)施例僅用以說明本發(fā)明的技術(shù)方案而非對(duì)本發(fā)明保護(hù)范圍的限制，盡管參照較佳實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作了詳細(xì)說明，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，可以對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案進(jìn)行修改或者等同替換，而不脫離本發(fā)明技術(shù)方案的實(shí)質(zhì)和范圍。