本發(fā)明屬生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及一個水稻基因OsDF1及其抗病調(diào)控功能的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、植物基因克隆技術(shù)

植物基因克隆方法有很多種，隨著基因組序列測定完成的植物物種的增多，基于數(shù)據(jù)庫序列的植物基因克隆方法得到越來越廣泛的應(yīng)用。該方法操作步驟主要包括基于保守序列的引物設(shè)計(jì)，目的植物組織RNA提取，反轉(zhuǎn)錄酶-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)，PCR產(chǎn)物與載體的連接，連接產(chǎn)物的細(xì)菌轉(zhuǎn)化，質(zhì)粒提取，酶切檢驗(yàn)，測序分析等。

2、植物基因表達(dá)控制和基因功能分析技術(shù)

植物基因的功能通過基因表達(dá)和蛋白積累來執(zhí)行。因此，基因功能通常通過比較分析基因的超常規(guī)表達(dá)與正常表達(dá)情況下的表型(Phenotype)或功能發(fā)揮情況來判斷和明確?；虻某Ｒ?guī)表達(dá)包括高于正常水平的表達(dá)和低于正常水平的表達(dá)兩大類。高于正常水平的表達(dá)主要為超表達(dá)/過表達(dá)(Over-expression)，主要通過連接一個強(qiáng)啟動子來驅(qū)動目的基因表達(dá)的方式來達(dá)到。低于正常水平的表達(dá)主要通過RNA干擾(RNA interfering,RNAi)、基因敲除(Knock-out)等方式來達(dá)到。RNAi通過構(gòu)建和轉(zhuǎn)化一個含有同一序列片段相反方向插入一個內(nèi)含子或其它不表達(dá)的序列形成的發(fā)卡結(jié)構(gòu)來實(shí)現(xiàn)，結(jié)果是目的基因表達(dá)的降低?；蚯贸?Knock-out)則通過在植物基因組中的目的基因中插入一個長的非植物序列或切除目的基因等方式來達(dá)到，結(jié)果是目的基因表達(dá)的完全或近乎完全的抑制。構(gòu)建基因超表達(dá)植株和/或RNAi植株、基因敲除突變體，比較這些植株的表型和性狀與野生型/正常植株的差異，就能明確目的基因?qū)υ撔誀畹恼{(diào)節(jié)功能。

3、植物轉(zhuǎn)基因技術(shù)

用于將外源基因?qū)肽康闹参?，從而獲取攜帶外源基因的轉(zhuǎn)基因植物。包括基因槍法，農(nóng)桿菌介導(dǎo)法等。農(nóng)桿菌介導(dǎo)法包括將目的基因克隆入植物表達(dá)載體，表達(dá)載體對農(nóng)桿菌的轉(zhuǎn)化，攜帶表達(dá)載體的農(nóng)桿菌對目的植物組織的感染，轉(zhuǎn)基因植株的再生以及植株中基因轉(zhuǎn)化和表達(dá)情況的檢測分析等步驟。

4、植物抗病性檢測分析技術(shù)

植物病原物包括真菌、卵菌、細(xì)菌、菌原體、病毒和線蟲等多種類型。不同類型病原物的接種方法各不相同。對于真菌，能產(chǎn)生分生孢子的，通常以分生孢子懸浮液噴霧接種植物。不產(chǎn)生分生孢子的，則以菌絲塊等接種植物。對于卵菌，一般先培養(yǎng)產(chǎn)生大量孢子囊，而后低溫培養(yǎng)使之釋放游動孢子，最后以游動孢子懸浮液接種植物。對于細(xì)菌，常以菌體懸浮液剪葉、針刺、注射、噴霧等法接種植物。對于病毒，常以提純的病毒粒子或人工體外轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物摩擦、注射、或通過昆蟲等傳播媒介接種植物。對于菌原體，常通過傳播介體接種或者嫁接接種。對于線蟲，常以一定數(shù)量的二齡幼蟲接觸植物根部莖基部或根圍土壤中接種植物。多數(shù)情況下，接種后需要保持較高的相對濕度，合適的溫度和光照條件。接種后按不同時(shí)間點(diǎn)連續(xù)觀察病害發(fā)生癥狀，統(tǒng)計(jì)發(fā)病率和發(fā)病嚴(yán)重度，計(jì)算病情指數(shù)，采用RT-PCR檢測病原物生物量。通過與感病對照植物發(fā)病情況的對比分析，明確目標(biāo)植物的抗病性。

5、植物抗病育種技術(shù)

