本發(fā)明涉及一種用于快速篩選產(chǎn)多不飽和脂肪酸絲狀真菌的培養(yǎng)基，以及采用所述培養(yǎng)基快速篩選產(chǎn)油絲狀真菌的方法。

背景技術：

多不飽和脂肪酸(Polyunsaturated fatty acids,PUFAs)是指含有兩個或兩個以上雙鍵且碳鏈長度為18～22個碳原子的直鏈脂肪酸，在機體內(nèi)具有廣泛的生理功能和生物學效應。在生物分子類二十烷酸化合物、前列腺素、凝血黃素、白三烯等的合成中，PUFAs是極其重要的前體物質。PUFAs也是構成諸如細胞膜磷脂等生物結構的重要成分，并參與調(diào)控與生物膜相關的生理代謝過程，如細胞識別與免疫反應、低溫適應性等，對人類健康以及預防和治療慢性疾病具有極其重要的作用。

隨著市場對PUFAs需求的日益增長，供求平衡已被打破，人們開始尋找新的替代資源。產(chǎn)油微生物作為一種新型油脂來源，具有油脂含量高、生產(chǎn)周期短、生產(chǎn)成本低等優(yōu)點，是植物油和魚油的理想替代資源。目前雖然已分離到一些有價值的產(chǎn)油絲狀真菌，但尚不足以滿足工業(yè)化生產(chǎn)的需要。同時，產(chǎn)油絲狀真菌種類還不夠豐富，目前只有產(chǎn)ARA的菌株實現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)，而產(chǎn)EPA、DHA菌株尚未實現(xiàn)，因此，篩選優(yōu)良的產(chǎn)油絲狀真菌具有重要的現(xiàn)實意義。

然而，選育適于工業(yè)化生產(chǎn)的菌株是一項十分艱巨和繁重的工作，大多數(shù)研究多采用傳統(tǒng)方法篩選產(chǎn)油真菌，如脂肪粒計數(shù)法、蘇丹黑B染色法、碳饑餓檢出法等。脂肪粒計數(shù)法單純根據(jù)脂肪粒數(shù)目來判定菌體含油量的高低，當所含的脂肪粒數(shù)目較多時，脂肪粒之間相互重疊會引起較大誤差；蘇丹黑B染色法需要對每個菌進行染色脫色，根據(jù)染色后的顏色來判斷產(chǎn)脂率的高低，此方法雖較為準確，但需要使用顯微鏡觀察，十分耗時，不適合大批量篩選；碳饑餓檢出法是當微生物處于碳饑餓狀態(tài)時，細胞內(nèi)的脂肪粒作為碳源儲藏體被微生物降解用作生長碳源，因此，根據(jù)油脂含量越高的微生物在缺碳培養(yǎng)基上越具生長優(yōu)勢，就可以檢出產(chǎn)脂能力強的微生物，但此方法操作過于繁瑣、費時。由此可見，傳統(tǒng)篩選方法存在諸多弊端，無法做到快速、高效的定向篩選產(chǎn)油微生物。

