本發(fā)明涉及生物醫(yī)藥領(lǐng)域中廣譜抑制HIV的脂肽、其衍生物、其藥物組合物及其用途。
背景技術(shù)：
：：引起艾滋病(AIDS)的人免疫缺陷病毒(HIV)分為1型和2型兩種。目前全球HIV感染人數(shù)大約3600萬(wàn)，HIV-1是主要的病原體，約有100-200萬(wàn)人由HIV-2感染引起，大多發(fā)生在西非地區(qū)。然而，HIV-2已逐漸傳播到歐洲、亞洲和北美等地區(qū)，對(duì)人類健康造成嚴(yán)重威脅[1]。疫苗是預(yù)防艾滋病的最好的手段，但有效的艾滋病疫苗近期恐難有重大突破。因此，研發(fā)阻斷病毒不同復(fù)制階段的藥物是目前防控艾滋病的重點(diǎn)策略。由于目前臨床應(yīng)用的艾滋病治療藥物都是根據(jù)HIV-1設(shè)計(jì)，導(dǎo)致許多藥物對(duì)HIV-2的活性有限，無(wú)法用于HIV-2感染的臨床治療。HIV進(jìn)入靶細(xì)胞由其表面的包膜糖蛋白(Env)介導(dǎo)[2]。該蛋白由表面亞基gp120和跨膜亞基gp41通過(guò)非共價(jià)鍵連接而成，在天然狀態(tài)下呈三聚體結(jié)構(gòu)。gp120的主要功能是與細(xì)胞受體CD4和輔助受體(如趨化因子受體CCR5或CXCR4等)結(jié)合，而gp41主要介導(dǎo)病毒和細(xì)胞的膜融合。研究發(fā)現(xiàn)，gp41膜外區(qū)包含幾個(gè)重要的功能區(qū)，包括疏水性融合肽(FP)、N-末端螺旋重復(fù)序列(NHR)、C-末端螺旋重復(fù)序列(CHR)。早在1997年，通過(guò)解析來(lái)源于NHR和CHR的多肽復(fù)合物的晶體結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)gp41的核心結(jié)構(gòu)為六股α-螺旋束(sixhelixbundle,6-HB)，其中三個(gè)NHR組成的N-螺旋通過(guò)在a和d位置的氨基酸殘基相互作用形成位于中心的螺旋三聚體，其e和g位置的氨基酸殘基則暴露于中心螺旋體的外圍，并與三個(gè)CHR組成的C-螺旋的a和d位置相互作用[3,4]。C-螺旋以反向平行的方式分別結(jié)合在三個(gè)N-螺旋形成的溝槽中。基于gp41的三維結(jié)構(gòu)信息提出了HIV-1膜融合機(jī)制：當(dāng)gp120與靶細(xì)胞上的受體結(jié)合后發(fā)生顯著的構(gòu)象變化，從而使gp41的融合肽暴露出來(lái)并插入靶細(xì)胞膜內(nèi)，CHR與NHR發(fā)生反向結(jié)合，形成穩(wěn)定的6-HB結(jié)構(gòu)，將病毒膜與靶細(xì)胞膜拉近而發(fā)生融合，從而介導(dǎo)HIV進(jìn)入靶細(xì)胞內(nèi)。晶體結(jié)構(gòu)揭示，NHR的C端部分形成明顯的疏水深口袋結(jié)構(gòu)(pocket),CHR的N端疏水口袋結(jié)合區(qū)(PBD)插入NHR疏水口袋，對(duì)穩(wěn)定6-HB結(jié)構(gòu)以及病毒的感染活性至關(guān)重要，被認(rèn)為是抗HIV藥物的新靶點(diǎn)[5,6]。來(lái)源于gp41NHR和CHR的多肽具有顯著的抗HIV活性，主要是通過(guò)與對(duì)應(yīng)的NHR或CHR結(jié)合而競(jìng)爭(zhēng)性地阻斷病毒本身6-HB的形成，從而阻斷病毒-細(xì)胞膜融合過(guò)程[7,8]。于2003年獲得美國(guó)FDA批準(zhǔn)的艾滋病治療藥物T-20(Enfuvirtide，F(xiàn)uzeon)即是來(lái)源于CHR的含有36個(gè)氨基酸殘基的多肽。T-20是第一個(gè)也是目前唯一批準(zhǔn)用于臨床治療的病毒膜融合抑制劑，但其容易誘導(dǎo)耐藥產(chǎn)生，而且對(duì)HIV-2活性很差，極大地限制了它的廣泛應(yīng)用[9]。長(zhǎng)度為39個(gè)氨基酸的多肽T1249是T20的第二代產(chǎn)品，具有較高的抑制HIV-1和HIV-2的能力，但由于其劑型和成本問(wèn)題而停止了臨床試驗(yàn)。所以，許多研究致力于研發(fā)新一代HIV膜融合抑制多肽。由于T-20不含重要的NHR口袋結(jié)合序列(PBD)，另一CHR多肽C34被廣泛作為新型抑制劑的設(shè)計(jì)模板[7]。然而，多數(shù)新設(shè)計(jì)的多肽同T-20和T1249一樣，都具有較長(zhǎng)的氨基酸序列，如T2635含有38個(gè)氨基酸，SC35EK含有35個(gè)氨基酸。中國(guó)臨床試驗(yàn)中的西夫韋肽(SFT)和艾博韋肽(ABT)分別有36和34個(gè)氨基酸。一些利用HIV-2和/或SIV序列設(shè)計(jì)的多肽也同樣較長(zhǎng)，如P3和C34EHO均含有34個(gè)氨基酸[10]。同時(shí)，多肽類藥物的一個(gè)明顯缺陷是其較短的生物半衰期，如T-20的半衰期僅為3.8小時(shí)，因此臨床上病人治療需要采用大劑量的頻繁注射(90mg/次，2次/天)。近年來(lái)ChongH等聚焦于HIV融合蛋白gp41的結(jié)構(gòu)與功能及抑制劑研究，提出了基于“M-T鉤子結(jié)構(gòu)”和“鹽橋螺旋結(jié)構(gòu)”設(shè)計(jì)靶向NHR疏水口袋短小多肽HIV膜融合抑制劑的新概念[11,12]。最近，XiongS等通過(guò)導(dǎo)入HIV-2/SIV序列所設(shè)計(jì)的多肽2P23僅有23個(gè)氨基酸，不但抗病毒活性高，而且比較廣譜，對(duì)HIV-1、HIV-2以及猴免疫缺陷病毒(SIV)都具有很強(qiáng)的抑制活性[13]。近年的研究也表明，通過(guò)對(duì)多肽進(jìn)行脂類化學(xué)修飾，即所謂的“脂肽”(lipopeptide),不但能提高多肽的抗病毒靶向性和活性，也能顯著改善多肽的穩(wěn)定性和生物半衰期，例如膽固醇修飾的C34(C34-Chol)[14]及棕櫚酸(C16)修飾的HP23短肽(LP-11)[15]。這些研究進(jìn)展都為設(shè)計(jì)新的HIV膜融合抑制劑奠定了堅(jiān)實(shí)的理論基礎(chǔ)和技術(shù)路線。參考文獻(xiàn)：1.deSilvaTI,CottenM,Rowland-JonesSL.HIV-2:theforgottenAIDSvirus.TrendsMicrobiol2008,16:588-595.2.ColmanPM,LawrenceMC.ThestructuralbiologyoftypeIviralmembranefusion.NatRevMolCellBiol2003,4:309-319.3.TanK,LiuJ,WangJ,ShenS,LuM.AtomicstructureofathermostablesubdomainofHIV-1gp41.ProcNatlAcadSciUSA1997,94:12303-12308.4.ChanDC,FassD,BergerJM,KimPS.Corestructureofgp41fromtheHIVenvelopeglycoprotein.Cell1997,89:263-273.5.ChanDC,KimPS.HIVentryanditsinhibition.Cell1998,93:681-684.6.ChanDC,ChutkowskiCT,KimPS.EvidencethataprominentcavityinthecoiledcoilofHIVtype1gp41isanattractivedrugtarget.ProcNatlAcadSciUSA1998,95:15613-15617.7.HeY.SynthesizedpeptideinhibitorsofHIV-1gp41-dependentmembranefusion.CurrPharmDes2013,19:1800-1809.8.EckertDM,KimPS.Mechanismsofviralmembranefusionanditsinhibition.AnnuRevBiochem2001,70:777-810.9.XuL,PozniakA,WildfireA,Stanfield-OakleySA,MosierSM,RatcliffeD,etal.Emergenceandevolutionofenfuvirtideresistancefollowinglong-termtherapyinvolvesheptadrepeat2mutationswithingp41.AntimicrobAgentsChemother2005,49:1113-1119.10.BorregoP,CaladoR,MarcelinoJM,PereiraP,QuintasA,BarrosoH,TaveiraN.AnancestralHIV-2/simianimmunodeficiencyviruspeptidewithpotentHIV-1andHIV-2fusioninhibitoractivity.AIDS2013,27:1081-1090.11.ChongH,QiuZ,SuY,YangL,HeY.DesignofahighlypotentHIV-1fusioninhibitortargetingthegp41pocket.AIDS2015,29:13-21.12.ChongH,YaoX,QiuZ,SunJ,ZhangM,WalterspergerS,