本發(fā)明涉及遺傳工程領(lǐng)域，具體涉及一種斑馬魚椎間盤損傷模型的構(gòu)建方法。
背景技術(shù)：
：隨著年齡的增長、壓力磨損的累積所引發(fā)的椎間盤退變是脊柱特有的衰老性疾病，可引發(fā)20％的下腰痛(lowbackpain，LBP)，椎間盤退變是慢性下腰背痛發(fā)生的主要病因。椎間盤的發(fā)生發(fā)育、退變和再生修復(fù)是一個復(fù)雜過程，確切分子生物學(xué)機(jī)制尚不明確，涉及到許多方面的影響因素，有待于進(jìn)一步研究。椎間盤脫出癥、腰腿痛、頸椎病等作為臨床的常見病和多發(fā)病，其發(fā)病機(jī)理直接與椎間盤退變密切相關(guān)。研究椎間盤的退變機(jī)制和修復(fù)機(jī)理，可為該類疾病的預(yù)防和治療提供正確的理論依據(jù)，并隨即制定行之有效的防治方案，從而降低發(fā)病率，提高治愈率，改善患者的生活質(zhì)量。目前對于脊柱退行性疾病研究比較普遍的是通過手術(shù)方式來損傷小鼠腰椎椎間盤為主的方式來建立椎間盤退變的動物模型，但是這種建模的缺陷是非常明顯的，比如手術(shù)創(chuàng)傷大，經(jīng)濟(jì)成本高，而且小鼠胚胎在母鼠體內(nèi)發(fā)育，不利于脊柱早期發(fā)育進(jìn)展的研究，不適用于活體上實(shí)時動態(tài)標(biāo)記細(xì)胞的遷徙、分化過程，所以我們認(rèn)為小鼠為首選的哺乳類動物模型的代表性一般。Hayes等已經(jīng)將斑馬魚作為老齡化脊柱畸形研究的動物模型，通過描述年齡相關(guān)性的變化，伴隨椎骨發(fā)生類似骨關(guān)節(jié)炎的特性，特別是椎骨軟骨與骨組織，這些有助于在動物模型中進(jìn)行脊柱畸形的研究。通過研究新型實(shí)驗動物模型，使得我們能夠更好的去理解脊柱退行性疾病的病變過程，以此作為改進(jìn)現(xiàn)有的臨床治療方案提供更堅實(shí)的基礎(chǔ)。以上研究說明斑馬魚是一種研究脊柱骨骼發(fā)育以及相關(guān)疾病的新型動物模型，特別是在脊柱退行性疾病研究中有巨大潛力。盡管斑馬魚作為一種新興的模式生物還未被廣泛應(yīng)用于脊柱發(fā)育及相關(guān)疾病的研究，但完全可以彌補(bǔ)小鼠模型的缺陷與不足。斑馬魚這類廣泛應(yīng)用于科學(xué)研究的新型模式生物，與人的基因同源性高達(dá)87％，具有胚胎透明和體外發(fā)育、方便的正向和反向遺傳的研究手段；尤其是脊柱與哺乳動物結(jié)構(gòu)組成相似，在脊柱發(fā)育過程中的相關(guān)信號調(diào)控有很高的同源性。利用Cre/Loxp系統(tǒng)可在斑馬魚活體上實(shí)時動態(tài)觀察細(xì)胞的遷徙過程，Enu大規(guī)模正向遺傳篩選，可篩選出突變引起脊柱骨骼發(fā)育畸形的斑馬魚。這些優(yōu)勢使得斑馬魚成為脊柱骨骼的發(fā)育機(jī)制、生物礦化研究的理想模式動物。本發(fā)明是以斑馬魚作為模式動物，通過損傷斑馬魚椎間盤來構(gòu)建椎間盤退變模型，為進(jìn)一步研究椎間盤退變與椎骨退變的分子機(jī)制提供初步的理論基礎(chǔ)。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是為椎間盤退變研究提供理論基礎(chǔ)的斑馬魚椎間盤損傷模型的構(gòu)建方法。為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明提供如下技術(shù)方案：斑馬魚椎間盤損傷模型的構(gòu)建方法，包括DNA聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，DNA聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)中所使用的引物及序列為：正向引物：5’-GTCGACGTACTGTATCTGTGCTGATTCAC-3’反向引物：5’-GACCAGAAGAGATAATTCAAACGT-3’。進(jìn)一步，所述的DNA聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的反應(yīng)體系為：進(jìn)一步，所述的DNA聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的反應(yīng)過程為，a、98℃預(yù)變性2minb、98℃變性10secc、58℃退火15secd、72℃延伸5min30secb～d重復(fù)35個循環(huán)e、72℃終延伸10min。