主要可以分為傳統(tǒng)抗病育種和通過基因工程抗病育種兩大類。傳統(tǒng)抗病育種因?yàn)橛刑烊贿z傳隔離現(xiàn)象使抗病資源可用范圍受到顯著限制，只能應(yīng)用遺傳關(guān)系較近的抗病資源，而且需要多次雜交和回交等，因此選育周期長，且需要大量人力物力。而基因工程育種方法是通過將外源的抗病調(diào)控基因通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的方法等技術(shù)導(dǎo)入植物，使其獲得原來不具有的抗病性。因此，基因工程育種方法打破了天然遺傳隔離現(xiàn)象的限制，拓寬了抗病資源可用范圍，而且具有操作相對簡單方便、培育周期短、無需大量人工物力的特點(diǎn)。另外，可通過導(dǎo)入一個廣譜抗病調(diào)控基因，或者多個不同抗病譜的基因，創(chuàng)制具有廣譜抗病的品種。因此具有特別適宜培育廣譜、持久抗病品種等優(yōu)點(diǎn)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供一個水稻(Oryza sativa)基因，是對水稻細(xì)菌性病害抗性的調(diào)控作用以及由此確定對該基因的命名OsDF1。本發(fā)明克隆的OsDF1基因的核苷酸序列如SEQ ID：1所示，該基因的開放閱讀框(ORF)長1512bp，編碼的蛋白由503個氨基酸組成，其序列如SEQ ID：2所示。該基因編碼產(chǎn)物不包含任何已知功能的結(jié)構(gòu)域。本發(fā)明克隆的序列與水稻品種日本晴的基因組注釋的LOC_Os07g01060.3有很高的相似性，僅有5個堿基的區(qū)別：LOC_Os07g01060.3序列的G148替換為A；T407替換為G；T427替換為C；A1171替換為C；G1309替換為T。這些點(diǎn)突變導(dǎo)致氨基酸產(chǎn)生相應(yīng)的變化：LOC_Os07g01060.3序列的V50替換為I；V136替換為G；C143替換為R；T391替換為P；V437替換為F。在本發(fā)明之前，該基因沒有任何名稱，也沒有關(guān)于其功能的任何公開報(bào)告。本發(fā)明首次通過構(gòu)建該基因的超表達(dá)轉(zhuǎn)基因水稻及其抗病分析，闡明了該基因?qū)λ炯?xì)菌性病害抗性的調(diào)控作用。結(jié)果顯示，超表達(dá)轉(zhuǎn)基因水稻植株廣泛降低了對水稻細(xì)菌性條斑病(Xanthomonas oryzae pv.oryzicola,Xoc)和水稻白葉枯病菌(Xanthomonas oryzae pv.oryzae,Xoo)的抗性。本發(fā)明揭示了該基因?qū)λ炯?xì)菌病害抗性的廣譜負(fù)調(diào)控功能(具體見實(shí)施例1中的說明)。因此，本發(fā)明將該基因命名為Oryza sativa defense-related 1(簡稱OsDF1)。

本發(fā)明的另一個目的是提供所述的水稻OsDF1基因通過創(chuàng)制轉(zhuǎn)基因水稻來獲取抗病性得到改變的水稻材料中的應(yīng)用，包括(1)在通過創(chuàng)制超表達(dá)OsDF1的轉(zhuǎn)基因水稻純合系來獲得降低對水稻細(xì)菌性病害抗性的水稻材料中的應(yīng)用(具體見實(shí)施例1中的說明)；以及(2)在通過創(chuàng)制OsDF1-RNAi的轉(zhuǎn)基因水稻純合系來獲得增高對水稻細(xì)菌性病害廣譜抗性的水稻材料中的應(yīng)用(具體見實(shí)施例2中的說明)。

1.水稻OsDF1基因在通過創(chuàng)制超表達(dá)OsDF1的轉(zhuǎn)基因水稻純合系來獲得降低對水稻細(xì)菌性病害抗性的水稻材料中的應(yīng)用。通過以下步驟實(shí)現(xiàn)：

(1)OsDF1基因超表達(dá)結(jié)構(gòu)的構(gòu)建和獲取

將OsDF1基因開放閱讀框(ORF)克隆入一個植物表達(dá)載體，使其受強(qiáng)啟動子的驅(qū)使表達(dá)。

(2)轉(zhuǎn)化OsDF1基因超表達(dá)結(jié)構(gòu)的農(nóng)桿菌的獲取

將構(gòu)建好的OsDF1基因超表達(dá)結(jié)構(gòu)通過電擊等方法轉(zhuǎn)化對水稻具有強(qiáng)侵染能力的農(nóng)桿菌菌株。

(3)超表達(dá)OsDF1的轉(zhuǎn)基因水稻創(chuàng)制和獲取

通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將OsDF1基因超表達(dá)結(jié)構(gòu)導(dǎo)入水稻，獲取轉(zhuǎn)OsDF1基因超表達(dá)結(jié)構(gòu)的水稻。

(4)超表達(dá)OsDF1的轉(zhuǎn)基因水稻純合系的獲取

分別以抗生素抗性和OsDF1基因表達(dá)為檢測指標(biāo)，檢測轉(zhuǎn)基因植株后代的性狀分離情況，獲取后代性狀不再分離的、并能穩(wěn)定遺傳的超表達(dá)OsDF1的轉(zhuǎn)基因水稻純合系。

(5)對細(xì)菌病害抗性下降的超表達(dá)OsDF1的轉(zhuǎn)基因水稻純合系篩選鑒定和獲取

以超表達(dá)OsDF1的轉(zhuǎn)基因水稻純合系為材料，檢測分析對各類水稻細(xì)菌病害的抗性，獲取抗細(xì)菌病害能力下降的轉(zhuǎn)OsDF1基因水稻。

2.水稻OsDF1基因在通過創(chuàng)制OsDF1-RNAi的轉(zhuǎn)基因水稻純合系來獲得增高對水稻細(xì)菌性病害廣譜抗性的水稻材料中的應(yīng)用。通過以下步驟實(shí)現(xiàn)：

(1)OsDF1基因RNAi結(jié)構(gòu)的構(gòu)建和獲取

將OsDF1基因的一個特異性序列片段克隆入中間表達(dá)載體pENTR，再將重組結(jié)構(gòu)pENTR-OsDF1與RNAi載體(pANDA載體)進(jìn)行LR酶反應(yīng)，獲取RNAi結(jié)構(gòu)pANDA-OsDF1。

(2)轉(zhuǎn)化OsDF1基因RNAi結(jié)構(gòu)的農(nóng)桿菌的獲取

將OsDF1基因RNAi結(jié)構(gòu)(pANDA-OsDF1)通過電擊等方法轉(zhuǎn)化對水稻具有強(qiáng)侵染能力的農(nóng)桿菌菌株。

(3)轉(zhuǎn)OsDF1基因RNAi結(jié)構(gòu)水稻的創(chuàng)制和獲取

通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將OsDF1基因RNAi結(jié)構(gòu)導(dǎo)入水稻，獲取轉(zhuǎn)OsDF1基因RNAi結(jié)構(gòu)的水稻。