etal.Short-peptidefusioninhibitorswithhighpotencyagainstwild-typeandenfuvirtide-resistantHIV-1.FASEBJ2013,27:1203-1213.13.XiongS,BorregoP,DingX,ZhuY,MartinsA,ChongH,TaveiraN,HeY.Ahelicalshort-peptidefusioninhibitorwithhighlypotentactivityagainstHIV-1,HIV-2andsimianimmunodeficiencyvirus.JVirol.2016，Dec16；91(1).pii：e01839-16PMID：27795437.14.IngallinellaP,BianchiE,LadwaNA,WangYJ,HrinR,VenezianoM,etal.AdditionofacholesterolgrouptoanHIV-1peptidefusioninhibitordramaticallyincreasesitsantiviralpotency.ProcNatlAcadSciUSA2009,106:5801-5806.15.ChongH,WuX,SuY,HeY.Developmentofpotentandlong-actingHIV-1fusioninhibitors.AIDS2016,30(8):1187-1196.技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明所要解決的一個(gè)技術(shù)問(wèn)題是如何提高具有抑制HIV-1和/或HIV-2和/或SIV活性的多肽對(duì)HIV-1和/或HIV-2和/或SIV抗病毒活性，和/或延長(zhǎng)其抗病毒活性持續(xù)時(shí)間。為了解決以上技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明提供了具有抗HIV-1和/或HIV-2和/或SIV活性的脂肽。本發(fā)明所提供的具有抗HIV-1和/或HIV-2和/或SIV活性的脂肽(化合物)為下述a)或b)：a)所述脂肽包括具有抗病毒活性的多肽，與所述多肽的羧基末端相連的連接臂，與所述連接臂相連的氨基酸X殘基和與所述氨基酸X殘基相連的親脂性化合物；所述氨基酸X為K、C、S、T或Y；b)所述脂肽包括具有抗病毒活性的多肽，與所述多肽的羧基末端相連的親脂性化合物；所述a)或b)中，所述病毒為下述v1-v7中的任一：v1、HIV-1、HIV-2和SIV；v2、HIV-1和HIV-2；v3、HIV-1和SIV；v4、HIV-2和SIV；v5、HIV-1；v6、HIV-2；v7、SIV。上述具有抗HIV-1和/或HIV-2和/或SIV活性的脂肽中，所述抗病毒活性也可稱為抑制病毒活性，具體可為抑制病毒進(jìn)行細(xì)胞融合和/或抑制病毒侵入細(xì)胞和/或抑制病毒復(fù)制。上述具有抑制HIV-1和/或HIV-2和/或SIV活性的脂肽中，所述a)或b)中，所述連接臂可為柔性連接臂，如為Fmoc-NH-PEGn-CH2CH2COOH，n為2、3、4、6、8、10、11或12，所述連接臂也可被本領(lǐng)域公知的其他柔性連接臂所替代；和/或，所述親脂性化合物可為含8到20個(gè)碳原子的脂肪酸(fattyacid)或膽固醇(cholesterol)、二氫(神經(jīng))鞘氨醇(dihydrosphingosine)；所述親脂性化合物可為維生素E(tocopherol)等。上述具有抑制HIV-1和/或HIV-2和/或SIV活性的脂肽中，所述含8到20個(gè)碳原子的脂肪酸可為棕櫚酸(又名軟脂酸)(C16)或硬脂酸(C18)。上述具有抑制HIV-1和/或HIV-2和/或SIV活性的脂肽中，所述具有抑制HIV-1和/或HIV-2和/或SIV活性的多肽中的所有氨基酸可為L(zhǎng)型氨基酸，其中的一個(gè)或多個(gè)氨基酸也可以用構(gòu)象為D-型的氨基酸、人工修飾的氨基酸、自然界存在的稀有氨基酸等進(jìn)行替換，以提高多肽的生物利用度、穩(wěn)定性和/或抗病毒活性。其中D-型氨基酸是指與組成蛋白質(zhì)的L型氨基酸相對(duì)應(yīng)的氨基酸；人工修飾的氨基酸指經(jīng)過(guò)甲基化、磷酸化等修飾的組成蛋白質(zhì)的常見L型氨基酸；自然界存在的稀有氨基酸包括組成蛋白質(zhì)的不常見氨基酸和不組成蛋白質(zhì)的氨基酸，例如5-羥基賴氨酸、甲基組氨酸、γ氨基丁酸、高絲氨酸等。上述具有抑制HIV-1和/或HIV-2和/或SIV活性的脂肽中，所述a)或b)中，所述多肽為P1-P20中的任一種：P1、序列表中序列1所示的多肽；即圖1中的LP-19、LP-20、LP-21、LP-22和LP-23的第1-23位氨基酸殘基所示的多肽；P2、在序列表中序列1所示多肽的任何位點(diǎn)添加或替代1個(gè)以上氨基酸殘基得到的衍生多肽，所述衍生多肽具有所述抗病毒活性；P3、序列表中序列2所示的多肽；即圖1中的LP-31的第1-31位氨基酸殘基所示的多肽；P4、在序列表中序列2所示多肽的任何位點(diǎn)添加或替代1個(gè)以上氨基酸殘基得到的衍生多肽，所述衍生多肽具有所述抗病毒活性；P5、序列表中序列3所示的多肽；即圖1中的LP-32的第1-31位氨基酸殘基所示的多肽；P6、在序列表中序列3所示多肽的任何位點(diǎn)添加或替代1個(gè)以上氨基酸殘基得到的衍生多肽，所述衍生多肽具有所述抗病毒活性；P7、序列表中序列4所示的多肽；即圖1中的LP-29的第1-34位氨基酸殘基所示的多肽；P8、在序列表中序列4所示多肽的任何位點(diǎn)添加或替代1個(gè)以上氨基酸殘基得到的衍生多肽，所述衍生多肽具有所述抗病毒活性；P9、序列表中序列5所示的多肽；即圖1中的LP-25的第1-25位氨基酸殘基所示的多肽；P10、在序列表中序列5所示多肽的任何位點(diǎn)添加或替代1個(gè)以上氨基酸殘基得到的衍生多肽，所述衍生多肽具有所述抗病毒活性；P11、序列表中序列6所示的多肽；即圖1中的LP-24的第1-25位氨基酸殘基所示的多肽；P12、在序列表中序列6所示多肽的任何位點(diǎn)添加或替代1個(gè)以上氨基酸殘基得到的衍生多肽，所述衍生多肽具有所述抗病毒活性；P13、序列表中序列7所示的多肽；即圖1中的LP-28的第1-31位氨基酸殘基所示的多肽；P14、在序列表中序列7所示多肽的任何位點(diǎn)添加或替代1個(gè)以上氨基酸殘基得到的衍生多肽，所述衍生多肽具有所述抗病毒活性；P15、序列表中序列8所示的多肽；即圖1中的LP-30的第1-30位氨基酸殘基所示的多肽；P16、在序列表中序列8所示多肽的任何位點(diǎn)添加或替代1個(gè)以上氨基酸殘基得到的衍生多肽，所述衍生多肽具有所述抗病毒活性；P17、序列表中序列9所示的多肽；即圖1中的LP-26的第1-27位氨基酸殘基所示的多肽；P18、在序列表中序列9所示多肽的任何位點(diǎn)添加或替代1個(gè)以上氨基酸殘基得到的衍生多肽，所述衍生多肽具有所述抗病毒活性；P19、序列表中序列10所示的多肽；即圖1中的LP-27的第1-28位氨基酸殘基所示的多肽；P20、在序列表中序列10所示多肽的任何位點(diǎn)添加或替代1個(gè)以上氨基酸殘基得到的衍生多肽，所述衍生多肽具有所述抗病毒活性。上述具有抑制HIV-1和/或HIV-2和/或SIV活性的脂肽中，所述衍生多肽由20到34個(gè)氨基酸殘基組成。上述具有抑制HIV-1和/或HIV-2和/或SIV活性的脂肽中，所述a)或b)中，為了提高穩(wěn)定性，所述脂肽還包括氨基端保護(hù)基和/或羧基端保護(hù)基，所述氨基端保護(hù)基連接在所述多肽的氨基末端上，所述羧基端保護(hù)基連接在所述多肽的羧基末端上。上述具有抑制HIV-1和/或HIV-2和/或SIV活性的脂肽中，所述脂肽為af)或bf)：af)、由所述具有抗病毒活性的多肽，與所述多肽的羧基末端相連的連接臂，與所述連接臂相連的氨基酸X殘基和與所述氨基酸X殘基相連的親脂性化合物和保護(hù)基組成；所述氨基酸X為K、C、S、T或Y；所述保護(hù)基為氨基端保護(hù)基和/或羧基端保護(hù)基，所述氨基端保護(hù)基連接在所述脂肽的氨基末端上，所述羧基端保護(hù)基連接在所述脂肽的羧基末端；bf)、由所述具有抗病毒活性的多肽，與所述多肽的羧基末端相連的親脂性化合物和保護(hù)基組成；所述保護(hù)基為氨基端保護(hù)基和/或羧基端保護(hù)基，所述氨基端保護(hù)基連接在所述脂肽的氨基末端上，所述羧基端保護(hù)基連接在所述脂肽的所述羧基末端。本發(fā)明的氨基端保護(hù)基可為乙?；被?、馬來(lái)酰基、琥珀?；?、叔丁氧羰基或芐氧或其他疏水基團(tuán)或大分子載體基團(tuán)中的任一基團(tuán)；所述羧基端保護(hù)基可為氨基、羧基、酰胺基或叔丁氧羰基或其他疏水基團(tuán)或大分子載體基團(tuán)中的任一基團(tuán)。上述具有抑制HIV-1和/或HIV-2和/或SIV活性的脂肽中，所述連接臂為Fmoc-NH-PEG8-CH2CH2COOH。Fmoc-NH-PEG8-CH2CH2COOH的英文名稱為1-(9H-fluoren-9-ylmethyl)ester或5,8,11,14,17,20,23,26-Octaoxa-2-azanonacosanedioicacid，C34H49NO12)。