氯化三苯基四氮唑(triphenyltetrazolium chloride，TTC)因可表征細胞內(nèi)脫氫酶的活性而被用作產(chǎn)油菌株的篩選指示劑。作為一種氧化劑，TTC溶于水時為無色溶液，被還原后生成紅色的三苯基甲臢(triphenyl formazan，TF)，根據(jù)反應前后顏色轉化速度及顏色深淺的不同，可以初步判定細胞內(nèi)脫氫酶的活性。朱敏等人通過研究Mortierella alpina的TTC染色程度與菌體油脂中花生四烯酸含量關系的發(fā)現(xiàn)TTC對菌體的染色程度與菌體油脂中的ARA含量具有正相關性(朱敏,余龍江,肖靚,馬德松.高山被孢霉的紅四氮唑染色程度與菌體油脂中花生四烯酸含量的關系.生命科學研究,2004,04:339-343)。此外，Zhu等人利用TTC對菌絲進行染色，成功地從眾多野生型產(chǎn)油菌株中分離到高產(chǎn)ARA的菌株(Zhu,M.,et al.,Isolating Mortierella alpina strains of high yield of arachidonic acid.Lett Appl Microbiol,2004.39(4):p.332-5.)。這些研究表明，TTC作為一種表征細胞內(nèi)脫氫酶活性的指示劑在快速篩選高產(chǎn)PUFAs菌株中的成功應用為其作為篩選指示劑直接用于傳統(tǒng)篩選高產(chǎn)多不飽和脂肪酸的產(chǎn)油微生物提供了可能性。在早前研究中，沒有直接將TTC添加到篩選培養(yǎng)基中篩選野生型高產(chǎn)多不飽和脂肪酸產(chǎn)油真菌的先例，但有篩選ARA高產(chǎn)突變株的研究(李翔宇.花生四烯酸高產(chǎn)菌株的誘變選育及發(fā)酵條件研究[D].江南大學,2015.)，因此，TTC在篩選高產(chǎn)ARA突變株方面的成功應用為TTC直接加入篩選培養(yǎng)基，通過平板上長出菌落的顏色及大小直觀判斷野生型菌株是否高產(chǎn)多不飽和脂肪酸及菌株生長性能提供了一種新的篩菌思路。然而TTC自身在光照下容易被還原，因此在培養(yǎng)過程中應避光培養(yǎng)。

抗性篩選法通常是篩選耐受性菌株及高產(chǎn)菌株的一種方法，通過向培養(yǎng)基中添加篩選壓力，從而快速篩選到目標菌。淺藍菌素(Cerulenin)作為一種真菌抗生素，它可以干擾正常的脂質代謝，通過與脂肪酸合酶(FAS)中的β-酮酯酰-ACP合酶末端絲氨酸上的-SH基共價結合，形成羥基內(nèi)酰胺環(huán)而使之失活。因此，淺藍菌素作為一種篩選抑制劑被用到篩選高產(chǎn)多不飽和脂肪酸的突變株中，只有脂肪酸合酶活性高的突變株才能在培養(yǎng)基上正常進行油脂積累代謝，形成正常的菌落，菌落越大，代表生長代謝能力越強，相應的FAS活性越高。當前，有研究將淺藍菌素作為抑制劑成功用于高產(chǎn)脂突變株的篩選，李仁民等采用添加了淺藍菌素的培養(yǎng)基對誘變后的產(chǎn)油酵母進行初篩，通過磷酸香草醛反應法對初篩菌體油脂含量進行定量分析，成功篩選出2株含油量高于對照90％以上的突變株(李仁民,王菊芳,馬爽,等.利用脂肪酸合成酶抑制劑和磷酸香草醛反應篩選高產(chǎn)油脂酵母.微生物學通報,2008,35(4):545-549.)。李翔宇等人也利用分步篩選策略將淺藍菌素及TTC分別添加到篩選培養(yǎng)基中，成功篩選到高產(chǎn)ARA的高山被孢霉突變株((李翔宇.花生四烯酸高產(chǎn)菌株的誘變選育及發(fā)酵條件研究[D].江南大學,2015.)。上述研究中淺藍菌素(cerulenin)的成功應用表明，淺藍菌素作為篩選抑制劑用于抗性篩選高產(chǎn)脂突變菌株是可行的。但是，將其做為篩選因子直接添加于初篩培養(yǎng)基篩選野生型產(chǎn)油菌的研究尚未有報道?；跍\藍菌素成功用于篩選高產(chǎn)脂突變株研究的基礎，為其作為抗性篩選劑直接用于快速篩選高產(chǎn)脂菌株提供了理論依據(jù)。