(4)轉(zhuǎn)OsDF1基因RNAi結(jié)構(gòu)水稻純合系的獲取

分別以抗生素抗性和OsDF1基因表達(dá)為檢測指標(biāo)，檢測轉(zhuǎn)基因植株后代的性狀分離情況，獲取后代性狀不再分離的、并能穩(wěn)定遺傳的轉(zhuǎn)OsDF1基因RNAi結(jié)構(gòu)的水稻純合系。

(5)抗細(xì)菌病害的轉(zhuǎn)OsDF1基因RNAi結(jié)構(gòu)水稻純合系的篩選鑒定和獲取

以轉(zhuǎn)OsDF1基因RNAi結(jié)構(gòu)(pANDA-OsDF1)的水稻純合系為材料，檢測分析對各類細(xì)菌病原物所致病害的抗性，獲取抗細(xì)菌病害的OsDF1基因RNAi水稻。

本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)：(1)本發(fā)明提供的OsDF1基因是優(yōu)質(zhì)抗細(xì)菌病害調(diào)控基因資源，利用該基因獲取的抗病材料具有抗病譜廣等優(yōu)點(diǎn)。水稻對細(xì)菌性條斑病菌(Xoc)和水稻白葉枯病菌(Xoo)的抗性機(jī)制有明顯差異，因此，同時(shí)兼抗Xoc和Xoo的基因資源很少。另外，水稻對Xoc的抗性還沒有顯性主效的抗病基因(Resistance gene)被發(fā)現(xiàn)和鑒定，目前尚缺乏高抗的抗性品種和資源。本發(fā)明提供的OsDF1基因此前功能完全未知，本發(fā)明研究發(fā)現(xiàn)該基因兼具對Xoc和Xoo的負(fù)調(diào)控作用，可通過構(gòu)建OsDF1-RNAi水稻創(chuàng)制和獲取兼具對Xoc和Xoo廣譜抗性的新材料。因此，OsDF1基因是一種適用于創(chuàng)制和選育廣譜抗細(xì)菌病害的水稻新材料和新品種的全新基因資源。(2)獲取抗病材料周期短。獲取抗病植物材料和品種的方法主要有常規(guī)的傳統(tǒng)育種方法和利用抗病調(diào)控基因的基因工程育種方法。傳統(tǒng)育種方法具有可用抗病資源范圍受天然遺傳隔離限制，選育周期長，需要大量人工物力等缺點(diǎn)。而基因工程育種方法則具有可用抗病資源范圍廣、操作相對簡單方便、培育周期短、無需大量人工物力、特別適宜培育廣譜、持久、高抗病性品種等優(yōu)點(diǎn)。本發(fā)明利用抗病調(diào)控基因OsDF1，采用基因工程方法，創(chuàng)制培育強(qiáng)烈抗細(xì)菌病害的水稻材料，具有周期短，選育快速等特點(diǎn)。

附圖說明

圖1為OsDF1超表達(dá)水稻純合系及其親本水稻葉片接種水稻細(xì)菌性條斑病菌后的癥狀和菌量檢測分析結(jié)果比較圖。OsDF1超表達(dá)水稻純合系69-1及其親本水稻葉片采用針筒浸潤法接種水稻細(xì)菌性條斑病菌(Xoc)菌株oxy04和ROS105。左：接種Xoc菌株10天后的癥狀；右：接種后葉片內(nèi)的Xoc菌量檢測結(jié)果。結(jié)果表明，與親本相比，OsDF1超表達(dá)水稻純合系69-1形成更長的病斑，菌量也顯著增加。表明OsDF1基因的超表達(dá)降低了對水稻細(xì)菌性條斑病的抗性，揭示OsDF1對水稻細(xì)菌性條斑病抗性起負(fù)調(diào)控作用。

圖2為OsDF1超表達(dá)水稻純合系及其親本水稻葉片接種水稻白葉枯病菌后的癥狀和菌量檢測分析結(jié)果比較圖。OsDF1超表達(dá)水稻純合系69-1及其親本水稻葉片采用剪葉法接種水稻白葉枯病菌(Xoo)菌株P(guān)XO99。上：接種Xoo菌株14天后的癥狀；下：接種后葉片內(nèi)的Xoo菌量檢測結(jié)果。結(jié)果表明，與親本相比，OsDF1超表達(dá)水稻純合系69-1形成更長的枯死病斑，菌量也顯著增加。表明OsDF1基因的超表達(dá)降低了對水稻白葉枯病的抗性，揭示OsDF1對水稻白葉枯病抗性起負(fù)調(diào)控作用。

具體實(shí)施方式

本發(fā)明結(jié)合附圖和實(shí)施例作進(jìn)一步的說明。

實(shí)施例1

本發(fā)明克隆了一個水稻基因，首次通過構(gòu)建超表達(dá)轉(zhuǎn)基因水稻，闡明了該基因的廣譜抗細(xì)菌調(diào)控功能，揭示了該基因?qū)λ炯?xì)菌病害抗性具有廣譜負(fù)調(diào)控功能。因此，本發(fā)明將該基因命名為Oryza sativa defense-related 1(簡稱OsDF1)。因?yàn)镺sDF1基因的超表達(dá)導(dǎo)致水稻對細(xì)菌病害抗性的顯著下降，因此，可以通過構(gòu)建OsDF1基因的超表達(dá)水稻純合系來創(chuàng)建獲取對水稻細(xì)菌病害抗性下降的水稻新材料，用于基因功能分析等用途。OsDF1基因的克隆和功能分析、對水稻細(xì)菌病害抗性下降的水稻新材料創(chuàng)制和獲取的主要步驟包括：