附圖說明圖1為本發(fā)明中從斑馬魚基因組克隆twhh的啟動子片段的PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果圖；圖2是本發(fā)明中重組質(zhì)粒pGEMT-twhh的構(gòu)建與酶切檢測的快速酶切檢測結(jié)果圖；圖3是重組質(zhì)粒pBluescriptII-KS-twhh-Dendra2-NTR的酶切檢測以及質(zhì)粒測序中大量酶切反應(yīng)的凝膠電泳結(jié)果圖；圖4是重組質(zhì)粒pBluescriptII-KS-twhh-Dendra2-NTR的酶切檢測以及質(zhì)粒測序中快速酶切檢測的凝膠電泳結(jié)果圖；圖5是根據(jù)測序結(jié)果和已知序列制作的重組質(zhì)粒pBluescriptII-KS-twhh-Dendra2-NTR的圖譜示意圖；圖6是斑馬魚轉(zhuǎn)基因系Tg(twhh:Dendra2-NTR)的構(gòu)建步驟中得到的斑馬魚脊柱發(fā)育模式圖；圖7是斑馬魚脊柱橫斷面抗體染色示意圖；圖8是60dpf斑馬魚椎間盤與椎骨示意圖；圖9是轉(zhuǎn)基因系Tg(twhh:Dendra2-NTR)重度損傷模型構(gòu)建步驟中得到的斑馬魚椎間盤重度損傷模型示意圖；圖10是斑馬魚椎間盤重度損傷后脊柱的MicroCT掃描分析的結(jié)果示意圖；圖11是試驗一不用引物對重組質(zhì)粒構(gòu)建的影響的結(jié)果示意圖；圖12是試驗二退火溫度對重組質(zhì)粒構(gòu)建的影響的結(jié)果示意圖。具體實(shí)施方式實(shí)施例一：本發(fā)明斑馬魚椎間盤損傷模型的構(gòu)建方法的構(gòu)建方法，其操作方法為：步驟一、pBluescriptII-KS-twhh-Dendra2-NTR重組質(zhì)粒構(gòu)建1.實(shí)驗材料1.1實(shí)驗動物本實(shí)驗研究在重慶市三峽庫區(qū)生態(tài)環(huán)境與生物資源省部共建國家重點(diǎn)實(shí)驗室培育基地進(jìn)行，野生型斑馬魚(AB系)按照實(shí)驗動物管理委員會條例規(guī)定在標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗條件下繁殖與飼養(yǎng)。1.2實(shí)驗試劑本實(shí)驗中的PCR引物合成與序列測定由上海英俊生物技術(shù)有限公司操作；PrimerSTARDNA聚合酶來自于TaKaRa，日本；LATaqDNA聚合酶來自于TaKaRa，日本；rTaqDNA聚合酶來自于TAKARA，日本；PCRpurificationKit純化試劑盒來自于Qiagen，美國；T4DNALigaseenzyme連接酶來自于Invitrogen，美國；DH5α菌株來自于Invitrogen，美國。1.2.1LB液體培養(yǎng)基配制:細(xì)菌培養(yǎng)用胰化蛋白胨(bacto-tryptone),10g；細(xì)菌培養(yǎng)用酵母提取物(bacto-yeastextract),5g；氯化鈉(NaCl)，10g；加入950mL蒸饋水；用1M的NaOH調(diào)PH至7.0，加蒸餾水至1000ml，定容后充分溶解培養(yǎng)基并高壓滅菌20min，冷卻后存儲在4℃。1.2.2LB固體培養(yǎng)基配制:瓊脂粉(agarose),12g；細(xì)菌培養(yǎng)用胰化蛋白胨(bacto-tryptone)，10g；細(xì)菌培養(yǎng)用酵母提取物(bacto-yeastextract),5g；氯化鈉(NaCl)，10g；用1M的NaOH調(diào)PH至7.0，加蒸餾水至1000ml，待完全溶解后高壓滅菌；冷卻至55℃,加入氨芐青霉素(Amp)或卡那霉素(Kana)制備平板，凝固后存儲在4℃。1.2.3顯微注射液顯微注射液的組成組份及用量如表1所示：表1組份用量150ng/μLplasid(質(zhì)粒)1μL10×I-SceIbuffer(緩沖劑)0.5μLI-SceI(限制性內(nèi)切酶)1μLddH2O(去離子水)2.5μLTotalvolume(總體積)5μL1.3實(shí)驗儀器Zeiss體視解剖顯微鏡來自于Zeiss，德國Eppendorf梯度PCR儀來自于Eppendorf，德國Eppendorf桌面立式高速離心機(jī)來自于Eppendorf，德國。1.4相關(guān)質(zhì)粒pBluescript-KS-eda-Dendra2-NTR質(zhì)粒來自重慶市三峽庫區(qū)生態(tài)環(huán)境與生物資源省部共建國家重點(diǎn)實(shí)驗室培育基地庫存。2實(shí)驗方法2.1斑馬魚基因組提取1)每個1.5mL的EP管放10個斑馬魚胚胎(3dpf，受精后3天)。2)配制500μLLysisbuffer(緩沖液)+5μL蛋白酶K；混勻后加入1.5mL的EP管中。3)將1.5mL的EP管放入ThermomixerComfort(恒溫混勻器)中先55℃，14h；然后95℃，30min，最后在-20℃下保存。2.2斑馬魚基因組純化1)將RNAfreewater(去RNA酶水)添加到提取的斑馬魚基因組的EP管中至總體積630μL，再添加70μL乙酸鈉并且混勻。