在具體脂肽化學(xué)合成過(guò)程中，F(xiàn)moc-NH-PEG8-CH2CH2COOH可由兩個(gè)Fmoc-NH-PEG4-CH2CH2COOH(英文名稱為Fmoc-15-amino-4,7,10,13-tetraoxapentadecacanoicacid)串聯(lián)而成。上述具有抑制HIV-1和/或HIV-2和/或SIV活性的脂肽具體可為圖1中的LP-19至LP-32這14個(gè)脂肽中的任一個(gè)脂肽。上述P1-P20中的任一種的多肽、其藥用鹽、或其衍生物也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。所述多肽的衍生物具體可為下述1)-5)中的至少一種：1)所述多肽的氨基端連接氨基端保護(hù)基和/或所述多肽的羧基端連接羧基端保護(hù)基得到的連接物；2)所述多肽的羧基端連接寡肽或親脂性化合物得到的連接物；3)所述多肽的氨基端連接寡肽或親脂性化合物得到的連接物；4)所述多肽的氨基端和羧基端均連接寡肽或親脂性化合物得到的連接物；5)所述多肽被蛋白質(zhì)、聚乙二醇、馬來(lái)酰亞胺修飾得到的修飾物。PM1或PM2的多聚體也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍：PM1、由所述脂肽、其藥用鹽、或其衍生物形成的多聚體；PM2、由所述多肽、其藥用鹽、或其衍生物形成的多聚體。下述組合物也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍：一種組合物，其包含C1)和C2)：C1)為C11)、C12)或/和C13)；所述C11)為所述脂肽、其衍生物、或其可藥用鹽；所述C12)為所述多肽、其衍生物、或其可藥用鹽；所述C13)為所述多聚體；C2)藥學(xué)上可接受的載體或輔料；所述組合物具有下述F1)-F5)中的至少一種功能：F1)抗病毒；F2)治療和/或預(yù)防和/或輔助治療病毒感染所致疾病(如艾滋病)；F3)抑制病毒進(jìn)行細(xì)胞融合；F4)抑制病毒侵入細(xì)胞；F5)抑制病毒復(fù)制；F1)-F5)中,所述病毒為下述v1-v7中的任一：v1、HIV-1、HIV-2和SIV；v2、HIV-1和HIV-2；v3、HIV-1和SIV；v4、HIV-2和SIV；v5、HIV-1；v6、HIV-2；v7、SIV。上述C11)、C12)、C13)或/和C14)在制備E1)-E5)中至少一種產(chǎn)品中的應(yīng)用也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍：所述C14)為所述組合物；所述E1)為抗病毒的產(chǎn)品，如藥物或疫苗；所述E2)為治療和/或預(yù)防和/或輔助治療病毒感染所致疾病(如艾滋病)的產(chǎn)品，如藥物或疫苗；所述E3)為抑制病毒進(jìn)行細(xì)胞融合的產(chǎn)品，如藥物或疫苗；所述E4)為抑制病毒侵入細(xì)胞的產(chǎn)品，如藥物或疫苗；所述E5)為抑制病毒復(fù)制的產(chǎn)品，如藥物或疫苗；所述E1)-E5)中，所述病毒為下述v1-v7中的任一：v1、HIV-1、HIV-2和SIV；v2、HIV-1和HIV-2；v3、HIV-1和SIV；v4、HIV-2和SIV；v5、HIV-1；v6、HIV-2；v7、SIV。為了解決以上技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明提供了藥用化合物。本發(fā)明所提供的藥用化合物為所述C11)、所述C12)或所述C13)。上述藥用化合物中，所述藥用化合物具有下述F1)-F5)中的至少一種功能：F1)抗病毒；F2)治療和/或預(yù)防和/或輔助治療病毒感染所致疾病；F3)抑制病毒進(jìn)行細(xì)胞融合；F4)抑制病毒侵入細(xì)胞；F5)抑制病毒復(fù)制；F1)-F5)中,所述病毒為下述v1-v7中的任一：v1、HIV-1、HIV-2和SIV；v2、HIV-1和HIV-2；v3、HIV-1和SIV；v4、HIV-2和SIV；v5、HIV-1；v6、HIV-2；v7、SIV。如下治療或/和預(yù)防病毒感染動(dòng)物的方法也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍：治療或/和預(yù)防病毒感染動(dòng)物的方法，包括給受體動(dòng)物施用所述C11)、所述C12)、所述C13)或/和C14)以抑制病毒感染動(dòng)物；所述C14)為所述組合物；所述病毒為下述v1-v7中的任一：v1、HIV-1、HIV-2和SIV；v2、HIV-1和HIV-2；v3、HIV-1和SIV；v4、HIV-2和SIV；v5、HIV-1；v6、HIV-2；v7、SIV。本發(fā)明所提供的脂肽或多肽、其衍生物、或其可藥用鹽，所述多聚體，所述組合物或所述藥用化合物，可以用于HIV(HIV-1和/或HIV-2)和/或SIV感染的治療和/或預(yù)防。在實(shí)際應(yīng)用中，可以將本發(fā)明的脂肽或多肽、其衍生物、或其可藥用鹽，所述多聚體，所述組合物或所述藥用化合物作為藥物直接給予病人、或者與適宜的載體或賦形劑混合后給予病人，以達(dá)到治療和/或預(yù)防HIV感染的目的。這里的載體材料包括但不限于水溶性載體材料(如聚乙二醇、聚乙烯吡咯烷酮、有機(jī)酸等)、難溶性載體材料(如乙基纖維素、膽固醇硬脂酸酯等)、腸溶性載體材料(如醋酸纖維素酞酸酯和羧甲乙纖維素等)。其中優(yōu)選的是水溶性載體材料。使用這些材料可以制成多種劑型，包括但不限于片劑、膠囊、滴丸、氣霧劑、丸劑、粉劑、溶液劑、混懸劑、乳劑、顆粒劑、脂質(zhì)體、透皮劑、口含片、栓劑、凍干粉針劑等?？梢允瞧胀ㄖ苿?、緩釋制劑、控釋制劑及各種微粒給藥系統(tǒng)。為了將單位給藥劑型制成片劑，可以廣泛使用本領(lǐng)域公知的各種載體。關(guān)于載體的例子是，例如稀釋劑與吸收劑，如淀粉、糊精、硫酸鈣、乳糖、甘露醇、蔗糖、氯化鈉、葡萄糖、尿素、碳酸鈣、白陶土、微晶纖維素、硅酸鋁等；濕潤(rùn)劑與粘合劑，如水、甘油、聚乙二醇、乙醇、丙醇、淀粉漿、糊精、糖漿、蜂蜜、葡萄糖溶液、阿拉伯膠漿、明膠漿、羧甲基纖維素鈉、紫膠、甲基纖維素、磷酸鉀、聚乙烯吡咯烷酮等；崩解劑，例如干燥淀粉、海藻酸鹽、瓊脂粉、褐藻淀粉、碳酸氫鈉與枸櫞酸、碳酸鈣、聚氧乙烯、山梨糖醇脂肪酸酯、十二烷基磺酸鈉、甲基纖維素、乙基纖維素等；崩解抑制劑，例如蔗糖、三硬脂酸甘油酯、可可脂、氫化油等；吸收促進(jìn)劑，例如季銨鹽、十二烷基硫酸鈉等；潤(rùn)滑劑，例如滑石粉、二氧化硅、玉米淀粉、硬脂酸鹽、硼酸、液體石蠟、聚乙二醇等。還可以將片劑進(jìn)一步制成包衣片，例如糖包衣片、薄膜包衣片、腸溶包衣片，或雙層片和多層片。為了將單位給藥劑型制成丸劑，可以廣泛使用本領(lǐng)域公知的各種載體。關(guān)于載體的例子是，例如稀釋劑與吸收劑，如葡萄糖、乳糖、淀粉、可可脂、氫化植物油、聚乙烯吡咯烷酮、Gelucire、高嶺土、滑石粉等；粘合劑如阿拉伯膠、黃蓍膠、明膠、乙醇、蜂蜜、液糖、米糊或面糊等；崩解劑，如瓊脂粉、干燥淀粉、海藻酸鹽、十二烷基磺酸鈉、甲基纖維素、乙基纖維素等。為了將單位給藥劑型制成栓劑，可以廣泛使用本領(lǐng)域公知的各種載體。關(guān)于載體的例子是，例如聚乙二醇、卵磷脂、可可脂、高級(jí)醇、高級(jí)醇的酯、明膠、半合成甘油酯等。為了將單位給藥劑型制成注射用制劑，如溶液劑、乳劑、凍干粉針劑和混懸劑，可以使用本領(lǐng)域常用的所有稀釋劑，例如，水、乙醇、聚乙二醇、1,3-丙二醇、乙氧基化的異硬脂醇、多氧化的異硬脂醇、聚氧乙烯山梨醇脂肪酸酯等。另外，為了制備等滲注射液，可以向注射用制劑中添加適量的氯化鈉、葡萄糖或甘油，此外，還可以添加常規(guī)的助溶劑、緩沖劑、pH調(diào)節(jié)劑等。此外，如需要，也可以向藥物制劑中添加著色劑、防腐劑、香料、矯味劑、甜味劑或其它材料。使用上述劑型可以經(jīng)注射給藥，包括皮下注射、靜脈注射、肌肉注射和腔內(nèi)注射等；腔道給藥，如經(jīng)直腸和陰道；呼吸道給藥，如經(jīng)鼻腔；粘膜給藥。上述給藥途徑優(yōu)選的是注射給藥。本發(fā)明的脂肽或多肽、其衍生物、或其可藥用鹽，所述多聚體，所述組合物或所述藥用化合物的給藥劑量取決于許多因素，例如所要預(yù)防或治療疾病的性質(zhì)和嚴(yán)重程度，患者或動(dòng)物的性別、年齡、體重及個(gè)體反應(yīng)，所用的具體活性成分，給藥途徑及給藥次數(shù)等。上述劑量可以單一劑量形式或分成幾個(gè)，例如二、三或四個(gè)劑量形式給藥。本發(fā)明的脂肽或多肽、其衍生物、或其可藥用鹽，所述多聚體，所述組合物或所述藥用化合物可以直接單獨(dú)用于HIV感染者的治療和預(yù)防，也可以與一種或多種抗HIV藥物聯(lián)合使用，以達(dá)到提高整體治療效果的目的。這些抗HIV藥物包括但不限于逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑、蛋白酶抑制劑、侵入抑制劑、整合抑制劑和成熟抑制劑等。上述的逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑可以是AZT、3TC、ddI、d4T、ddT、TDF、Abacavir、Nevirapine、Efavirenz和Delavirdine等的一種或幾種；上述的蛋白酶抑制劑可以是Saquinavirmesylate、Idinavir、Ritonavir、Amprenavir、Kaletra和Nelfinavirmesylate等的一種或幾種；上述的侵入抑制劑可以是Maraviroc、TAK-779、T-20、T2635、西夫韋肽、艾博韋肽、VIRIP(VIR-576)等的一種或幾種；上述的整合抑制劑可以是Raltegravir、Dolutegravir和Elvitegravi等的一種或幾種。