1)水稻OsDF1基因的克隆和保存

本發(fā)明提供的水稻OsDF1基因通過以下步驟克隆獲得。先根據(jù)水稻基因組數(shù)據(jù)庫中OsDF1序列設(shè)計(jì)了引物OsDF1-F(5’-caggcgcgcc atg tgc att atc ttt gct ggt-3’，斜體部分為AscⅠ酶切位點(diǎn))(序列如SEQ ID：3所示)，以及OsDF1-R2(5’-caggtacc cat gct ctg aaa atg ctg ctg-3’，斜體部分為KpnⅠ酶切位點(diǎn))(序列如SEQ ID：4所示)。采用TRIZOL試劑提取水稻葉片總RNA，采用RT-PCR方法擴(kuò)增獲取OsDF1cDNA，通過1％瓊脂糖凝膠電泳后割膠純化回收PCR產(chǎn)物，連接pMD19-mT載體，熱擊轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，在LB培養(yǎng)基中搖菌培養(yǎng)過夜，提取質(zhì)粒，采用AscⅠ/KpnⅠ酶切的方法和以O(shè)sDF1-F/OsDF1-R2為引物對的PCR方法分別檢驗(yàn)所提取的質(zhì)粒是否包含OsDF1基因，最后送公司測序驗(yàn)證，從而成功克隆和獲取OsDF1基因cDNA全長序列。OsDF1核苷酸序列如SEQ ID：1所示，該基因的開放閱讀框(ORF)長1512bp，編碼的蛋白由503個氨基酸組成，其序列如SEQ ID：2所示。該基因編碼產(chǎn)物不包含任何已知功能的結(jié)構(gòu)域。經(jīng)過BLASTn分析發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明克隆獲得的OsDF1基因水稻品種日本晴的基因組注釋的LOC_Os07g01060.3有很高的相似性，僅有5個堿基的區(qū)別：LOC_Os07g01060.3序列的G148替換為A；T407替換為G；T427替換為C；A1171替換為C；G1309替換為T。這些點(diǎn)突變導(dǎo)致氨基酸產(chǎn)生相應(yīng)的變化：LOC_Os07g01060.3序列的V50替換為I；V136替換為G；C143替換為R；T391替換為P；V437替換為F。在本發(fā)明之前，該基因功能沒有任何公開報(bào)告。

轉(zhuǎn)化了攜帶有OsDF1基因序列的載體的大腸桿菌，保存于－80℃冰箱。因此，可隨時(shí)通過活化菌株，提取質(zhì)粒，通過PCR擴(kuò)增和酶切，將OsDF1基因亞克隆至目的載體中，用于轉(zhuǎn)基因等研究。

2)OsDF1基因超表達(dá)結(jié)構(gòu)的構(gòu)建和獲取

對上述1)中獲取的pMD19-OsDF1質(zhì)粒以及植物超表達(dá)載體pCZD分別先進(jìn)行Kpn I酶切、隨后進(jìn)行Asc I酶切，將酶切后的目的基因與同樣酶切后的pCZD載體進(jìn)行連接、連接產(chǎn)物進(jìn)行大腸桿菌轉(zhuǎn)化、氨芐抗生素培養(yǎng)基平板篩選、酶切和PCR鑒定等步驟獲取OsDF1基因超表達(dá)結(jié)構(gòu)pCZD-OsDF1。超表達(dá)載體pCZD以玉米Ubq啟動子驅(qū)動目的基因的表達(dá)，同時(shí)攜帶HA標(biāo)簽，便于分子鑒定和基因功能研究。

3)轉(zhuǎn)化OsDF1基因超表達(dá)結(jié)構(gòu)pCZD-OsDF1的農(nóng)桿菌的獲取

將OsDF1基因超表達(dá)結(jié)構(gòu)pCZD-OsDF1通過電擊等方法轉(zhuǎn)化對水稻具有強(qiáng)侵染力的農(nóng)桿菌菌株，如EHAl05，在含鏈霉素和卡那霉素的YEP培養(yǎng)基上篩選轉(zhuǎn)化子，再通過Asc I+Kpn I雙酶切和PCR鑒定，獲取攜帶OsDF1基因超表達(dá)結(jié)構(gòu)pCZD-OsDF1的農(nóng)桿菌。用于下一步水稻的遺傳轉(zhuǎn)化。

4)轉(zhuǎn)OsDF1基因超表達(dá)結(jié)構(gòu)pCZD-OsDF1水稻的創(chuàng)制和獲取

通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將OsDF1基因超表達(dá)結(jié)構(gòu)pCZD-OsDF1導(dǎo)入水稻。分為水稻愈傷組織的誘導(dǎo)、攜帶pANDA-OsDF1的農(nóng)桿菌感染水稻愈傷組織、潮霉素抗性植株的再生和鑒定等幾大步驟，最后獲取再生的轉(zhuǎn)pCZD-OsDF1的水稻T₀代。具體操作步驟如下：

(i)水稻愈傷組織的誘導(dǎo)

種胚表面的消毒和清洗：取成熟完好的日本晴水稻種子，剝?nèi)シN皮，留下完整的種胚。用70％乙醇溶液浸泡種胚1min，倒掉乙醇后用50％次氯酸鈉溶液浸泡種胚，放在搖床上28℃，180rpm消毒40min。倒掉次氯酸鈉溶液，用滅菌的ddH₂O洗滌種胚至少10次，直至液體干凈透明為止。用滅菌的濾紙風(fēng)干種胚后，用鑷子小心把種胚放入NB1固體培養(yǎng)基上，每個培養(yǎng)皿約30粒種子。之后用保鮮膜密封，置于培養(yǎng)箱中28℃暗培養(yǎng)。

愈傷組織的誘導(dǎo)：將種胚放在NB1上培養(yǎng)15天后，將分化出的愈傷組織轉(zhuǎn)移到新鮮的NB2培養(yǎng)基上，在28℃黑暗條件下再培養(yǎng)10天。將健康亮黃的愈傷組織轉(zhuǎn)移到NB3上培養(yǎng)大約10天。注意，為了提供充足營養(yǎng)，一個NB2板轉(zhuǎn)成2個NB3板進(jìn)行培養(yǎng)。