2)向步驟1)EP管中加入700μL的PCI(Phenol-Chloroform-Isoamylalcohol,苯酚-氯仿-異戊醇),接著震蕩均勻，13000rcf/min，15min。3)吸取上清液約600μL至新的EP管中，然后加入相同體積的異丙醇(isopropanol)充分混勻，在4℃，13000rcf/min，40min。4)吸干、去凈上清液留下白色沉淀，添加1mL濃度為80％的乙醇，然后4℃，13000rcf/min，7min。5)重復(fù)步驟4，再吸干、去凈液體，放置冰塊上干燥約30min。6)加40μLRNAfreewater(去RNA酶水)溶解DNA并測濃度，取樣2.5μL跑膠，驗證DNA的完整性。2.3DNA聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)1)引物序列如表2所示：表2引物序列正向引物序列5’-GTCGACGTACTGTATCTGTGCTGATTCAC-3’反向引物序列5’-GACCAGAAGAGATAATTCAAACGT-3’2)DNA聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PrimerSTAR聚合酶)的反應(yīng)體系PCR反應(yīng)體系的組份及用量如表3所示表3Component(組份)Volume(用量)GenomicDNA(基因組)1μLForwardprimer(10μM)(正向引物)1μLReverseprimer(10μM)(反向引物)1μLdNTP(2.5mmol)(三磷酸脫氧核苷)4μL5×primestrarbuffer(緩沖劑)10μLPrimerstarNEB(聚合酶)0.5μLddH20(去離子水)32.5μL3)DNA聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PrimerSTAR聚合酶)的反應(yīng)過程：PCR反應(yīng)過程如表4所示表44)twhhpromoter瓊脂糖凝膠電泳檢測i.將0.48g瓊脂糖添加到60mL的1×TBEBuffer(緩沖液)，放入清洗干凈的燒瓶中。ii.將燒瓶放進(jìn)微波爐中加熱約2.5min使瓊脂糖溶解，破壞核酸酶。iii.從微波爐中轉(zhuǎn)移燒瓶，冷卻3min，再添加3μL溴化乙錠(EB)。iv.然后將完全溶解的膠倒入提前放入4℃庫房的膠槽冷卻約15min可充分凝固。v.加入8μL6×lodadingbuffer(加樣緩沖液)于40μL的PCR產(chǎn)物中，充分混勻。vi.然后將混勻的PCR產(chǎn)物點(diǎn)進(jìn)凝固的瓊脂糖凝膠中，75V電壓下跑膠40min。vii.在紫外燈照射下用潔凈的刀片將正確的條帶膠切下放至1.5mL的EP管，并純化回收。5)PCR產(chǎn)物的回收和純化：i.將切下的膠稱重，1mg約等于1μL計算，加200μL/mg的NEbuffer(來自PCRpurificationKit純化試劑盒)，55℃下，加熱使膠條完全融化，過程中多次倒轉(zhuǎn)離心管以混勻液體。ii.將回收液轉(zhuǎn)移至膠回收純化柱，轉(zhuǎn)速11000rpm離心1min。iii.移除濾液，加入750μLNE3溶液(來自PCRpurificationKit純化試劑盒)，11000rpm離心1min。iv.移除濾液，11000rpm再離心1min。v.添加20μLddH20(去離子水)至膠回收純化柱中，放置10min，轉(zhuǎn)速11000rpm離心1min，儲存在-20℃冰箱。2.4T載體連接pGEM-T連接反應(yīng)體系的組份和用量如表5所示：表5按照PGEM-T連接反應(yīng)體系加入相應(yīng)的試劑，在4℃連接14小時。2.5電感受態(tài)細(xì)胞的制備1)用無菌牙簽蘸取凍存于甘油中的大腸桿菌DH5α菌株，在10mlLB液體培養(yǎng)基中，37℃，250rpm，振蕩過夜培養(yǎng)。2)將過夜培養(yǎng)的10ml培養(yǎng)液接種于新的1LLB液體培養(yǎng)基中，37℃，250rpm，振蕩培養(yǎng)2小時左右，測定OD600＝0.6-0.7(每隔15～20分鐘測一次)。3)無菌下，將菌液轉(zhuǎn)移至預(yù)冷的離心管中，并于冰中靜置30分鐘。4)4℃，5000rpm離心20分鐘，棄去上清，回收細(xì)菌，重懸于1L預(yù)冷的超純水中。5)4℃，5000rpm離心20分鐘，棄去上清，回收細(xì)菌，重懸于100ml預(yù)冷的10％甘油中。6)4℃，6000rpm離心10分鐘，棄去上清，回收細(xì)菌，重懸于20ml預(yù)冷的10％甘油中。7)4℃，6000rpm離心10分鐘，棄去上清，回收細(xì)菌，重懸于2ml預(yù)冷的10％甘油中。8)重復(fù)第7步。9)4℃，6000rpm離心10分鐘，棄去上清，回收細(xì)菌，重懸于3ml預(yù)冷的10％甘油中。10)將菌液分裝到1.5ml干凈的離心管中(每管40μL)，用液氮速凍，于-80℃下保存。