目前，關于TTC在產(chǎn)油微生物方面的研究多是將菌絲經(jīng)過染色后根據(jù)著色程度篩選高產(chǎn)ARA菌株，而有關淺藍菌素的研究主要集中在高產(chǎn)油突變菌株的篩選中，直接用于自然界中野生型產(chǎn)油菌株篩選的研究鮮有報道，并且將二者結合用于傳統(tǒng)野生型產(chǎn)油微生物篩選的研究尚未有報道?；趦烧叻謩e在產(chǎn)油微生物篩選方面的成功應用，將抗性篩選因子以及篩選指示劑相結合，利用淺藍菌素抑制低脂肪酸合酶活性的菌株以及TTC表征脫氫酶活性的顯色反應建立一種高效、定向篩選產(chǎn)油微生物的方法，通過對菌落顏色及生長速度的直觀判斷，高效、快速地將產(chǎn)脂性能優(yōu)良的菌株從所在微生物菌群中分離出來，這不僅對產(chǎn)油微生物育種具有重要意義，也可以為工業(yè)化生產(chǎn)功能性脂質以及生物能源轉化提供優(yōu)良菌株。

技術實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種快速篩選產(chǎn)多不飽和脂肪酸絲狀真菌的培養(yǎng)基，以及所述培養(yǎng)基的用途。

為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供一種用于快速篩選產(chǎn)多不飽和脂肪酸菌株的培養(yǎng)基，其特征在于所述培養(yǎng)基的組成為：葡萄糖20g/L，馬鈴薯提取物4g/L，瓊脂20g/L，添加淺藍菌素1×10^-7mol/L，氯化三苯基四氮唑0.5-2g/L，鏈霉素30mg/L，余量為水。

在本發(fā)明中，優(yōu)選地，培養(yǎng)基中的氯化三苯基四氮唑濃度為0.5g/L。

本發(fā)明還提供一種快速篩選產(chǎn)多不飽和脂肪酸菌株的方法，所述方法包括以下步驟：

(1)制備前述的用于快速篩選高產(chǎn)多不飽和脂肪酸絲狀真菌的培養(yǎng)基；

(2)采集待篩選樣品，置于4℃保存；

(3)將步驟(2)的樣品用0.9％生理鹽水進行適當梯度稀釋后，在步驟(1)的平板培養(yǎng)基上進行涂布，將涂布好的平板分別放置在4℃、16℃、28℃培養(yǎng)箱，避光培養(yǎng)；所述平板培養(yǎng)基的組成是：葡萄糖20g/L，馬鈴薯提取物4g/L，瓊脂20g/L，淺藍菌素1×10^-7mol/L，氯化三苯基四氮唑0.5g/L，鏈霉素30mg/L，余量為水；

(4)每天觀察步驟(3)的平板上菌落的生長情況，根據(jù)其生長速度以及菌落顏色深淺，選擇生長速度快、呈紅色的菌落(即排除小菌落、未變紅菌落)，采用菌絲邊緣純化法將其轉接到PDA培養(yǎng)基平板上，置于28℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)3天，然后繼續(xù)分離純化長出的菌株，直至將得到的純培養(yǎng)物作為待確認菌株；所述PDA培養(yǎng)基的組成為：葡萄糖20g/L，馬鈴薯提取物4g/L，瓊脂20g/L，余量為水；

(5)進行菌體發(fā)酵后收集菌體，所得菌體經(jīng)干燥并提取脂肪酸后經(jīng)GC-MS定量分析其脂肪酸組成，通過脂肪酸組成得到高產(chǎn)多不飽和脂肪酸菌株。