愈傷組織的繼代培養(yǎng)：將健康的愈傷組織從NB3換至NB4上，在28℃黑暗條件下培養(yǎng)9天，此時(shí)的愈傷組織最適合農(nóng)桿菌感染。

(ii)水稻愈傷組織的農(nóng)桿菌感染

農(nóng)桿菌的培養(yǎng)：將攜帶有OsDF1基因RNAi結(jié)構(gòu)pANDA-OsDF1的根癌農(nóng)桿菌EHA105菌株從-80℃中取出，在含鏈霉素和卡那霉素的LB平板上劃線，置于28℃恒溫箱內(nèi)培養(yǎng)(約2d)，長出菌落后挑取單菌落，分別接種于含相應(yīng)抗生素的50mL YEP培養(yǎng)液中，27℃恒溫?fù)u床(180rpm)培養(yǎng)約48h至OD₆₀₀為0.5-0.8，轉(zhuǎn)入無菌離心管中，室溫條件下5000×g離心10min，去掉上清液，菌體用25mL AAM-AS培養(yǎng)液重新懸浮清洗后，再在相同的條件下離心一次，最后用約50mL AAM-AS培養(yǎng)液重新懸浮菌體到OD₆₀₀為0.05-0.1(約10⁹個細(xì)胞/mL)，置于冰上即可用于水稻的轉(zhuǎn)化。

農(nóng)桿菌侵染：選擇生長健康帶亮黃色的愈傷組織，用勺子小心地刮進(jìn)無菌的的小培養(yǎng)皿中，然后將重懸好的農(nóng)桿菌液倒入培養(yǎng)皿中，盡量使菌液浸沒所有愈傷組織，保持浸泡約30min，期間不時(shí)地輕輕搖晃。之后用滅菌的膠頭滴管將菌液盡可能多地吸出。

共培養(yǎng)：將侵染過的愈傷組織放入NB-AS培養(yǎng)基上22℃黑暗培養(yǎng)3d。

帶菌愈傷組織在抗性篩選前的清洗：共培養(yǎng)3d后，將帶菌的愈傷組織集中放到500mL無菌瓶中，用滅菌的蒸餾水清洗愈傷組織8～10次直到液體透明，然后加入200mL含Amp(200mg/mL)和Cef(300mg/mL)的ddH₂O，將其放到搖床，180rpm、27℃恒溫下?lián)u動30min，然后用滅菌的膠頭滴管將洗出液吸出，最后將清洗干凈的愈傷轉(zhuǎn)入NB-CHA培養(yǎng)基，在28℃黑暗下培養(yǎng)14d后用于抗性篩選。

(iii)潮霉素抗性植株的再生

抗性篩選培養(yǎng)：將愈傷組織分系轉(zhuǎn)入含抗生素(Cef，300mg/mL；Hyg，50mg/mL)的NB-CH1篩選培養(yǎng)基上，在28℃黑暗下培養(yǎng)，進(jìn)行抗生素抗性篩選；

繼代培養(yǎng)：將NB-CH1上經(jīng)抗性篩選再生的潮霉素抗性愈傷組織，以系的方式轉(zhuǎn)入含抗生素(Cef，300mg/mL；Hyg，50mg/mL)的NB-CH2篩選培養(yǎng)基上，在28℃黑暗下繼代培養(yǎng)一次，培養(yǎng)時(shí)間大約1周。

抗性愈傷組織的預(yù)分化培養(yǎng)：將具有抗潮霉素的愈傷組織以系的方式轉(zhuǎn)入含抗生素(Hyg，50mg/mL)預(yù)分化培養(yǎng)基Pre-H上，在28℃黑暗下培養(yǎng)15d。

抗性愈傷組織的再分化培養(yǎng)：將預(yù)分化充分的抗性愈傷以系的方式轉(zhuǎn)入含抗生素(Hyg，50mg/mL)再分化培養(yǎng)基R-50上，在27℃光條件下培養(yǎng)大約3周。

生根培養(yǎng)：待潮霉素抗性愈傷組織分化出小根和綠色小芽，且小根長到1cm以上進(jìn)行生根培養(yǎng)。用鑷子將變綠的抗性芽從分化培養(yǎng)基上挑出，轉(zhuǎn)入到含有抗生素(Hyg，50mg/mL)的1/2MS生根培養(yǎng)基上進(jìn)行生根培養(yǎng)。

土壤種植：等潮霉素抗性苗長到根系完全后，將T₀代無菌小苗在27℃下開蓋培養(yǎng)鍛煉2d，然后移栽到水田取回的熟土中，置于溫室中進(jìn)行常規(guī)管理，最后收獲得到T₀種子。

5)轉(zhuǎn)OsDF1基因超表達(dá)結(jié)構(gòu)pCZD-OsDF1的水稻純合系的篩選鑒定和獲取

分別以潮霉素抗性和OsDF1基因表達(dá)為檢測指標(biāo)，檢測轉(zhuǎn)基因植株后代的性狀分離情況。潮霉素抗性篩選在含潮霉素的平板上針對水稻種子開展進(jìn)行，觀察能否在潮霉素抗性平板上正常生長成健康小苗?；虮磉_(dá)采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR等方法進(jìn)行檢測。獲取后代性狀不再分離的、并能穩(wěn)定遺傳的轉(zhuǎn)OsDF1基因超表達(dá)結(jié)構(gòu)pCZD-OsDF1的水稻純合系。這些水稻純合系在潮霉素抗性平板上全部能正常生長成健康小苗、且OsDF1基因表達(dá)水平顯著高于轉(zhuǎn)空載體的對照。