2.6電轉(zhuǎn)感受態(tài)細(xì)胞轉(zhuǎn)化重組質(zhì)粒1)將電轉(zhuǎn)杯放在37℃房干燥20～30min以確保電轉(zhuǎn)杯干燥充分，將干燥后的電轉(zhuǎn)杯放冰中冷卻20min。2)將步驟2.5中得到的電感受態(tài)細(xì)胞放入冰盒中解凍以后，在每管電感受態(tài)細(xì)胞中加入1-2μL步驟2.4中的連接產(chǎn)物，然后轉(zhuǎn)入電轉(zhuǎn)杯中，其過程要輕不能產(chǎn)生氣泡。3)電轉(zhuǎn)后迅速向電轉(zhuǎn)杯加入400μLLB液體培養(yǎng)基并輕輕沖洗電轉(zhuǎn)杯，置于37℃房250rpm恢復(fù)培養(yǎng)50min。同時將含有Amp(氨芐)的LB固體培養(yǎng)基倒扣于37℃房中預(yù)熱烘干。4)將活化50min后的菌液涂于步驟3)中預(yù)熱烘干的含有Amp(氨芐)的LB固體培養(yǎng)基，放置于37℃的培養(yǎng)箱培養(yǎng)13h便有明顯的菌落。2.7篩選和擴(kuò)增重組質(zhì)粒1)待步驟2.6的LB固體培養(yǎng)基出現(xiàn)形態(tài)適宜且大小規(guī)則的單菌落時取出。2)利用小號無菌槍頭選取LB固體培養(yǎng)基上白色的單菌落接種到含有70μg/mL氨芐(Amp)的新的5mLLB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)。于37℃條件下，250rpm旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)過夜(12-14h)。3)重組質(zhì)粒的抽提：測定質(zhì)粒濃度。2.8快速酶切反應(yīng)鑒定重組質(zhì)粒快速酶切反應(yīng)體系的組份和用量如表6所示：表6Component(組分)Volume(用量)Plasmid(質(zhì)粒)200ng10×EnzymeBuffer(緩沖劑)1μLEnzyme(SalI&BamHI)(限制性內(nèi)切酶)0.2μLddH2O(去離子水)VariableTotoal(總體積)10μL按照表7體系加入相應(yīng)的試劑到EP管中，一般置于37℃的最適酶反應(yīng)溫度酶切30min，利用濃度為1％的瓊脂糖進(jìn)行凝膠電泳檢測，確定酶切結(jié)果正確的重組質(zhì)粒并送至上海英俊生物技術(shù)有限公司鑒定。2.9大量酶切并且回收重組質(zhì)粒相應(yīng)的目的片段根據(jù)實(shí)驗室?guī)齑尜|(zhì)粒pBluescript-KS-ela-Dendra2-NTR的圖譜選擇合適的酶切位點(diǎn)(SalI&BamHI)，酶切后質(zhì)粒pBluescript-KS-ela-Dendra2-NTR保留約4kb的骨架，質(zhì)粒pGEMT-twhh取酶切后4kb的左右的片段為插入序列。1)大量酶切反應(yīng)體系的組份和用量如表7所示：表7Component(組分)Volume(用量)Plasmid(質(zhì)粒)8μgCutsmart(緩沖劑)10μLEnzyme(SalI&BamHI)(限制性內(nèi)切酶)2μLddH2O(去離子水)VariableTotoal(總量)100μL按照上表體系加入相應(yīng)的試劑到新的EP管，37℃或其他適宜溫度下酶切2-3個小時。酶切產(chǎn)物的回收純化：與PCR產(chǎn)物的回收和純化的步驟相同。質(zhì)粒pBluescript-KS-ela-Dendra2-NTR與質(zhì)粒pGEMT-twhh經(jīng)限制性內(nèi)切酶(SalI&BamHI)酶切分別回收純化得到4kb的pBluescript-KS-Dendra2-NTR片斷與5.8kb的twhhpromoter片段，以供后續(xù)，以供后續(xù)T4DNAligationenzyme(T4連接酶)連接實(shí)驗使用。2)T4DNAligationenzyme(T4連接酶)連接T4ligationenzyme(T4連接酶)連接體系組份和用量如表8所示：表8Component(組分)Volume(用量)T4ligationenzyme(連接酶)3.5μLtwhhpromoter片段2.5μLpBluescript-KS-Dendra2-NTR片斷1μL4℃連接13h。按照上述體系依次進(jìn)行轉(zhuǎn)化、篩選，并用快速酶切(ApaI&NcoI)鑒定重組質(zhì)粒pBluescript-twhh-Dendra2-NTR，并送上海英俊生物技術(shù)有限公司分析。2.10重組質(zhì)粒的純化1)向重組質(zhì)粒pBluescript-twhh-Dendra2-NTR中加入RNaseFreeWater(去RNA酶水)至630μL，混勻后再加入70μL醋酸鈉(NaAc)振蕩混勻。