在本發(fā)明中，所述菌株可以是絲狀真菌或酵母菌。

根據(jù)一種優(yōu)選的實施方式，步驟(5)的菌體發(fā)酵是分別在種子培養(yǎng)基和搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基中里進行的，所述種子培養(yǎng)基的組成為：葡萄糖20g/L,酵母提取物5g/L,KH₂PO₄ 1g/L,MgSO₄.7H₂O 0.25g/L，KNO₃ 10g/L，余量為水；所述搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基的組成為：葡萄糖50g/L,酵母提取物5g/L,KH₂PO₄ 1g/L,MgSO₄.7H₂O 0.25g/L，KNO₃ 10g/L，余量為水；所述發(fā)酵是將步驟(4)的所述待確認菌株按1％接種量在種子培養(yǎng)基中在28℃、200rpm下活化36h，然后將活化后的菌體用無菌打碎頭打碎，按1％接種量轉接到新的種子培養(yǎng)基中，在28℃、200rpm下培養(yǎng)36h，傳代兩次后將所得菌體打碎，再按1％接種量將打碎的菌體接入搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基中，然后在28℃、200rpm條件下?lián)u瓶發(fā)酵培養(yǎng)7天。

優(yōu)選地，步驟(5)中，所述菌體凍干并磨碎后用酸熱破壁法提取脂肪酸，通過重量體積比為10％鹽酸甲醇(g/ml,鹽酸/甲醇)甲酯化得到脂肪酸甲酯，然后進行GC-MS定量分析脂肪酸組成，確認為高產(chǎn)菌株。

本發(fā)明是以脂肪酸合酶抑制劑——淺藍菌素(Cerulenin)和可以表征脫氫酶活性的氯化三苯基四氮唑(TTC)作為初篩因子，通過菌落直徑和菌落顏色(紅色)深淺作為初篩指標，從環(huán)境中快速、定向篩選高產(chǎn)多不飽和脂肪酸絲狀真菌，然后對目標菌進行發(fā)酵培養(yǎng)，收集濕菌體，凍干后磨碎，采用酸熱破壁法提取脂肪酸并甲酯化，用氣相色譜(gas chromatography,GC)和質譜(mass spectroscophy,MS)對脂肪酸組成進行定量分析。為了篩選產(chǎn)多不飽和脂肪酸菌株特別是絲狀真菌，傳統(tǒng)的染色法利用脂溶性染料對每個菌落的菌絲體進行染色，然后觀察脂滴的大小及著色程度來初步判斷菌株產(chǎn)脂性能，費時費力。

而本發(fā)明的方法篩選產(chǎn)多不飽和脂肪酸微生物簡單、快速、可定向，通過肉眼觀察即可排除大部分的非高產(chǎn)多不飽和脂肪酸菌株，經(jīng)過快速初步篩選后，只有少數(shù)初步篩選出的變紅的菌落進一步用GC-MS等方法定量分析其產(chǎn)脂性能即可確認為產(chǎn)多不飽和脂肪酸菌株，極大地簡化了產(chǎn)多不飽和脂肪酸絲狀真菌和產(chǎn)油酵母菌的篩選過程，提高了篩選效率，突破了傳統(tǒng)篩選方法耗時費力卻不易取得結果的不足。

【附圖說明】

圖1為不同濃度TTC染色效果；

其中，A.0；B.0.5g/L；C.1g/L；D.1.5g/L；E.2g/L

圖2為TTC染色效果；

其中，圖2A為TTC染色菌落；圖2B為TTC染色脂滴；

圖2C為未染色基內(nèi)菌絲；圖2D為TTC染色基內(nèi)菌絲；

【具體實施方式】

以下實施例用于非限制性地解釋本發(fā)明的技術方案。

在本發(fā)明中，如無特殊說明，“份”均為重量份，“％”均為重量百分百。

在本發(fā)明中，Broth培養(yǎng)基的組成為：葡萄糖20g/L,酵母提取物5g/L,KH₂PO₄ 1g/L,MgSO₄.7H₂O 0.25g/L，KNO₃ 10g/L；余量為水。

發(fā)酵培養(yǎng)基的組成為：葡萄糖50g/L,酵母提取物5g/L,KH₂PO₄ 1g/L,MgSO₄.7H₂O 0.25g/L，KNO₃ 10g/L；余量為水。