6)OsDF1基因超表達(dá)水稻純合系的抗病性檢測分析

以5)中獲取的OsDF1基因超表達(dá)水稻純合系為材料，檢測分析其對水稻細(xì)菌病原物所致病害的抗性，從而明確OsDF1基因?qū)λ炯?xì)菌病害抗性的調(diào)控作用，為利用該基因創(chuàng)建和獲取抗細(xì)菌病害水稻奠定基礎(chǔ)。

檢測分析的病原物包括：水稻細(xì)菌性條斑病菌(Xanthomonas oryzae pv.oryzicola,Xoc)菌株oxy04和ROS105、水稻白葉枯病菌(Xanthomonas oryzae pv.oryzae,Xoo)菌株P(guān)XO99。對于Xoc，采用浸潤法接種。先搖菌制成濃度為OD₆₀₀＝1.0的Xoc細(xì)菌懸浮液，再以無菌一次性針筒浸潤水稻葉片。對于Xoo，采用剪葉法接種。先搖菌制成濃度為OD₆₀₀＝1.0的Xoo細(xì)菌懸浮液，再以無菌剪刀蘸取菌液，在離葉尖3cm處剪葉，置于大塑料筐中覆膜保濕48h。

接種結(jié)果顯示，親本對照水稻葉片在浸潤接種Xoc菌株oxy04和ROS105后10天，分別形成長度達(dá)10.1mm和6.7mm的沿維管束擴(kuò)展的水漬狀病斑，上面還形成菌膿。OsDF1基因超表達(dá)水稻純合系69-1葉片在浸潤接種這兩個Xoc菌株后，形成的水漬狀病斑平均長達(dá)28.8mm和9.7mm，為對照的2.9倍和1.5倍。而且接種oxy04菌株的69-1葉片形成的菌膿顯著多于對照葉片(圖1左)。菌量檢測分析結(jié)果顯示，親本對照水稻葉片在接種Xoc菌株oxy04和ROS105的發(fā)病區(qū)域菌量分別為9.42×10⁸cfu/葉和2.80×10⁸cfu/葉。而OsDF1超表達(dá)水稻純合系69-1葉片的菌量平均高達(dá)2.95×10⁹cfu/葉和5.13×10⁸cfu/葉，分別為親本對照的3.13倍和1.83倍(圖1右)。對水稻白葉枯病菌Xoo菌株P(guān)XO99的類似分析結(jié)果顯示，親本對照水稻葉片在剪葉接種后14天，形成長度達(dá)16.2cm的枯死病斑，主要沿葉片兩側(cè)擴(kuò)展。而OsDF1基因超表達(dá)水稻純合系69-1葉片則形成了平均長達(dá)23.6cm的枯死病斑，長度為對照的1.5倍，而且枯死病斑是整葉向前擴(kuò)展(圖2上)。菌量檢測分析結(jié)果顯示，親本對照水稻葉片的發(fā)病區(qū)域菌量分別為1.24×10⁹cfu/葉。而OsDF1超表達(dá)水稻純合系69-1葉片的菌量平均高達(dá)2.65×10⁹cfu/葉，為親本對照的2.14倍(圖2下)。

這些結(jié)果表明，OsDF1超表達(dá)水稻純合系69-1對Xoc菌株oxy04和ROS105、Xoo菌株P(guān)XO99的抗性顯著低于親本對照。OsDF1基因的超表達(dá)導(dǎo)致水稻對這些菌株抗性的顯著下降，因此，OsDF1對水稻抗細(xì)菌性條斑病和白葉枯病均起負(fù)調(diào)控作用?？梢酝ㄟ^構(gòu)建OsDF1-RNAi水稻純合系來創(chuàng)建獲取高抗水稻細(xì)菌性條斑病的水稻新材料和新品種。

實(shí)施例2

根據(jù)如上所述的本發(fā)明闡明的水稻基因OsDF1的抗細(xì)菌負(fù)調(diào)控功能，建立了一套利用構(gòu)建該基因的RNAi轉(zhuǎn)基因水稻、采用基因工程技術(shù)創(chuàng)制和獲取廣譜抗水稻細(xì)菌性病害水稻新材料的技術(shù)體系。主要步驟包括：

(1)OsDF1基因RNAi結(jié)構(gòu)的構(gòu)建和獲取

根據(jù)本發(fā)明克隆的OsDF1序列設(shè)計(jì)引物OsDF1-F2(5’-ttggatcc gaa tct ttg gtt gag aga agc-3’，斜體部分為Bam HI酶切位點(diǎn))(序列如SEQ ID：5所示)，以及OsDF1-R3(5’-ttctcgag cat gct ctg aaa atg ctg ctg-3’，斜體部分為XhoI酶切位點(diǎn))(序列如SEQ ID：6所示)。以實(shí)施例1中的1)中獲取的pMD19-OsDF1質(zhì)粒為模板，OsDF1-F2/OsDF1-R3為引物對，通過PCR擴(kuò)增獲取長為300bp的OsDF1片段，然后通過Bam HI/XhoI雙酶切、連接、轉(zhuǎn)化、卡那霉素培養(yǎng)基平板篩選、酶切和PCR鑒定等步驟獲取亞克隆了300bp OsDF1片段的中間表達(dá)載體pENTR(pENTR-OsDF1)。再將重組結(jié)構(gòu)pENTR-OsDF1與RNAi載體(帶有水稻ubi啟動子、GUS Linker序列和T-NOS終止子的pANDA載體)進(jìn)行LR酶反應(yīng)過夜，加蛋白激酶K后37℃反應(yīng)10min以充分終止反應(yīng)，反應(yīng)產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌后用含卡那霉素的培養(yǎng)基篩選陽性克隆，然后用SacI+KpnI雙酶切和PCR鑒定是否在pANDA載體的GUS Linker兩端正反雙向插入了300bp的OsDF1片段，從而獲取RNAi結(jié)構(gòu)pANDA-OsDF1。