對(duì)于任何具體的患者，具體的治療有效劑量水平須根據(jù)多種因素而定，所述因素包括所治療的障礙和該障礙的嚴(yán)重程度；所采用的具體活性成分的活性；所采用的具體組合物；患者的年齡、體重、一般健康狀況、性別和飲食；所采用的具體活性成分的給藥時(shí)間、給藥途徑和排泄率；治療持續(xù)時(shí)間；與所采用的具體活性成分組合使用或同時(shí)使用的藥物；及醫(yī)療領(lǐng)域公知的類似因素。例如，本領(lǐng)域的做法是，活性成分的劑量從低于為得到所需治療效果而要求的水平開始，逐漸增加劑量，直到得到所需的效果。一般說(shuō)來(lái)，本發(fā)明的脂肽或多肽、其衍生物、或其可藥用鹽，所述多聚體，所述組合物或所述藥用化合物用于哺乳動(dòng)物特別是人的劑量可以介于0.001－1000mg/kg體重/天，例如介于0.01－100mg/kg體重/天，又例如介于0.1－10mg/kg體重/天。本發(fā)明的脂肽LP-19具有廣譜、強(qiáng)效和長(zhǎng)效的優(yōu)點(diǎn)：1、LP-19具有較強(qiáng)的廣譜抗HIV-1、HIV-2和SIV活性，尤其對(duì)HIV-2和SIV顯示很強(qiáng)的優(yōu)勢(shì)作用:LP-19對(duì)HIV-1、HIV-2和SIV介導(dǎo)的細(xì)胞膜融合均具有強(qiáng)效的抑制作用，顯著高于三個(gè)對(duì)照多肽T-20、2P23和LP-11(圖3)；LP-19對(duì)HIV-1和SIV介導(dǎo)的細(xì)胞侵入均具有強(qiáng)效的抑制作用，顯著高于三個(gè)對(duì)照多肽T-20、2P23和LP-11(圖4)。LP-19對(duì)感染性HIV-1和HIV-2的抑制活性均顯著高于三個(gè)對(duì)照多肽T-20、2P23和LP-11(圖5)。2、LP-19對(duì)各種亞型HIV-1病毒的抑制活性也顯著高于三個(gè)對(duì)照多肽T-20、2P23和LP-11(圖6)。3、LP-19抑制T-20耐藥株的活性比T-20、2P23、LP-11分別高出10613.53倍、6.18倍和2.18倍；LP-19抑制2P23耐藥株的活性比T-20、2P23、LP-11分別高出173.63倍、45.09和6.83倍(圖7)。4、LP-19在猴子體內(nèi)表現(xiàn)為顯著的強(qiáng)效和長(zhǎng)效活性，皮下途徑抑制峰值為T-20的100倍以上，靜脈途徑抑制峰值為T-20的2000倍以上。LP-19即使在皮下注射60和72小時(shí)，其抑制峰值血清最大稀釋倍數(shù)分別為66倍和40倍，類似于T-20在2和4小時(shí)的表現(xiàn)(圖8)。LP-19的衍生物L(fēng)P-20至LP-32具有廣譜活性，既對(duì)HIV-1有效，也對(duì)HIV-2和SIV有效(圖1)。本發(fā)明所提供的脂肽、其衍生物、或其可藥用鹽，所述多聚體，所述組合物或所述藥用化合物，可以用于HIV(HIV-1和/或HIV-2)和/或SIV感染的治療和/或預(yù)防。在實(shí)際應(yīng)用中，可以將本發(fā)明的脂肽、其衍生物、或其可藥用鹽，所述多聚體，所述組合物或所述藥用化合物作為藥物直接給予病人、或者與適宜的載體或賦形劑混合后給予病人，以達(dá)到治療和/或HIV感染的目的。附圖說(shuō)明圖1為具有抑制HIV-1和/或HIV-2和/或SIV活性的脂肽的結(jié)構(gòu)及其抗病毒活性。圖2為HIV融合蛋白gp41的結(jié)構(gòu)與功能及多肽膜融合抑制劑。其中，F(xiàn)P指gp41融合肽；NHR指N-末端重復(fù)序列；CHR指C-末端重復(fù)序列；6-HB指六聚體螺旋。多肽序列中標(biāo)記為黑體的氨基酸為形成M-T鉤子的殘基，下劃線部分為口袋結(jié)合區(qū)(PBD)。圖2中所有多肽或脂肽的氨基末端均連接乙?；鳛榘被吮Ｗo(hù)基，所有多肽或脂肽的羧基末端均連接氨基作為羧基端保護(hù)基。圖3為L(zhǎng)P-19和對(duì)照多肽對(duì)HIV-1、HIV-2和SIV介導(dǎo)的細(xì)胞膜融合的抑制作用。圖4為L(zhǎng)P-19和對(duì)照多肽對(duì)HIV-1和SIV假病毒細(xì)胞進(jìn)入的抑制作用。圖5為L(zhǎng)P-19和對(duì)照多肽對(duì)HIV-1和HIV-2感染的抑制作用。圖6為L(zhǎng)P-19和對(duì)照多肽對(duì)各種亞型HIV-1的抑制作用。圖7為L(zhǎng)P-19和對(duì)照多肽T-20對(duì)2P23耐藥毒株的抑制作用。圖8為L(zhǎng)P-19和對(duì)照多肽注射獼猴血清的抗病毒活性。圖中，M248、M249、M250、M252、M253和M254為猴子的編號(hào)。圖9為2P23和LP-19自身螺旋結(jié)構(gòu)及其與NHR相互作用的圓二色譜分析。圖中，NA表示由于在測(cè)量溫度范圍內(nèi)螺旋結(jié)構(gòu)沒能充分解離而無(wú)法準(zhǔn)確確定其Tm值(notapplicable)。本發(fā)明中氨基酸的縮寫具有本領(lǐng)域公知的含義，E為谷氨酸、M為甲硫氨酸、T為蘇氨酸、W為色氨酸、K為賴氨酸、V為纈氨酸、L為亮氨酸、I為異亮氨酸、C為半胱氨酸、Q為谷氨酰胺、N為天冬酰胺、Y為酪氨酸、S為絲氨酸、T為蘇氨酸、A為丙氨酸；圖1-9中，Ac為乙酰基，PEG8為Fmoc-NH-PEG8-CH2CH2COOH，C16為棕櫚酸，C18為硬脂酸，NH2為氨基，Chol為膽固醇，Dih為二氫(神經(jīng))鞘氨醇，Toc為維生素E。圖3-5中，多肽濃度是指脂肽或多肽的濃度。具體實(shí)施方式下面結(jié)合具體實(shí)施方式對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步的詳細(xì)描述，給出的實(shí)施例僅為了闡明本發(fā)明，而不是為了限制本發(fā)明的范圍。下述實(shí)施例中的實(shí)驗(yàn)方法，如無(wú)特殊說(shuō)明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無(wú)特殊說(shuō)明，均可從商業(yè)途徑得到。本發(fā)明的具有抑制HIV-1和/或HIV-2和/或SIV活性的脂肽中，最佳的實(shí)施方式是上述af)和bf)的脂肽。其中，所述具有抑制HIV-1和/或HIV-2和/或SIV活性的多肽為所述P1(序列表中序列1所示的多肽，即圖1中的LP-19、LP-20、LP-21、LP-22和LP-23的第1-23位氨基酸殘基所示的多肽，該多肽即為2P23)、P3(序列表中序列2所示的多肽，即圖1中的LP-31的第1-31位氨基酸殘基所示的多肽)、P5(序列表中序列3所示的多肽，即圖1中的LP-32的第1-31位氨基酸殘基所示的多肽)、P7(序列表中序列4所示的多肽，即圖1中的LP-29的第1-34位氨基酸殘基所示的多肽)、P9(序列表中序列5所示的多肽，即圖1中的LP-25的第1-25位氨基酸殘基所示的多肽)、P11(序列表中序列6所示的多肽，即圖1中的LP-24的第1-25位氨基酸殘基所示的多肽)、P13(序列表中序列7所示的多肽，即圖1中的LP-28的第1-31位氨基酸殘基所示的多肽)、P15(序列表中序列8所示的多肽，即圖1中的LP-30的第1-30位氨基酸殘基所示的多肽)、P17(序列表中序列9所示的多肽，即圖1中的LP-26的第1-27位氨基酸殘基所示的多肽)和P19(序列表中序列10所示的多肽，即圖1中的LP-27的第1-28位氨基酸殘基所示的多肽)。所述親脂性化合物是棕櫚酸(又名軟脂酸)(C16)、硬脂酸(C18)、膽固醇(cholesterol)、二氫(神經(jīng))鞘氨醇(dihydrosphingosine)或維生素E(tocopherol)。所述連接臂是Fmoc-NH-PEG8-CH2CH2COOH。所述保護(hù)基為氨基端保護(hù)基和羧基端保護(hù)基。所述氨基端保護(hù)基為乙酰基，所述羧基端保護(hù)基為氨基。這些具有抑制HIV-1和/或HIV-2和/或SIV活性的脂肽的名稱分別為L(zhǎng)P-19至LP-32，它們的結(jié)構(gòu)如圖1和圖2所示，具有廣譜活性(既對(duì)HIV-1有效，也對(duì)HIV-2和SIV有效)且長(zhǎng)效。上述具有抑制HIV-1和/或HIV-2和/或SIV活性的脂肽對(duì)來(lái)源于HIV-1、HIV-2和SIV的NHR靶序列具有較強(qiáng)的結(jié)合能力，對(duì)病毒都具有極強(qiáng)的抑制作用，在非人靈長(zhǎng)類動(dòng)物(猴子)體內(nèi)表現(xiàn)出顯著的長(zhǎng)效活性。下面將結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的實(shí)施方案進(jìn)行詳細(xì)描述，但是本領(lǐng)域技術(shù)人員將會(huì)理解，下列實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明，而不應(yīng)視為限定本發(fā)明的范圍。實(shí)施例中未注明具體條件者，按照常規(guī)條件或制造商建議的條件進(jìn)行。