實施例1產(chǎn)多不飽和脂肪酸絲狀真菌高效篩選方法的建立

(1)菌株的選擇：實驗室野生型產(chǎn)油絲狀真菌高山被孢霉(Mortierella alpina ATCC 32222)；

(2)篩選方法的建立：以PDA培養(yǎng)基為基礎篩選培養(yǎng)基，以本實驗室已有產(chǎn)油絲狀真菌高山被孢霉(Mortierella alpina ATCC 32222)作為試驗菌。其中，篩選培養(yǎng)基的組成為：葡萄糖20g/L，馬鈴薯提取物4g/L，瓊脂20g/L，鏈霉素30mg/L，淺藍菌素1×10^-7mol/L，TTC添加濃度0.5—2.0g/L。28℃下避光培養(yǎng)3-7天時間。

(3)產(chǎn)多不飽和脂肪酸絲狀真菌的初篩：制備新鮮Mortierella alpina ATCC 32222孢子液，用0.9％生理鹽水進行適當梯度稀釋后，進行平板涂布(平板培養(yǎng)基的組成為：葡萄糖20g/L，馬鈴薯提取物4g/L，瓊脂20g/L，淺藍菌素1×10^-7mol/L，氯化三苯基四氮唑0.5—2g/L，鏈霉素30mg/L)，將涂布好的平板分別放置在4℃、16℃、28℃培養(yǎng)箱，避光培養(yǎng)。

不同濃度的TTC對Mortierella alpina ATCC 32222染色的影響如圖1所示。

圖1表明，經(jīng)過不含TTC的培養(yǎng)基中的菌落呈白色；當TTC濃度為0.5、1.0、1.5、2.0g/L時，菌落分別由淺到深呈紅色。因此，根據(jù)實驗結果，在保證一定顯色效果的基礎上選擇最低TTC濃度為0.5g/L。

圖2顯示TTC對高產(chǎn)多不飽和脂肪酸菌株菌體Mortierella alpina ATCC 32222的染色效果。其中，圖2A為TTC染色菌落：菌體產(chǎn)多不飽和脂肪酸含量越高，其菌落顏色(紅色)越深；圖2B為TTC染色脂滴，染色后脂滴呈紅色。圖2C為未染色基內(nèi)菌絲：培養(yǎng)基中未添加TTC，因此顏色未變紅；圖2D為TTC染色基內(nèi)菌絲，培養(yǎng)基中添加了TTC，因此菌絲體呈紅色，能夠肉眼辨別。

(4)產(chǎn)多不飽和脂肪酸絲狀真菌的純化及保藏：每天觀察步驟(4)的平板上菌落的生長情況，根據(jù)其生長速度以及菌落顏色深淺，選擇生長速度快，呈紅色的菌落(排除小菌落、未變紅菌落)，采用菌絲邊緣純化法將其轉接到PDA平板上(培養(yǎng)基組成為：葡萄糖20g/L，馬鈴薯提取物4g/L，瓊脂20g/L)，置于28℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)3天，然后繼續(xù)分離純化長出的菌株，最后依據(jù)菌落形態(tài)、菌絲形態(tài)、孢子形態(tài)將得到的純培養(yǎng)物進行形態(tài)學鑒定，將其作為待確認產(chǎn)多不飽和脂肪酸菌株,純化好的菌株用GY固體斜面培養(yǎng)基保藏。

(5)產(chǎn)脂性能評估：將純化好的待確認菌株在種子培養(yǎng)基(即Broth培養(yǎng)基)中進行活化，傳代兩次后按1％接種量將菌體接入搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基，然后28℃，200rpm，搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)7天，收集菌體。

所得菌體凍干磨碎后用酸熱破壁法提脂，用10％(w/v)鹽酸甲醇甲酯化得到脂肪酸甲酯，最后GC-MS定量分析脂肪酸組成，確認高產(chǎn)菌株。

菌株GC-MS分析脂肪酸組成的測定條件：

島津氣相色譜儀(GC 2010plus)，氣相柱Rt-wax(30m×0.25mm×0.25μm)，質譜儀(島津Ultra QP2010)。程序升溫條件：初始40℃，保持3min；以40℃/min的速率升溫至120℃；以35℃/min升溫至190℃，保持5min；以5℃/min升溫至220℃，保持16min。采用分流進樣，進樣量為1μL，分流比為10∶1，氦氣作為載氣。進樣器溫度和檢測器溫度均為250℃。離子源220℃，強度為70eV。