(2)轉(zhuǎn)化OsDF1基因RNAi結(jié)構(gòu)的農(nóng)桿菌的獲取

將OsDF1基因RNAi結(jié)構(gòu)(pANDA-OsDF1)通過電擊等方法轉(zhuǎn)化對水稻具有強(qiáng)侵染能力的農(nóng)桿菌菌株，如EHAl05，在含鏈霉素和卡那霉素的YEP培養(yǎng)基上篩選轉(zhuǎn)化子，再通過SacI+KpnI雙酶切和PCR鑒定，獲取攜帶OsDF1基因RNAi結(jié)構(gòu)pANDA-OsDF1的農(nóng)桿菌。用于下一步水稻的遺傳轉(zhuǎn)化。

(3)轉(zhuǎn)OsDF1基因RNAi結(jié)構(gòu)水稻的創(chuàng)制和獲取

通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將OsDF1基因RNAi結(jié)構(gòu)pANDA-OsDF1導(dǎo)入水稻。主要步驟包括水稻愈傷組織的誘導(dǎo)、攜帶pANDA-OsASR2的農(nóng)桿菌感染水稻愈傷組織、潮霉素抗性植株的再生和鑒定等，最后獲取再生的轉(zhuǎn)pANDA-OsDF1的水稻T₀代。具體操作步驟同實(shí)施例1中的4)中如述。

(4)轉(zhuǎn)OsDF1基因RNAi結(jié)構(gòu)水稻純合系的獲取

分別以抗生素抗性和OsDF1基因表達(dá)為檢測指標(biāo)，檢測轉(zhuǎn)基因植株后代的性狀分離情況。潮霉素抗性篩選在含潮霉素的平板上針對水稻種子開展進(jìn)行，觀察能否在潮霉素抗性平板上正常生長成健康小苗?；虮磉_(dá)采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR等方法進(jìn)行檢測。獲取后代性狀不再分離的、并能穩(wěn)定遺傳的轉(zhuǎn)OsDF1基因RNAi結(jié)構(gòu)pANDA-OsDF1的水稻純合系。這些水稻純合系在潮霉素抗性平板上全部能正常生長成健康小苗、且OsDF1基因表達(dá)水平顯著低于轉(zhuǎn)空載體的對照。

(5)廣譜抗細(xì)菌病害的轉(zhuǎn)OsDF1基因RNAi結(jié)構(gòu)水稻純合系的篩選鑒定和獲取

以轉(zhuǎn)OsDF1基因RNAi結(jié)構(gòu)(pANDA-OsDF1)的水稻純合系為材料，檢測分析對各類細(xì)菌病原物所致病害的抗性，檢測分析的病原物包括：水稻細(xì)菌性條斑病菌(Xanthomonas oryzae pv.oryzicola,Xoc)、水稻白葉枯病菌(Xanthomonas oryzae pv.oryzae,Xoo)等。接種方法和抗病性評價(jià)同實(shí)施例1)中的6)中所述。

通過上述接種分析和抗病評價(jià)，篩選和獲取對Xoc和Xoo多個菌株均表現(xiàn)出抗性的、廣譜抗細(xì)菌病害的OsDF1基因RNAi水稻。

本發(fā)明結(jié)合圖1和圖2的結(jié)果，首次揭示了OsDF1對水稻細(xì)菌性病害抗性起廣譜的負(fù)調(diào)控作用。

<110> 浙江大學(xué)

<120> 水稻基因OsDF1及抗病調(diào)控功能的應(yīng)用

<160> 6

<210> 1

<211> 1512

<212> DNA

<213> 水稻（Oryza sativa）

<220>

<221> CDS

<222> (1)…(1512)