2)加入700μLPCI(Phenol-Chloroform-Isoamylalcohol,苯酚-氯仿-異戊醇)振蕩30秒,13000rpm，離心20min。3)吸取650μL上清液到新的EP管中，添加650μL的異丙醇，振蕩10秒鐘，11000rpm，離心20min。4)去除EP管中的上清液，向殘留DNA白色沉淀物中加入75％乙醇1mL，13000rpm離心7min。5)移除酒精，于冰上靜置晾干，加入40μLNucleasefreewater(不含核酸酶的水)溶解。檢測質(zhì)粒濃度及OD值。3結(jié)果3.1從斑馬魚基因組克隆twhh的啟動子片段從斑馬魚基因組中通過PCR擴(kuò)增出5.8kbtwhh(tiggy-winklehedgehog，Hedgehog家族的一員)基因的啟動子序列來構(gòu)建pBluescript-twhh-Dendra2-NTR重組質(zhì)粒。通過在正向引物中加入BamHI位點(diǎn)，反向引物中加入SalI位點(diǎn)，以方便后續(xù)實(shí)驗的進(jìn)行。如圖1所示，將PCR產(chǎn)物點(diǎn)樣，凝膠電泳結(jié)果顯示泳道1最亮帶在5000-6000bp之間，在紫外燈下將5.8kb含有twhh啟動子的凝膠目的條帶切下并回收純化，非特異性條帶的位置顯示在1100bp左右(不影響twhh啟動子的凝膠目的條帶切下與回收純化)。泳道2為1KbDNAmarker，泳道1為twhh啟動子片段。3.2重組質(zhì)粒pGEMT-twhh的構(gòu)建與酶切檢測將純化的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物連接到-TEasyVector，利用電轉(zhuǎn)感受肽DH5a轉(zhuǎn)化，借助藍(lán)白斑篩選的方法，挑取內(nèi)含氨芐抗性的白斑進(jìn)行陽性菌落擴(kuò)增來提取質(zhì)粒，正確的pGEMT-twhh重組質(zhì)?？赏ㄟ^BamHI和SalI酶切出3015bp與5784bp的條帶。如圖2所示，快速酶切檢測顯示：泳道1為假陽性質(zhì)粒pGEMT-twhh，泳道2為準(zhǔn)確的重組質(zhì)粒pGEMT-twhh，泳道3為1kbDNAmarker條帶顯示區(qū)域。泳道3為1KbDNAmarker，泳道1,2為待測的重組質(zhì)粒pGEMT-twhh。3.3重組質(zhì)粒pBluescriptII-KS-twhh-Dendra2-NTR的酶切檢測以及質(zhì)粒測序運(yùn)用BamHI限制性內(nèi)切酶和SalI限制性內(nèi)切酶來大量酶切質(zhì)粒pGEMT-twhh與質(zhì)粒pBluescript-KS-ela-CFP-NTR，取twhh啟動子插入序列(5.8kbp)和pBluescript-KS載體片段(4.8kb)膠回收，將所需片段的凝膠條帶切下并回收純化。大量酶切反應(yīng)的凝膠電泳結(jié)果如圖3所示：泳道1為1kbDNAmarker條帶顯示區(qū)域。泳道2的質(zhì)粒為pGEMT-twhh，5.8kb酶切片段作為插入片段。泳道3的質(zhì)粒為pBluescript-KS-ela-Dendra2-NTR質(zhì)粒，取其中4.8kb的酶切片段為載體片段，切膠并回收相應(yīng)片段，通過T4DNA連接酶連接，運(yùn)用電轉(zhuǎn)感受肽DH5a轉(zhuǎn)化，篩選出具有氨芐抗性的單個菌落擴(kuò)大培養(yǎng)來提取正確的重組質(zhì)粒。正確的pBluescript-KS-twhh-Dendra2-NTR重組質(zhì)粒可用限制性內(nèi)切酶ApaI酶切出6082bp和4150bp的條帶，并且用NcoI酶切出7230bp和3002bp的條帶。快速酶切檢測的凝膠電泳結(jié)果如圖4示：其中泳道1、4為待測第1號重組質(zhì)粒，泳道2、5為待測第2號重組質(zhì)粒，分別用限制性內(nèi)切酶ApaI和NcoI酶切的凝膠電泳圖。分別運(yùn)用限制性內(nèi)切酶ApaI、NcoI快速酶切檢測：泳道1為限制性內(nèi)切酶ApaI酶切待測第1號重組質(zhì)粒是6082bp和4150bp的條帶，泳道2為限制性內(nèi)切酶ApaI酶切待測第1號重組質(zhì)粒是1700bp和7000bp的條帶，泳道3為1kbDNAmarker條帶顯示區(qū)域,泳道4為限制性內(nèi)切酶NcoI酶切待測第2號重組質(zhì)粒是7230bp和3002bp的條帶，泳道5為限制性內(nèi)切酶NcoI酶切待測第2號重組質(zhì)粒是2000bp和6000bp的條帶，泳道1、4是正確重組質(zhì)粒pBluescript-KS-twhh-Dendra2-NTR，泳道2、5為假陽性的重組質(zhì)粒pBluescript-KS-twhh-Dendra2-NTR。