所用試劑或儀器未注明生產(chǎn)廠商者，均為可以通過(guò)市購(gòu)獲得的常規(guī)產(chǎn)品。下述實(shí)施例中的所有多肽的氨基酸均為L(zhǎng)-型氨基酸。實(shí)施例1、脂肽的設(shè)計(jì)本實(shí)施例設(shè)計(jì)了具有抑制HIV-1和/或HIV-2和/或SIV活性的脂肽，它們的名稱分別為L(zhǎng)P-19、LP-20、LP-21、LP-22、LP-23、LP-24、LP-25、LP-26、LP-27、LP-28、LP-29、LP-30、LP-31和LP-32，它們的結(jié)構(gòu)如圖1所示。實(shí)施例2、多肽和脂肽的制備1、多肽的制備多肽T-20和2P23的氨基末端均連接乙?；鳛榘被吮Ｗo(hù)基，羧基末端均連接氨基作為羧基端保護(hù)基，這些多肽的結(jié)構(gòu)如圖2所示。這些多肽的合成均采用標(biāo)準(zhǔn)的固相多肽合成法(Fmoc/tBu策略)，由羧基端向氨基端方向手動(dòng)合成。所有多肽序列均按照多肽合成的常規(guī)將C-端酰胺化，N-端乙酰化。采用N-芴甲氧羰(Fmoc)保護(hù)的氨基酸、采用Rink樹脂(取代常數(shù)為0.44mmol/g)作為固相載體，用25％(體積百分含量)哌啶的DMF溶液脫除氨基保護(hù)基Fmoc，每次脫除步驟需進(jìn)行兩次，時(shí)長(zhǎng)分別為8min和10min。接肽反應(yīng)選用的縮合方法為DIPC/HOBt法和PyBOP法，氨基酸和活化試劑均采用3倍當(dāng)量，反應(yīng)時(shí)長(zhǎng)為1小時(shí)，采用茚三酮定性顯色(Kaiser法)監(jiān)測(cè)反應(yīng)進(jìn)程。若某個(gè)氨基酸縮合反應(yīng)不完全，適當(dāng)延長(zhǎng)反應(yīng)時(shí)間或重復(fù)縮合一次，直至得到所需的目標(biāo)肽段。使用切割試劑(三氟乙酸∶1,2-乙二硫醇：苯甲硫醚：苯酚：H2O：三異丙基硅烷＝68.5:10:10:5:3.5:1，v/v)將目標(biāo)多肽從樹脂上裂解下來(lái)并除去側(cè)鏈保護(hù)基(30攝氏度下切割4小時(shí))。進(jìn)行過(guò)濾操作，將濾液加入到大量冷的無(wú)水乙醚中使多肽沉淀析出，離心。用乙醚洗滌數(shù)次后干燥，即得到多肽粗品。2、脂肽的制備按照如下方法制備結(jié)構(gòu)如圖1所示的LP-19、LP-20、LP-21、LP-22、LP-23、LP-24、LP-25、LP-26、LP-27、LP-28、LP-29、LP-30、LP-31和LP-32。棕櫚酸(LP-19、LP-26至LP-30)、硬脂酸(LP-20、LP-24、LP-25、LP-31、LP-32)、二氫(神經(jīng))鞘氨醇(LP-22)或維生素E(LP-23)對(duì)多肽的修飾是通過(guò)多肽C端Lys的側(cè)鏈氨基進(jìn)行酰胺化反應(yīng)完成(參考
背景技術(shù)：
：中參考文獻(xiàn)15：ChongH,WuX,SuY,HeY.Developmentofpotentandlong-actingHIV-1fusioninhibitors.AIDS2016,30(8):1187-1196)。膽固醇(LP-21)對(duì)多肽的修飾是通過(guò)多肽C端Cys側(cè)鏈的巰基和溴乙酸膽固醇酯進(jìn)行化學(xué)選擇性極高的成硫醚反應(yīng)接枝到多肽鏈上(參考
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：中參考文獻(xiàn)14：IngallinellaP,BianchiE,LadwaNA,WangYJ,HrinR,VenezianoM,etal.AdditionofacholesterolgrouptoanHIV-1peptidefusioninhibitordramaticallyincreasesitsantiviralpotency.ProcNatlAcadSciUSA2009,106:5801-5806)。下面以LP-19為例，闡述脂肽的合成方法：所用的化學(xué)試劑，如RinkAmideMBHA樹脂，F(xiàn)moc-PEG4-OH(Fmoc-15-amino-4,7,10,13-tetraoxapentadecacanoicacid)，各種Fmoc氨基酸、棕櫚酰氯(Palmitoylchloride)、N,N'-二異丙基碳二亞胺(DIC)、1-羥基苯并三唑(HOBt)、三氟乙酸(TFA)、乙二硫醇(EDT)、茚三酮、六氫吡啶(PIPE)、苯酚、N,N’-二甲基甲酰胺(DMF)、色譜純乙腈等均從主要化學(xué)試劑供應(yīng)商購(gòu)買，使用前未經(jīng)過(guò)進(jìn)一步的提純。采用標(biāo)準(zhǔn)的手動(dòng)固相Fmoc法，以RinkAmideMBHA樹脂(取代常數(shù)0.34mmol/g)為起始原料，從C端向N端方向合成。用25％六氫吡啶/DMF(體積比)去除Rink樹脂上的Fmoc保護(hù)基，然后用2倍當(dāng)量Fmoc-Lys(Dde)-OH/HOBt/DIC與樹脂進(jìn)行接枝引入C端第一個(gè)氨基酸殘基。而后，再次用25％六氫吡啶/DMF(體積比)去除N端Fmoc保護(hù)基使N端成為自由氨基。如此反復(fù)依次連接兩個(gè)PEG4及各個(gè)氨基酸殘基。所用原料及用量分別對(duì)應(yīng)為Fmoc-PEG4-OH(1.5eq)，F(xiàn)moc-PEG4-OH(1.5eq)，F(xiàn)moc-Lys(Boc)-OH(3eq)，F(xiàn)moc-Leu-OH(3eq)，F(xiàn)moc-Leu-OH(3eq)，F(xiàn)moc-Glu(OtBu)-OH(3eq)，F(xiàn)moc-Glu(OtBu)-OH(3eq)，F(xiàn)moc-Ile-OH(3eq)，F(xiàn)moc-Lys(Boc)-OH(3eq)，F(xiàn)moc-Lys(Boc)-OH(3eq)，F(xiàn)moc-Glu(OtBu)-OH(3eq)，F(xiàn)moc-Leu-OH(3eq)，F(xiàn)moc-Glu(OtBu)-OH(3eq)，F(xiàn)moc-Glu(OtBu)-OH(3eq)，F(xiàn)moc-Val-OH(3eq)，F(xiàn)moc-Lys(Boc)-OH(3eq)，F(xiàn)moc-Lys(Boc)-OH(3eq)，F(xiàn)moc-Glu(OtBu)-OH(3eq)，F(xiàn)moc-Trp(Boc)-OH(3eq)，F(xiàn)moc-Glu(OtBu)-OH(3eq)，F(xiàn)moc-Glu(OtBu)-OH(3eq)，F(xiàn)moc-Trp(Boc)-OH(3eq)，F(xiàn)moc-Thr(tBu)-OH(3eq)，F(xiàn)moc-Met-OH(3eq)和Fmoc-Glu(OtBu)-OH(3eq)。最后進(jìn)行N端乙?；舛?3倍當(dāng)量Ac2O，6倍當(dāng)量二異丙基乙胺)，完成主鏈的合成。其中各步驟反應(yīng)時(shí)間如下：去保護(hù)8分鐘，兩次；接枝普通氨基酸60分鐘，接枝PEG4時(shí)間為180分鐘。用2％水合肼/DMF溶液(體積比)處理樹脂，以去除C端Lys的側(cè)鏈的保護(hù)基，而后用3倍當(dāng)量棕櫚酰氯與6倍當(dāng)量二異丙基乙胺混合后與C端Lys的側(cè)鏈氨基進(jìn)行酰胺化反應(yīng)(60分鐘)，從而實(shí)現(xiàn)C端Lys殘基上的棕櫚酰化修飾。以上每步反應(yīng)后都需用DMF洗滌樹脂六次以上，并且都通過(guò)茚三酮定性顯色(Kaiser法)監(jiān)測(cè)反應(yīng)進(jìn)程，若某個(gè)氨基酸縮合反應(yīng)不完全，重復(fù)縮合一次，直至得到所需的目標(biāo)肽段。切割及去側(cè)鏈保護(hù)：脂肽合成完畢后，真空干燥樹脂。往干燥后的樹脂中加入切割試劑(三氟乙酸：1,2-乙二硫醇：苯甲硫醚：苯酚：H2O：三異丙基硅烷＝68.5:10:10:5:3.5:1,v/v)，切割條件為30攝氏度下切割3小時(shí)，將目標(biāo)脂肽從樹脂上裂解下來(lái)并除去側(cè)鏈保護(hù)基。進(jìn)行過(guò)濾操作，將濾液加入到大量冷的無(wú)水乙醚中使脂肽沉淀析出，離心。用乙醚洗滌數(shù)次后干燥，即得到脂肽粗品。3、多肽和脂肽的純化多肽和脂肽的純化及表征：多肽粗品和脂肽粗品的純化在反相高效液相色譜儀上進(jìn)行。所用色譜柱柱料為10微米粒徑的反相C18硅膠，孔徑為100埃，色譜柱尺寸為50×250mm。色譜操作條件：線性梯度洗脫，洗脫液由流動(dòng)相A和流動(dòng)相B組成。流動(dòng)相A為三氟乙酸和乙腈的水溶液，三氟乙酸的體積百分濃度為0.05％，乙腈的體積百分濃度為2％。流動(dòng)相B為90％(體積百分濃度)乙腈水溶液。線性梯度洗脫由20％B到40％B，時(shí)間20分鐘，洗脫流速為每分鐘25毫升，紫外檢測(cè)波長(zhǎng)220納米。凍干溶劑后得到蓬松狀態(tài)的脂肽純品，其化學(xué)結(jié)構(gòu)由MALDI-TOF質(zhì)譜進(jìn)行表征，而其純度則由分析型高效液相色譜儀(流速：每分鐘1毫升)給出。其中，分析型高效液相色譜儀的型號(hào)：島津CBM-10AVPPULS，所采用的色譜柱的型號(hào):Agela4.6*250mmC18。色譜操作條件：線性梯度洗脫，洗脫液由流動(dòng)相A和流動(dòng)相B組成。流動(dòng)相A為三氟乙酸和乙腈的水溶液，三氟乙酸的體積百分濃度為0.05％，乙腈的體積百分濃度為2％。流動(dòng)相B為三氟乙酸和乙腈的水溶液，三氟乙酸的體積百分濃度0.05％，乙腈的體積百分濃度為90％。線性梯度洗脫由25％B到45％B，時(shí)間20分鐘。得到的多肽和脂肽純品由分析型反相高效液相色譜儀表征表明LP-19、LP-20、LP-21、LP-22、LP-23、LP-24、LP-25、LP-26、LP-27、LP-28、LP-29、LP-30、LP-31LP-32、T-20和2P23的純度均大于95％。實(shí)施例3、脂肽的廣譜抗病毒活性檢測(cè)3.1實(shí)驗(yàn)材料與方法3.1.1脂肽對(duì)HIV和SIV介導(dǎo)的細(xì)胞融合的抑制作用HIV-1、HIV-2和SIV介導(dǎo)的細(xì)胞融合抑制實(shí)驗(yàn)的材料和方法參照XiongS等發(fā)表的文獻(xiàn)(