實施例2：自然環(huán)境中產(chǎn)多不飽和脂肪酸絲狀真菌的篩選

從青海-甘肅交界祁連山牧區(qū)草地地帶采集土樣，用清潔工具鏟去除表層土，取5-10cm處土壤約150g裝在滅菌離心管里。

與實施例1相同，通過稀釋涂布法，利用本發(fā)明的添加有1×10^-7mol/L的淺藍菌素和0.5g/L的氯化三苯基四氮唑(TTC)的培養(yǎng)基分離產(chǎn)油絲狀真菌，避光培養(yǎng)，待長出菌落后，根據(jù)生長速度以及菌落顏色(紅色)深淺，選取生長速度快、菌落直徑大、菌落呈紅色的菌株作為目標菌，采用菌絲邊緣純化法將目標菌轉接至PDA培養(yǎng)基平板上純化，將純化好的菌進行斜面4℃保藏。共分離純化得到絲狀真菌15株。

將所得15株絲狀真菌在Broth液體培養(yǎng)基里搖瓶培養(yǎng)，傳兩代后按百分之一接種量接種發(fā)酵培養(yǎng)基，28℃，200rpm，發(fā)酵7d，收集菌體。

將濕菌體真空冷凍干燥后磨碎，酸熱法破壁，提取脂肪酸，用10％鹽酸甲醇甲酯化，用氣相色譜(gas chromatography,GC)和質譜(mass spectroscophy,MS)對脂肪酸組成進行分析。分析結果顯示：15株菌種，其中6株菌脂質含量達20％以上，確認為產(chǎn)油菌株，分別為QL-3、QL-5、、QL-9、QL-11、QL-15和QL-17。結果見表1。

實施例3：自然環(huán)境的產(chǎn)多不飽和脂肪酸絲狀真菌的篩選

從內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學校園林地采集土樣，用清潔工具鏟去除表層土，取5-10cm處土壤約150g裝在滅菌離心管里。

與實施例1相同，通過稀釋涂布法，利用添加有1×10^-7mol/L的淺藍菌素和0.5g/L的氯化三苯基四氮唑(TTC)的培養(yǎng)基分離產(chǎn)油絲狀真菌，避光培養(yǎng)，待長出菌落后，根據(jù)生長速度以及菌落顏色(紅色)深淺，采用菌絲邊緣純化法將顏色深紅的目標菌轉接至PDA培養(yǎng)基平板上純化，將純化好的菌進行斜面4℃保藏。共分離純化得到絲狀真菌5株。

將篩選到的5株絲狀真菌在Broth液體培養(yǎng)基里搖瓶培養(yǎng)，傳兩代后按百分之一接種量接種發(fā)酵培養(yǎng)基，28℃，200rpm，發(fā)酵7d，收集菌體。

將濕菌體真空冷凍干燥后磨碎，酸熱法破壁，提取脂肪酸，10％鹽酸甲醇甲酯化，用氣相色譜(gas chromatography,GC)和質譜(mass spectroscophy,MS)對脂肪酸組成進行分析。分析結果顯示：5株絲狀真菌中的3株菌(N-1、N-4、N-5)脂質含量達20％以上，結果見表1。進一步表明本發(fā)明方法能夠用于篩選環(huán)境產(chǎn)油微生物并具有高效性。