我們將酶切檢測正確的重組質(zhì)粒pBluescriptII-KS-twhh-Dendra2-NTR送至上海英俊生物技術(shù)有限公司測序，測序結(jié)果顯示twhh啟動子正確連接到pBluescriptII-KS-I-Dendra2-NTR載體片段，說明我們已經(jīng)成功構(gòu)建重組質(zhì)粒pBluescriptII-KS-twhh-Dendra2-NTR。3.4重組質(zhì)粒pBluescriptII-KS-twhh-Dendra2-NTR的測序結(jié)果將初步正確的重組質(zhì)粒pBluescriptII-KS-twhh-Dendra2-NTR送上海英俊生物技術(shù)有限公司測序，測序結(jié)果表明twhh啟動子與pBluescriptII-KS-I-Dendra2-NTR載體片段已正確連接，質(zhì)粒pBluescriptII-KS-twhh-Dendra2-NTR構(gòu)建成功，如圖5所示，是根據(jù)測序結(jié)果和已知序列制作的質(zhì)粒pBluescriptII-KS-twhh-Dendra2-NTR圖譜。步驟二、斑馬魚轉(zhuǎn)基因系Tg(twhh:Dendra2-NTR)的構(gòu)建1、實(shí)驗材料1.1實(shí)驗動物本實(shí)驗研究在重慶市三峽庫區(qū)生態(tài)環(huán)境與生物資源省部共建國家重點(diǎn)實(shí)驗室培育基地進(jìn)行，野生型斑馬魚(AB系)按照實(shí)驗動物管理委員會條例規(guī)定在標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗條件下繁殖與飼養(yǎng)。1.2實(shí)驗試劑DMSO(二甲基亞砜)來自于上海生工生物技術(shù)公司，中國Mtz(甲硝唑)來自于Sigma公司；PTU(1-苯基-2-硫脲)來自于Sigma公司；Tricaine(間氨基苯甲酸乙酯)來自于Sigma公司；PT(緩沖液):PBS(磷酸鹽緩沖液)+1％TritonX-100(聚乙二醇辛基苯基醚)；PBTN(封閉液):PT+4％BSA(牛血清白蛋白)+0.02％NaN3(疊氮化鈉)。1.3顯微注射液顯微注射液的組成及用量如表9所示表9(重組質(zhì)粒pBluescriptII-KS-twhh-Dendra2-NTR來自結(jié)果3.4)Component(組分)Volume(用量)重組質(zhì)粒(150ng/μL)1μL10×I-SceIbuffer(緩沖劑)0.5μLI-SceI(內(nèi)切酶)1μLddH2O(去離子水)2.5μL2、實(shí)驗儀器北京愛生斑馬魚養(yǎng)殖系統(tǒng)；LSM780激光共聚焦顯微鏡(Zeiss，德國)ZeissAxioImageZ1全自動正置熒光顯微鏡(Zeiss，德國)ZeissSteREODiscoveryV20熒光體視顯微鏡(Zeiss，德國)Leica體視解剖顯微鏡(Leica，德國)LeicaM165C熒光體視顯微鏡(Leica，德國)。3、相關(guān)質(zhì)粒pBluescript-KS-twhh-Dendra2-NTR質(zhì)粒來自步驟一的結(jié)果。4、實(shí)驗方法4.1胚胎顯微注射4.1.1準(zhǔn)備工作1)注射槽：稱取1.5g瓊脂糖到100ml的eggwater(蛋水)加入燒瓶，微波爐中加熱3min。取出燒瓶，放在桌面上并傾倒入培養(yǎng)皿內(nèi)，約30mL凝膠液。取干凈的模具，以一端先接觸液面，緩慢蓋下，直到整塊模板平穩(wěn)漂浮于液面上方。等待凝膠液凝固，將模具取出，向培養(yǎng)皿內(nèi)傾倒少量eggwater(蛋水)，剛好覆蓋住整個注射槽為好，儲存于4℃。2)拉針：將無菌細(xì)玻璃管固定到拉針儀，瞬間拉出待用顯微注射針。此過程需注意加熱的位置應(yīng)盡量位于毛細(xì)玻璃管中間，這樣拉出來的兩根針才會長短適中，粗細(xì)均勻。在體視顯微鏡下用潔凈刀片將針的最前端切開。3)準(zhǔn)備待交配的斑馬魚：在注射的前晚，即可選擇10對，魚體較大、體色明顯的成魚。將他們按對放到交配缸中，中間加擋板分開過夜。第二天上午七點(diǎn)即可取出擋板開始交配。4.1.2顯微注射當(dāng)天工作1)配制注射液：現(xiàn)配注射液，用移液槍吸取3μL注入準(zhǔn)備好的拉針，將針固定在顯微注射儀上，調(diào)整注射針的位置以適合顯微注射。2)交配和收集胚胎：抽取魚缸中的擋板，讓雄性斑馬魚追趕雌性斑馬魚以刺激產(chǎn)卵。產(chǎn)卵后等待10min，此時胚胎已經(jīng)完全受精且發(fā)育到最適合注射的時期。用eggwater(蛋水)收集胚胎待用。3)注射：選取卵圓形單細(xì)胞時期的幼魚胚胎。用金屬撥針將胚胎卵黃朝向針注射的方向，輕按入注射槽內(nèi)。向每個胚胎注射0.15ng注射液，完成注射的胚胎放于新的培養(yǎng)皿中用eggwater(蛋水)浸泡，放置在28.5℃恒溫箱內(nèi)培養(yǎng)。