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：中參考文獻(xiàn)13)。其中，HEK293T細(xì)胞(簡(jiǎn)稱239T細(xì)胞)購(gòu)自美國(guó)模式培養(yǎng)物集存庫(kù)(ATCC)；U87CD4+CXCR4+細(xì)胞由美國(guó)NIH艾滋病試劑和參照物項(xiàng)目提供(目錄號(hào)：4036)；HIV-2毒株ROD分子克隆的質(zhì)粒pROD由葡萄牙里斯本大學(xué)NunoTaveira教授惠贈(zèng)；表達(dá)SIV毒株SIVpbj和SIV239包膜蛋白的質(zhì)粒(分別為pSIVpbj-Env和pSIV239)由復(fù)旦大學(xué)徐建青教授惠贈(zèng)；熒光報(bào)告系統(tǒng)質(zhì)粒DSP1-7和DSP8-11由日本東京大學(xué)ZeneMatsuda教授惠贈(zèng)；表達(dá)HIV-1毒株NL4-3包膜蛋白的質(zhì)粒是將HIV-1毒株NL4-3的包膜蛋白(ENV)編碼基因插入載體pcDNA3.1(-)得到的重組表達(dá)質(zhì)粒。首先將239T細(xì)胞(效應(yīng)細(xì)胞)加入到96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中(1.5×104個(gè)/孔)，將U87CD4+CXCR4+(靶細(xì)胞)加入到24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中(8×104個(gè)/孔)，兩者分別于37攝氏度、5％CO2的條件下培養(yǎng)過(guò)夜。第二天，將表達(dá)毒株包膜蛋白(Env)的質(zhì)粒和DSP1-7質(zhì)粒按1：1混合并轉(zhuǎn)染239T細(xì)胞，將DSP8-11質(zhì)粒轉(zhuǎn)染U87CD4+CXCR4+細(xì)胞。于37攝氏度、5％CO2的條件下培養(yǎng)48小時(shí)后，將DSP8-11質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的U87CD4+CXCR4+細(xì)胞重懸于300微升預(yù)溫的培養(yǎng)液，并加入0.05微升EnduRen活細(xì)胞底物(Promega)。將待測(cè)物T-20、2P23、LP-11或LP-19用二甲基亞砜(DMSO)溶解并用細(xì)胞培養(yǎng)液稀釋后，按3倍倍比稀釋加入到96孔培養(yǎng)板的效應(yīng)細(xì)胞孔，然后轉(zhuǎn)移75微升靶細(xì)胞于效應(yīng)細(xì)胞。輕輕離心以使效應(yīng)細(xì)胞和靶細(xì)胞充分接觸后，放置于37攝氏度培養(yǎng)1小時(shí)，并測(cè)定熒光素酶的活性(相對(duì)熒光單位，RLU)。計(jì)算每一濃度樣品抑制率，利用GraphPadPrismSoftware2.01軟件計(jì)算半數(shù)有效抑制劑量(IC50值)。3.1.2對(duì)HIV-1和SIV假病毒的抑制作用采用HIV重組假病毒系統(tǒng)評(píng)價(jià)多肽對(duì)病毒進(jìn)入靶細(xì)胞的抑制作用，方法參照XiongS等發(fā)表的文獻(xiàn)[
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：參考文獻(xiàn)13],表達(dá)HIV-1或SIV包膜蛋白的質(zhì)粒同上面3.1.1所述?；静襟E包括(1)假病毒的制備：將表達(dá)HIV-1NL4-3、SIVpbj或SIV239毒株包膜蛋白的質(zhì)粒和HIV骨架質(zhì)粒pSG3△ENV(表達(dá)HIV基因組中除ENV之外的所有蛋白，由美國(guó)NIH艾滋病試劑和參照物項(xiàng)目提供，目錄號(hào)為11051)，按質(zhì)量比1:2的比例轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，同時(shí)設(shè)只轉(zhuǎn)染相同量的pSG3△ENV的對(duì)照。于37攝氏度、5％CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育6小時(shí)后換液，然后繼續(xù)孵育48小時(shí)使假病毒分泌至上清中。用移液器盡量多地吸出細(xì)胞培養(yǎng)瓶或細(xì)胞培養(yǎng)板中的上清，經(jīng)0.45μm濾器過(guò)濾或1000g離心10分鐘收取上清，向其中加入胎牛血清(FBS)使其終濃度為20％，轉(zhuǎn)移至聚丙烯管中于-80攝氏度保存?zhèn)溆没蛑苯舆M(jìn)行病毒滴定。(2)HIV假病毒的滴定：將病毒在96孔板中做5倍稀釋，設(shè)置4個(gè)復(fù)孔8個(gè)梯度，終體積為100微升。將TZM-bl細(xì)胞用胰酶消化并計(jì)數(shù)，用DMEM完全培養(yǎng)基將細(xì)胞稀釋至1×105個(gè)/ml，每孔加100微升細(xì)胞(含15μg/mlDEAE-dextran)，于37攝氏度、5％CO2培養(yǎng)48小時(shí)。然后從細(xì)胞培養(yǎng)箱中取出96孔板，從上樣孔中吸棄上清，加入30微升細(xì)胞裂解液，放置10分鐘后加入100微升熒光素酶檢測(cè)試劑。用移液器從每孔中吸出100微升液體，加于對(duì)應(yīng)的96孔白板中，于微孔板光度計(jì)讀取發(fā)光值。用Reed-Muench法計(jì)算病毒滴度。(3)抗病毒活性檢測(cè)：將待測(cè)物(T-20、2P23、LP-11或LP-19(用DMSO溶解并用細(xì)胞培養(yǎng)液稀釋))按倍比(3倍)稀釋鋪入96孔板中，終體積為50微升，其中用50微升DMEM培養(yǎng)基替代待測(cè)物作為陰性對(duì)照。加入100微升濃度為1×105個(gè)/ml的TZM-bl靶細(xì)胞(含15μg/mlDEAE-dextran)，加入上述獲得的HIV假病毒50微升(每孔相當(dāng)于100TCID50)，于37攝氏度、5％CO2條件下培養(yǎng)48小時(shí)后，利用熒光素酶檢測(cè)試劑(Promega)測(cè)定每孔的相對(duì)熒光單位(RLU)。計(jì)算％抑制率和IC50值。3.1.3對(duì)感染性HIV-1(NL4-3)和HIV-2(ROD)毒株的抑制作用對(duì)HIV-1(NL4-3)和HIV-2(ROD)毒株復(fù)制的抑制實(shí)驗(yàn)參考XiongS等發(fā)表的文獻(xiàn)[
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：參考文獻(xiàn)13]。編碼HIV-1病毒株NL4-3的分子克隆質(zhì)粒pNL4-3由美國(guó)NIH艾滋病試劑和參照物項(xiàng)目提供(目錄號(hào)：114)；HIV-2毒株ROD的分子克隆質(zhì)粒pROD同上面3.1.1所述。采用QIAGEN公司的質(zhì)粒提取試劑盒制備質(zhì)粒，采用Invitrogen公司的LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑將質(zhì)粒轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，于37攝氏度、5％CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育6小時(shí)后換液，然后繼續(xù)培養(yǎng)48小時(shí)。用移液器輕輕收集細(xì)胞培養(yǎng)瓶或細(xì)胞培養(yǎng)板中的上清，經(jīng)0.45微米濾器過(guò)濾取上清，加入20％FBS，然后分裝于聚丙烯管中，放置-80攝氏度保存?zhèn)溆没蛑苯舆M(jìn)行病毒滴定，方法同上述HIV假病毒。為測(cè)定抗病毒活性，將待測(cè)物(T-20、2P23、LP-11或LP-19(用DMSO溶解并用細(xì)胞培養(yǎng)液稀釋))按倍比(3倍)稀釋鋪入96孔板中，終體積為50微升，其中用50微升DMEM培養(yǎng)基替代待測(cè)物作為陰性對(duì)照。