<400> 1

atgtgcatta tctttgctgg tgatgatggt cattcggagc aactagctct cctgaacaat 60

gaccatgaag tttcagaagt ttgtgttgaa gaaatttcag ctgataatac aggacgatct 120

ttcctcatca ggatttcaga atctaaaatt ttttactatt ggtgtgctga gaagtcaaag 180

aaacacggga tggaccttct tgcaaagatg aaaaatctac tgcagggaag gccaacactc 240

tctgatctca caggcatctc agattcacga ctggatgctt ttgccactca tctacacgct 300

tatcttgttg catcaagtat tggagatgtt aaatcgctgg gatcacttaa tgacttcctg 360

ggcgcttcaa gcccacaaga tcaatattta cagccctcat cagttggttc caagtcttca 420

cgcttccgca cctctgcagc taatgcagca aaagcaagtt ctgtctacca aactagtctg 480

agtcccagat gtggtgcttt taaagatgga gtgccaagga tgtcgtgtgc aaagattgct 540

ggaagagaca agctgaagcg acgtggggac tggctgagct catcaactgg tcctgatgac 600

gcaaatcttt tgacaccgaa gattgttagc tctgattctg ccagtgagaa gtgtggtggg 660

gactgttctg aaaacagtgc taattcacct cctctagact tgcctctttc atttcccttg 720

ttgccatctc tgtttcctct tgcgactcaa tatccacttc ctaaggattc tacagagcaa 780

ccatttaagc cttactattg ctggtgccca ccatgcccat cttctctgca gtacagtgta 840

acccctctgc atatgccagt tacatctgta gaaccactgc ccttgccgcc tttgagttct 900

ctgctatcaa atgatcagcc gccgacttca acagtttctg caaagatgga tacaactgat 960

ctcccgtcac ttaatcttcc atcgatactg cgtgatcctt tacttcacct gccgcttcct 1020

acttcaccac ttgtatcctt gcatggttca caagttccaa cattcacacc attgatgtct 1080

gaccccattg tgcatgtccc ggtcattgat gtgtgttcct ctggccaggc ttacctggtg 1140

agttgcgggc cttctatgtc tgcgactgtt cccctgctcc ctagcttgaa gcccctgatt 1200

ccagaaacag aatctttggt tgagagaagc gctagggaaa cactaatgag gcttatagcc 1260

tcaacaccat ctgcaagtaa tccccagctg gtgaacattc tccctgcatt ccttactgac 1320

gtgcctgaaa tgaatgtgag gaaacatctt ggtgtccatc caggcgacag gctaagctca 1380

tcttgtagcg tcgatgtgat tggacctggg tttgccgtca cagaggatga tgcatctgtt 1440

ggagatgggg ctcacgcaac ttttgcggaa tatgatgata tcggcgatca gcagcatttt 1500

cagagcatgt ag 1512

<210> 2

<211> 503

<212> PRT

<213> 水稻（Oryza sativa）

<400> 2

Met Cys Ile Ile Phe Ala Gly Asp Asp Gly His Ser Glu Gln Leu Ala

1 5 10 15

Leu Leu Asn Asn Asp His Glu Val Ser Glu Val Cys Val Glu Glu Ile

20 25 30

Ser Ala Asp Asn Thr Gly Arg Ser Phe Leu Ile Arg Ile Ser Glu Ser

35 40 45

Lys Ile Phe Tyr Tyr Trp Cys Ala Glu Lys Ser Lys Lys His Gly Met

50 55 60

Asp Leu Leu Ala Lys Met Lys Asn Leu Leu Gln Gly Arg Pro Thr Leu

65 70 75 80

Ser Asp Leu Thr Gly Ile Ser Asp Ser Arg Leu Asp Ala Phe Ala Thr

85 90 95

His Leu His Ala Tyr Leu Val Ala Ser Ser Ile Gly Asp Val Lys Ser

100 105 110

Leu Gly Ser Leu Asn Asp Phe Leu Gly Ala Ser Ser Pro Gln Asp Gln

115 120 125

Tyr Leu Gln Pro Ser Ser Val Gly Ser Lys Ser Ser Arg Phe Arg Thr

130 135 140

Ser Ala Ala Asn Ala Ala Lys Ala Ser Ser Val Tyr Gln Thr Ser Leu

145 150 155 160

Ser Pro Arg Cys Gly Ala Phe Lys Asp Gly Val Pro Arg Met Ser Cys

165 170 175

Ala Lys Ile Ala Gly Arg Asp Lys Leu Lys Arg Arg Gly Asp Trp Leu

180 185 190

Ser Ser Ser Thr Gly Pro Asp Asp Ala Asn Leu Leu Thr Pro Lys Ile

195 200 205

Val Ser Ser Asp Ser Ala Ser Glu Lys Cys Gly Gly Asp Cys Ser Glu

210 215 220

Asn Ser Ala Asn Ser Pro Pro Leu Asp Leu Pro Leu Ser Phe Pro Leu

225 230 235 240

Leu Pro Ser Leu Phe Pro Leu Ala Thr Gln Tyr Pro Leu Pro Lys Asp

245 250 255

Ser Thr Glu Gln Pro Phe Lys Pro Tyr Tyr Cys Trp Cys Pro Pro Cys

260 265 270

Pro Ser Ser Leu Gln Tyr Ser Val Thr Pro Leu His Met Pro Val Thr

275 280 285

Ser Val Glu Pro Leu Pro Leu Pro Pro Leu Ser Ser Leu Leu Ser Asn

290 295 300

Asp Gln Pro Pro Thr Ser Thr Val Ser Ala Lys Met Asp Thr Thr Asp

305 310 315 320

Leu Pro Ser Leu Asn Leu Pro Ser Ile Leu Arg Asp Pro Leu Leu His

325 330 335

Leu Pro Leu Pro Thr Ser Pro Leu Val Ser Leu His Gly Ser Gln Val

340 345 350

Pro Thr Phe Thr Pro Leu Met Ser Asp Pro Ile Val His Val Pro Val

355 360 365

Ile Asp Val Cys Ser Ser Gly Gln Ala Tyr Leu Val Ser Cys Gly Pro

370 375 380

Ser Met Ser Ala Thr Val Pro Leu Leu Pro Ser Leu Lys Pro Leu Ile

385 390 395 400

Pro Glu Thr Glu Ser Leu Val Glu Arg Ser Ala Arg Glu Thr Leu Met

405 410 415

Arg Leu Ile Ala Ser Thr Pro Ser Ala Ser Asn Pro Gln Leu Val Asn

420 425 430

Ile Leu Pro Ala Phe Leu Thr Asp Val Pro Glu Met Asn Val Arg Lys

435 440 445

His Leu Gly Val His Pro Gly Asp Arg Leu Ser Ser Ser Cys Ser Val

450 455 460

Asp Val Ile Gly Pro Gly Phe Ala Val Thr Glu Asp Asp Ala Ser Val

465 470 475 480

Gly Asp Gly Ala His Ala Thr Phe Ala Glu Tyr Asp Asp Ile Gly Asp

485 490 495

Gln Gln His Phe Gln Ser Met

500

<210> 3

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 根據(jù)水稻基因組數(shù)據(jù)庫提供的水稻基因序列設(shè)計(jì)和人工合成，用作引物

<400> 3

caggcgcgcc atg tgc att atc ttt gct ggt

<210> 4

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 根據(jù)水稻基因組數(shù)據(jù)庫提供的水稻基因序列設(shè)計(jì)和人工合成，用作引物

<400> 4

caggtacc cat gct ctg aaa atg ctg ctg

<210> 5

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 根據(jù)克隆的水稻基因序列設(shè)計(jì)和人工合成，用作引物

<400> 5

ttggatcc gaa tct ttg gtt gag aga agc

<210> 6

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 根據(jù)克隆的水稻基因序列設(shè)計(jì)和人工合成，用作引物

<400> 6

ttctcgag cat gct ctg aaa atg ctg ctg