4.1.3轉(zhuǎn)基因魚系的篩選與傳代穩(wěn)定注射后的胚胎培養(yǎng)到第三天，在熒光顯微鏡下，觀測報告基因twhh(tiggy-winklehedgehog，Hedgehog家族的一員)在脊索區(qū)域有綠色熒光表達(dá)，選出熒光信號強(qiáng)的幼魚繼續(xù)培養(yǎng)。將熒光信號強(qiáng)的成魚與野生型斑馬魚(AB系)雜交傳代，直至熒光信號的強(qiáng)度穩(wěn)定，通常雜交三代方可獲得穩(wěn)定的轉(zhuǎn)基因魚系。4.1.4抗體顯色第一天：1)收集適當(dāng)時期(25dpf、45dpf、60dpf)的斑馬魚轉(zhuǎn)基因系Tg(twhh:Dendra2-NTR)樣本，用4％PFA(多聚甲醛)固定材料，用1ml的PT溶液漂洗胚胎3次，每次5min。2)用1ml的PBS(磷酸鹽緩沖液)漂洗胚胎2次，每次5min。3)加入1ml的4％的多聚甲醛，在4℃下固定過夜(12-14h)。第二天：1)用PBS(磷酸鹽緩沖液)漂洗胚胎3次，每次5min。2)用PBTN(封閉液)在4℃下封閉2個小時。3)加一抗:(例如anti-dendra2)，用PBTN(封閉液)按照1:1000的比例稀釋在4℃下孵育過夜。第三天：1)回收抗體，抗體能重復(fù)使用3次。2)用PT(緩沖液)漂洗胚胎5次，每次45min。3)加二抗:用PBTN(封閉液)將Goat－anti－rabbit488(綠色熒光)二抗抗體按照1:500一1:1000的比例稀釋,每管200ul。在室溫下孵育2小時，或者在4℃下孵育過夜(通常過夜)。孵育時要避光(用錫箔紙包住)，以免熒光萃滅。第四天：1)除去二抗，用PT(緩沖液)漂洗胚胎5次，每次45min。2)lmlPT+0.2ulDAPI(4',6-二脒基-2-苯基吲哚，DAPI試劑保存在-30度，取出放置在冰盒上融化15min左右，注意全程避光)的混合液加入新的EP管中，水平搖床均勻搖擺一小時。將胚胎轉(zhuǎn)入含有80％甘油的PT(緩沖液)中，以便在顯微鏡下觀察。3)樣本可以在PT溶液中4℃下避光保存、拍照。5.實(shí)驗結(jié)果5.1斑馬魚轉(zhuǎn)基因系Tg(twhh:Dendra2-NTR)的表達(dá)模式借助激光共聚焦顯微鏡(ZeissLSM780)掃描來揭示斑馬魚脊柱發(fā)育過程，如圖6所示：當(dāng)幼魚發(fā)育到12dpf，斑馬魚脊索與底板的綠色熒光(即圖6中直線箭頭所指的顯示灰白色區(qū)域)強(qiáng)度逐漸減弱，茜素紅染色(即圖6中曲線箭頭所指的區(qū)域，也就是除矩形框外的其余部分中顯示灰白色的區(qū)域)顯示椎骨呈環(huán)形礦化，椎骨的礦化是從脊索的頭部向尾部漸進(jìn)的，此時脊索主要由綠色熒光標(biāo)記的空泡樣脊索細(xì)胞占據(jù)；在17dpf，斑馬魚脊索和底板被綠色熒光標(biāo)記，從頭部熒光表達(dá)強(qiáng)度與尾部熒光表達(dá)強(qiáng)度一致，茜素紅染色顯示出椎骨的礦化開始向前后端和背腹側(cè)擴(kuò)展發(fā)育；在25dpf，斑馬魚脊柱上大量綠色熒光細(xì)胞向脊柱椎間區(qū)域聚集，椎間區(qū)的綠色熒光強(qiáng)度明顯強(qiáng)于椎骨區(qū)域，茜素紅染色顯示每個脊椎由椎體，神經(jīng)弓，血管弓三個部分組成，神經(jīng)弓和血管弓都處于椎骨體的前側(cè)邊緣。5.2椎間盤特異性標(biāo)記基因twhh在椎間盤的表達(dá)特征通過對斑馬魚脊柱橫剖面抗體染色來揭示在斑馬魚脊柱發(fā)育不同時期的twhh基因在椎間盤的表達(dá)特征。如圖7所示：在25dpf，綠色染色熒光(即圖7中直線箭頭所指的顯示灰白色的區(qū)域)細(xì)胞大多位于脊索鞘壁，twhh基因標(biāo)記的綠色熒光細(xì)胞為空泡樣的脊索細(xì)胞。當(dāng)幼魚發(fā)育到45dpf，綠色熒光細(xì)胞僅僅在椎間盤組織表達(dá)，外層的纖維環(huán)細(xì)胞與內(nèi)側(cè)的髓核細(xì)胞均被綠色熒光信號標(biāo)記，此時twhh基因同時表達(dá)于椎間盤外層的纖維環(huán)細(xì)胞與內(nèi)側(cè)的髓核細(xì)胞。在60dpf，綠色熒光細(xì)胞僅僅在椎間盤組織外層的纖維環(huán)細(xì)胞有表達(dá)，在內(nèi)側(cè)的髓核細(xì)胞沒有發(fā)現(xiàn)綠色熒光信號的表達(dá)，此時twhh基因綠色染色熒光細(xì)胞僅僅表達(dá)于椎間盤的纖維環(huán)細(xì)胞并且不再標(biāo)記髓核細(xì)胞。如圖8所示，當(dāng)幼魚發(fā)育到60dpf，綠色熒光細(xì)胞(圖8中直線箭頭所指的顯示白色的區(qū)域)在椎間盤組織呈現(xiàn)高表達(dá)，茜素紅染色(圖8中曲線箭頭所指的顯示白色的區(qū)域)顯示椎骨發(fā)育完全成熟，綠色標(biāo)記的椎間盤鑲嵌在紅色標(biāo)記的椎骨內(nèi)部，通過橫斷面抗體染色顯示：在60dpf，綠色染色熒光細(xì)胞僅僅表達(dá)于椎間盤的纖維環(huán)細(xì)胞并且不再標(biāo)記髓核細(xì)胞。