加入100微升TZM-bl細(xì)胞(105個(gè)細(xì)胞/ml，含15μg/mlDEAE-dextran)，加入已獲得的病毒50微升，每孔相當(dāng)于100TCID50。培養(yǎng)48小時(shí)后，利用熒光素酶檢測(cè)試劑(Promega)測(cè)定每孔的相對(duì)熒光單位(RLU)。計(jì)算％抑制率和IC50值。3.2實(shí)驗(yàn)結(jié)果及分析3.2.1LP-19對(duì)HIV-1、HIV-2和SIV介導(dǎo)的細(xì)胞融合的抑制作用首先，分析了LP-19對(duì)各種病毒介導(dǎo)的細(xì)胞融合的抑制活性，并以T-20、2P23和LP-11作為對(duì)照。結(jié)果如圖3所示，LP-19對(duì)HIV-1、HIV-2和SIV介導(dǎo)的細(xì)胞膜融合均具有強(qiáng)效的抑制作用，顯著高于三個(gè)對(duì)照多肽。LP-19對(duì)HIV-1毒株NL4-3介導(dǎo)的細(xì)胞融合的抑制IC50為0.14nM,而T-20、2P23和LP-11對(duì)其的抑制IC50值分別為7.17nM、0.28nM和0.78nM；LP-19對(duì)HIV-2毒株ROD介導(dǎo)的細(xì)胞融合的抑制IC50為2.27nM,而T-20、2P23和LP-11對(duì)其的抑制IC50值分別為569.8nM、12.25nM和20.96nM；LP-19對(duì)SIVpbj介導(dǎo)的細(xì)胞融合的抑制IC50為0.67nM,而T-20、2P23和LP-11對(duì)其的抑制IC50值分別為5.44nM、1.91nM和4.18nM；LP-19對(duì)SIV293介導(dǎo)的細(xì)胞融合的抑制IC50為2.28nM,而T-20、2P23和LP-11對(duì)其的抑制IC50值分別為219nM、2.64nM和11.91nM。3.2.2LP-19對(duì)HIV-1和SIV假病毒的抑制作用進(jìn)一步對(duì)LP-19及對(duì)照多肽對(duì)假病毒介導(dǎo)的細(xì)胞侵入的抑制作用進(jìn)行了評(píng)價(jià)，結(jié)果如圖4所示。T-20、2P23、LP-11和LP-19對(duì)HIV-1NL4-3介導(dǎo)的細(xì)胞侵入的抑制IC50分別為78.78nM、0.78nM、0.21nM和0.12nM，對(duì)SIVpbj介導(dǎo)的細(xì)胞侵入的抑制IC50分別為246.41nM、10.56nM、17.38nM和0.48nM，對(duì)SIV239介導(dǎo)的細(xì)胞侵入的抑制IC50分別為402.77nM、3.67nM、2.9nM和0.58nM。LP-19對(duì)HIV-1和SIV介導(dǎo)的細(xì)胞侵入均具有強(qiáng)效的抑制作用，顯著高于T-20、2P23和LP-11三個(gè)對(duì)照多肽。3.2.3LP-19對(duì)HIV-1和HIV-2感染的抑制作用同時(shí)，檢測(cè)了對(duì)感染性HIV-1和HIV-2的抑制活性，結(jié)果如圖5所示。T-20、2P23、LP-11和LP-19對(duì)HIV-1毒株NL4-3的抑制IC50分別為112.75nM、0.62nM、0.22nM和0.16nM，對(duì)HIV-2毒株ROD的抑制IC50分別為353.68nM、16.21nM、8.09nM和1.66nM。LP-19對(duì)感染性HIV-1和HIV-2的抑制活性均顯著高于三個(gè)對(duì)照多肽T-20、2P23和LP-11。結(jié)合3.2.1、3.2.2和3.2.3的實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出，LP-19具有較強(qiáng)的廣譜抗HIV-1、HIV-2和SIV活性，尤其對(duì)HIV-2和SIV顯示很強(qiáng)的優(yōu)勢(shì)作用。3.2.4LP-19對(duì)各種亞型HIV-1的抑制作用世界范圍內(nèi)艾滋病主要由HIV-1引起,由于病毒的變異產(chǎn)生了多種亞型,包括A-D、F-H、J和K亞型等。其中A，B和C亞型是引起世界艾滋病流行的主要病毒。而在中國(guó)，B/C和A/E重組病毒的流行占據(jù)主導(dǎo)地位。為進(jìn)一步評(píng)價(jià)抗LP-19的活性，制備了一組29株HIV-1假病毒，包括國(guó)際代表毒株和中國(guó)目前流行的HIV毒株，其中有A亞型3株、B亞型6株、B’亞型3株、C亞型6株、G亞型1株、A/C重組型1株、A/E重組型4株、和B/C重組型5株。這些假病毒毒株由中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院病原生物學(xué)研究所何玉先教授實(shí)驗(yàn)室保存，參見
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：參考文獻(xiàn)13。參照上述3.1.2中的方法(對(duì)HIV-1和SIV假病毒的抑制作用)測(cè)定T-20、2P23、LP-11和LP-19的抗病毒活性。抗病毒實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，T-20、2P23、LP-11和LP-19抑制各種亞型HIV-1毒株的平均IC50分別為34.01nM、5.22nM、1.29nM和0.47nM?？梢?，LP-19對(duì)各種亞型HIV-1病毒的抑制活性也顯著高于T-20、2P23和LP-11三個(gè)對(duì)照多肽(圖6)。3.2.5LP-19對(duì)T-20和2P23耐藥病毒株的抑制作用T-20是目前唯一批準(zhǔn)用于臨床治療的HIV膜融合抑制劑，然而其活性不但明顯低于新一代的多肽，而且很容易誘導(dǎo)耐藥突變，導(dǎo)致臨床抗病毒治療的失敗。2P23是發(fā)明人新設(shè)計(jì)僅有23個(gè)氨基酸的含有M-T鉤子結(jié)構(gòu)的螺旋短肽，主要靶向融合蛋白gp41的NHR疏水口袋結(jié)構(gòu)，對(duì)HIV-1、HIV-2和SIV均具有較好的抑制活性，但對(duì)一些短肽誘導(dǎo)的耐藥突變位點(diǎn)也呈現(xiàn)一定的交叉耐藥性。為更充分評(píng)價(jià)LP-19的抗病毒廣譜性和優(yōu)勢(shì)，發(fā)明人制備了攜帶NHR突變的假病毒，分別含有T-20和2P23對(duì)應(yīng)的耐藥位點(diǎn)(圖7)。這些制備假病毒的質(zhì)粒由發(fā)明人基于表達(dá)HIV-1毒株NL4-3包膜蛋白的質(zhì)粒pNL4-3-Env通過(guò)定點(diǎn)突變獲得，由中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院病原生物學(xué)研究所何玉先教授實(shí)驗(yàn)室保存并常規(guī)使用。圖7中的T-20耐藥毒株分別為(ChongH,YaoX,ZhangC,CaiL,CuiS,WangY,HeY.BiophysicalPropertyandBroadAnti-HIVActivityofAlbuvirtide,a3-MaleimimidopropionicAcid-ModifiedPeptideFusionInhibitor.PLoSOne.2012,7(3):e32599.)的表3中的HIV-1NL4-3突變毒株，本發(fā)明圖7中毒株名稱的下標(biāo)即為該文獻(xiàn)中表3中的毒株名稱。2P23耐藥毒株分別為(SuY,ChongH,XiongS,QiaoY,QiuZ，HeY.GeneticpathwayofHIV-1resistancetonovelfusioninhibitorstargetingtheGp41pocket.JVirol.2015，89(24):12467-12479)中的表1中HIV-1NL4-3突變毒株，本發(fā)明圖7中毒株名稱的下標(biāo)即為該文獻(xiàn)中表1中的毒株名稱。參照上述3.1.2中的方法測(cè)定T-20、2P23、LP-11和LP-19的抗病毒活性?？共《緦?shí)驗(yàn)結(jié)果表明，T-20、2P23、LP-11和LP-19抑制T-20耐藥毒株的平均IC50分別為1804.3nM、1.05nM、0.37nM和0.17nM(圖7)?？梢姡琇P-19抑制T-20耐藥株的活性比T-20、2P23、LP-11分別高出10613.53倍、6.18倍和2.18倍；LP-19抑制2P23耐藥毒株的平均IC50分別為134.4nM、36.52nM、5.53nM和0.81nM?？梢?，LP-19抑制2P23耐藥株的活性比T-20、2P23、LP-11分別高出165.93倍、45.09和6.83倍。實(shí)施例4、LP-19的體內(nèi)抗病毒活性檢測(cè)上述多個(gè)基于細(xì)胞水平的體外抗病毒實(shí)驗(yàn)的結(jié)果表明，LP-19是一個(gè)廣譜的高活性的抗病毒脂肽。為明確LP-19是否在體內(nèi)也具有很強(qiáng)的抗病毒活性，將LP-19以及對(duì)照多肽T-20和2P23通過(guò)皮下或靜脈注射到猴子體內(nèi)，然后采取不同時(shí)間點(diǎn)的血液標(biāo)本在體外測(cè)定血清的抗病毒活性。該方法不但可以了解待測(cè)物的體內(nèi)抗病毒活性，也有助于分析待測(cè)物在體內(nèi)的穩(wěn)定性和半衰期。具體方法如下：選擇6只實(shí)驗(yàn)獼猴(恒河猴)，雌雄各半，年齡3-4歲、體重3.4-4.7kg。按每公斤體重3毫克(3mg/Kg)皮下注射待測(cè)物T-20、2P23或LP-19(均用無(wú)菌蒸餾水溶解)，分別于注射前(0小時(shí))，注射后1、2、4、6、8、12、18、24、36、48、60、72小時(shí)抽取0.4ml靜脈血標(biāo)本，并按常規(guī)方法分離血清。LP-19除皮下途徑注射外，另外采用靜脈途徑注射LP-19(用無(wú)菌蒸餾水溶解)，注射劑量為3mg/Kg體重。每次實(shí)驗(yàn)間隔時(shí)間2周以上，以確保沒有上次注射待測(cè)物的殘留。按照實(shí)施例3中的方法采用抗病毒實(shí)驗(yàn)檢測(cè)血清抑制HIV-1假病毒NL4-3突變株D36G(參見