實施例4：自然環(huán)境的產(chǎn)多不飽和脂肪酸絲狀真菌的篩選

從甘肅省秦安縣山頂果園采集土樣，用清潔工具鏟去除表層土，取5-10cm處土壤約150g裝在滅菌離心管里。

與實施例1相同，通過稀釋涂布法，利用添加有1×10^-7mol/L的淺藍菌素和0.5g/L的氯化三苯基四氮唑(TTC)的培養(yǎng)基分離產(chǎn)油絲狀真菌，避光培養(yǎng)，待長出菌落后，根據(jù)生長速度以及菌落顏色(紅色)深淺，采用菌絲邊緣純化法將目標菌轉接至PDA培養(yǎng)基平板上純化，將純化好的菌進行斜面4℃保藏。共分離純化得到絲狀真菌6株。

將篩選到的6株絲狀真菌在Broth液體培養(yǎng)基里搖瓶培養(yǎng)，傳兩代后按百分之一接種量接種發(fā)酵培養(yǎng)基，28℃，200rpm，發(fā)酵7d，收集菌體。

將濕菌體真空冷凍干燥后磨碎，酸熱法破壁，提取脂肪酸，10％鹽酸甲醇甲酯化，用氣相色譜(gas chromatography,GC)和質譜(mass spectroscophy,MS)對脂肪酸組成進行分析。分析結果顯示：5株菌(ZS-5、TSM-2、TSM-3、TSM-4、TSM-5)脂質含量達25％以上。確認為高產(chǎn)油菌株，結果見表1。

實施例5：自然環(huán)境的產(chǎn)多不飽和脂肪酸絲狀真菌的篩選

從四川省涼山采集土樣，用清潔工具鏟去除表層土，取5-10cm處土壤約150g裝在滅菌離心管里。

與實施例1相同，通過稀釋涂布法，利用添加有1×10^-7mol/L的淺藍菌素和0.5g/L的氯化三苯基四氮唑(TTC)的培養(yǎng)基分離產(chǎn)油絲狀真菌，避光培養(yǎng)，待長出菌落后，根據(jù)生長速度以及菌落顏色(紅色)深淺，采用菌絲邊緣純化法將目標菌轉接至PDA培養(yǎng)基平板上純化，將純化好的菌進行斜面4℃保藏。共分離純化得到絲狀真菌5株。

將篩選到的5株絲狀真菌在Broth液體培養(yǎng)基里搖瓶培養(yǎng)，傳兩代后按百分之一接種量接種發(fā)酵培養(yǎng)基，28℃，200rpm，發(fā)酵7d，收集菌體。

將濕菌體真空冷凍干燥后磨碎，酸熱法破壁，提取脂肪酸，10％鹽酸甲醇甲酯化，用氣相色譜(gas chromatography,GC)和質譜(mass spectroscophy,MS)對脂肪酸組成進行分析。分析結果顯示：其中2株菌(SL-2和SL-4)脂質含量分別達26％及30％，與ATCC 32222相比具有更高的生物量，確認為高產(chǎn)多不飽和脂肪酸菌株。結果見表1

表1菌株的生物量、總脂及脂肪酸組成(％總脂)

從以上篩選到菌株的生物量、總脂及脂肪酸組成可以看出，以實驗室已有菌株高山被孢霉(Mortierella alpine ATCC 32222)為對照，與本發(fā)明的培養(yǎng)基及快速篩選方法得到的產(chǎn)油絲狀真菌在相同培養(yǎng)條件下傳代、發(fā)酵培養(yǎng)，最后經(jīng)GC-MS定量分析它們的脂肪酸組成，結果證明本發(fā)明能夠簡單、快速、有效地實現(xiàn)從環(huán)境中快速篩選產(chǎn)油絲狀真菌。經(jīng)過此方法初篩得到的產(chǎn)油微生物與傳統(tǒng)方法初篩得到的產(chǎn)油微生物相比，其產(chǎn)油微生物所占比例大幅度提高，省略了傳統(tǒng)方法中間經(jīng)脂溶性染料對脂滴進行染色從而初步判定產(chǎn)脂率高低的步驟，節(jié)省了很多時間，為篩選優(yōu)勢產(chǎn)油工程菌株提供了極大方便。