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：中文獻(xiàn)11的表2)的活性。血清3倍倍比稀釋。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖8所示，皮下注射T-20在2和4小時(shí)表現(xiàn)為抑制峰值，抑制50％NL4-3感染性的血清最大稀釋倍數(shù)分別為45倍和46倍；皮下注射短肽2P23在1和2小時(shí)表現(xiàn)為抑制峰值，血清最大稀釋倍數(shù)分別為60倍和68倍；皮下注射短肽LP-19在6和8小時(shí)表現(xiàn)為抑制峰值，血清最大稀釋倍數(shù)分別為5396倍和4720倍；靜脈注射LP-19在1和2小時(shí)即表現(xiàn)為抑制峰值，血清最大稀釋倍數(shù)分別為99107倍和76346倍?？梢?，LP-19在猴子體內(nèi)表現(xiàn)為顯著的強(qiáng)效和長(zhǎng)效活性，皮下途徑抑制峰值為T-20的100倍以上，靜脈途徑抑制峰值為T-20的2000倍以上。LP-19即使在皮下注射60和72小時(shí)，其抑制峰值血清最大稀釋倍數(shù)分別為66倍和40倍，類似于T-20在2和4小時(shí)的表現(xiàn)。實(shí)施例5.LP-19的結(jié)構(gòu)及其與NHR靶序列的相互作用分析5.1實(shí)驗(yàn)材料與方法采用圓二色譜技術(shù)(CD)測(cè)定多肽的二級(jí)結(jié)構(gòu)和螺旋穩(wěn)定性(Tm值)，實(shí)驗(yàn)方法參考文獻(xiàn)[14]。圓二色譜儀為日產(chǎn)Jasco-815。首先測(cè)定LP-19及其模板2P23在不同濃度下(分別為20、40、80、160和320μM)的自身螺旋含量和Tm值。然后測(cè)定LP-19或2P23與NHR多肽N36(Ac-SGIVQQQNNLLRAIEAQQHLLQLTVWGIKQLQARIL-NH2)所形成6-HB的螺旋含量和Tm值。2P23、LP-19和N36分別溶于磷酸鹽緩沖液(PBS，pH7.2)中，根據(jù)280nm下紫外吸收確定濃度。根據(jù)CD信號(hào)判斷多肽間的相互作用情況及螺旋含量。通過(guò)CD溫度掃描測(cè)定多肽抑制劑與N36形成的六螺旋結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性。5.2實(shí)驗(yàn)結(jié)果及分析CD測(cè)試結(jié)果見圖9。首先，作為對(duì)照的未修飾多肽2P23含有典型的α-螺旋結(jié)構(gòu)(圖9中A)，其在20μM、40μM、80μM、160μM和320μM濃度下的螺旋含量分別為76.4％、81.4％、83.8％、84％和79.7％；其在20μM、40μM、80μM和160μM濃度下的Tm值分別為48.1攝氏度、54.7攝氏度、59.9攝氏度和67.8攝氏度(圖9中B)。當(dāng)濃度達(dá)到320μM，其螺旋在測(cè)定的最高溫度(98攝氏度)不能充分解旋而導(dǎo)致Tm無(wú)法準(zhǔn)確判定，提示其螺旋的高度熱穩(wěn)定性。脂肽LP-19在20μM、40μM、80μM、160μM和320μM濃度下的螺旋含量分別為70％、71.1％、71.9％、76.2％和71％(圖9中C)；然而，在測(cè)定的最高溫度(98攝氏度)，LP-19在各種濃度CD條件下其螺旋都無(wú)法充分解旋，說(shuō)明棕櫚酸修飾能夠顯著增加多肽的螺旋穩(wěn)定性(圖9中D)。進(jìn)一步比較分析了LP-19和2P23與N36的結(jié)合能力。圖9中E表明兩者都能與N36形成典型的六聚體螺旋結(jié)構(gòu)(6-HB)；圖9中F表明2P23/N36復(fù)合物的Tm值為79.6攝氏度，但LP-19/N36復(fù)合物更加穩(wěn)定，在測(cè)定的最高溫度(98攝氏度)不能充分解旋。從這些CD結(jié)果說(shuō)明，2P23自身為一螺旋多聚體結(jié)構(gòu)，而棕櫚酸修飾進(jìn)一步增加多肽的螺旋穩(wěn)定性。實(shí)施例6.LP-19衍生脂肽的抗病毒活性從上述實(shí)施例的結(jié)果可以看出，LP-19脂肽具有廣譜、強(qiáng)效和長(zhǎng)效的優(yōu)點(diǎn)。進(jìn)一步以其他親脂化合物取代LP-19中的棕櫚酸合成一組新的脂肽(圖1)。其中，LP-20、LP-24和LP-25以硬脂酸(C18)修飾，LP-21以膽固醇(Chol)修飾，LP-22以二氫(神經(jīng))鞘氨醇(Dih)修飾，LP-23以維生素E(Toc)修飾。同時(shí)，還合成了不含PEG8但代之以不同長(zhǎng)度對(duì)應(yīng)氨基酸序列的脂肽(LP-26到LP-32)。參照實(shí)施例3中3.1.2和3.1.3的抗病毒實(shí)驗(yàn)檢測(cè)了它們對(duì)HIV-1NL4-3毒株假病毒、感染性HIV-2ROD毒株和SIV239毒株假病毒的抑制活性。制備病毒的質(zhì)粒同上所述。結(jié)果如圖1所示，這些脂肽都有極強(qiáng)的抗病毒活性。它們既對(duì)HIV-1有效，也對(duì)HIV-2和SIV有效。<110>中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院病原生物學(xué)研究所<120>廣譜抑制HIV的脂肽、其衍生物、其藥物組合物及其用途<160>10<170>PatentInversion3.5<210>1<211>23<212>PRT<213>人工序列<400>1GluMetThrTrpGluGluTrpGluLysLysValGluGluLeuGluLys151015LysIleGluGluLeuLeuLys20<210>2<211>31<212>PRT<213>人工序列<400>2GluMetThrTrpGluGluTrpGluLysLysValGluGluLeuGluLys151015LysIleGluGluLeuLeuLysLysAlaGluGluGlnGlnLysLys202530<210>3<211>31<212>PRT<213>人工序列<400>3GluLeuThrTrpGluGluTrpGluLysLysValGluGluLeuGluLys151015LysIleGluGluLeuLeuLysLysAlaGluGluGlnGlnLysLys202530<210>4<211>34<212>PRT<213>人工序列<400>4GluMetThrTrpGluGluTrpGluLysLysValGluGluLeuGluLys151015LysIleGluGluLeuLeuLysLysAlaGluGluGlnGlnLysLysAsn202530GluLys<210>5<211>25<212>PRT<213>人工序列<400>5GluLeuThrTrpGluGluTrpGluLysLysValGluGluLeuGluLys151015LysIleGluGluLeuLeuLysLysAla2025<210>6<211>25<212>PRT<213>人工序列<400>6GluMetThrTrpGluGluTrpGluLysLysValGluGluLeuGluLys151015LysIleGluGluLeuLeuLysLysAla2025<210>7<211>31<212>PRT<213>人工序列<400>7GluMetThrTrpGluGluTrpGluLysLysValGluGluLeuGluLys151015LysIleGluGluLeuLeuLysLysAlaGluGluGlnGlnLysLys202530<210>8<211>30<212>PRT<213>人工序列<400>8GluLeuThrTrpGluGluTrpGluLysLysIleGluGluTyrThrLys151015LysIleGluGluIleLeuLysLysAlaGluGluGlnGlnLys2025<210>9<211>27<212>PRT<213>人工序列<400>9GluMetThrTrpGluGluTrpGluLysLysValGluGluLeuGluLys151015LysIleGluGluLeuLeuLysLysAlaGlnLys2025<210>10<211>28<212>PRT<213>人工序列<400>10GluMetThrTrpGluGluTrpGluLysLysValGluGluLeuGluLys151015LysIleGluGluLeuLeuLysLysAlaGlnAsnLys2025當(dāng)前第1頁(yè)1 2 3 當(dāng)前第1頁(yè)1 2 3