通過多次連續(xù)性的顯微注射重組質(zhì)粒，我們篩選出表達(dá)部位具有強(qiáng)熒光表達(dá)并且能夠在后代穩(wěn)定遺傳的Founders來進(jìn)行后續(xù)的實(shí)驗。在隨后進(jìn)行的實(shí)驗中所采用的轉(zhuǎn)基因系Tg(twhh:Dendra2-NTR)幼魚都是由脊柱各個節(jié)段椎間盤細(xì)胞熒光表達(dá)強(qiáng)弱一致的轉(zhuǎn)基因魚系穩(wěn)定遺傳的后代。椎間盤重度受損引起椎骨退變本實(shí)驗是利用Mtz/NTR系統(tǒng)對前期實(shí)驗中培育出穩(wěn)定的斑馬魚轉(zhuǎn)基因魚系Tg(twhh:Dendra2-NTR)的椎間盤重度損傷來模擬椎間盤退變，通過激光共聚焦掃描發(fā)現(xiàn)椎間盤重度損傷的椎間盤退變引起椎骨退變。運(yùn)用MicroCT在一個三維方向的連續(xù)與準(zhǔn)確的掃描，可以產(chǎn)生高分辨率掃描數(shù)據(jù)來分析椎骨生物礦化異常等表型。步驟三：轉(zhuǎn)基因系Tg(twhh:Dendra2-NTR)重度損傷模型構(gòu)建1.實(shí)驗材料1.1實(shí)驗動物本實(shí)驗研究在重慶市三峽庫區(qū)生態(tài)環(huán)境與生物資源省部共建國家重點(diǎn)實(shí)驗室培育基地進(jìn)行，斑馬魚轉(zhuǎn)基因系Tg(twhh:dendra2-NTR)來自步驟二的實(shí)驗結(jié)果，按照實(shí)驗動物管理委員會條例規(guī)定在標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗條件下繁殖與飼養(yǎng)。1.2實(shí)驗試劑DMSO(二甲基亞砜)來自于上海生工生物技術(shù)公司；Mtz(甲硝唑)來自于Sigma公司；PTU(二苯胺基甲硫酮)來自于Sigma公司；Tricaine(間氨基苯甲酸乙酯)來自于Sigma公司。1.2.1Mtz(甲硝唑)處理劑1)處理組溶液：稱量相應(yīng)重量的Mtz(甲硝唑)粉末，加入到含0.2％DMSO的eggwater(蛋水)中，放置于37℃房水平搖床以250rpm搖勻溶解2h，嚴(yán)密避光。2)對照組溶液：將0.2％DMSO加入到的eggwater(蛋水)中，放置于37℃房水平搖床以250rpm搖勻溶解2h，嚴(yán)密避光。1.3實(shí)驗儀器北京愛生斑馬魚養(yǎng)殖系統(tǒng)；LSM780激光共聚焦顯微鏡，來自于德國蔡司公司；Heraeus立式恒溫胚胎培養(yǎng)箱；ZeissAxioImageZ1全自動正置熒光顯微鏡；ZeissSteREODiscoveryV20熒光體視顯微鏡；Leica體視解剖顯微鏡；LeicaM165C熒光體視顯微鏡。2.實(shí)驗方法1)選取受精后60天做為幼魚的處理起始時間。2)配制濃度為10mM的Mtz(甲硝銼)溶液及對照組溶液，避光浸泡幼魚持續(xù)處理72h。3)通過體式熒光顯微鏡觀察處理組與對照組中幼魚熒光的變化情況。等待處理組中幼魚椎間盤細(xì)胞表達(dá)的綠色熒光信號完全消失，用新配的eggwater(蛋水)清洗。4)根據(jù)幼魚的處理情況確定最佳Mtz溶液處理濃度、起始時間、持續(xù)時間。3.實(shí)驗結(jié)果如圖9所示：處理組為10mMMtz溶液，對照組為0.2％DMSO溶液。選取60dpf的轉(zhuǎn)基因幼魚Tg(twhh:Dendra2-NTR)進(jìn)行實(shí)驗。用Mtz(甲硝唑)溶液避光處理72h時，處理組相比對照組幼魚的綠色熒光(圖9中直線箭頭所指的顯示白色的區(qū)域)強(qiáng)度明顯減弱直至消失。運(yùn)用激光共聚焦顯微鏡(ZeissLSM780)掃描發(fā)現(xiàn)：Mtz(甲硝唑)處理后恢復(fù)0天的幼魚，對照組幼魚椎間盤纖維環(huán)綠色熒光細(xì)胞大量存在，而且位于茜素紅染色(除去直線箭頭所指的白色區(qū)域外的顯示灰色的區(qū)域)的紅色椎骨的中央，椎骨整齊的呈節(jié)段性排列；然而處理組幼魚的椎間盤纖維環(huán)綠色熒光細(xì)胞完全消失，通過激光共聚焦顯微鏡掃描不到纖維環(huán)上任何綠色熒光細(xì)胞的存在，椎骨之間的間隙明顯減小，前后椎骨緊密相連。Mtz(甲硝唑)處理后恢復(fù)40天的幼魚，對照組椎間盤纖維環(huán)綠色熒光細(xì)胞仍然密集存在，茜素紅染色的紅色椎骨寬度明顯增加并且整齊的呈節(jié)段性排列；然而相比對照組，處理組中消失的椎間盤纖維環(huán)綠色熒光細(xì)胞仍然沒有出現(xiàn)，椎骨之間的間隙完全消失，前后椎骨更加緊密相連，而且椎骨的長度明顯變短。步驟四：斑馬魚椎間盤重度損傷后脊柱的MicroCT掃描分析1.實(shí)驗材料1.1實(shí)驗動物實(shí)驗動物與步驟三相同。1.2實(shí)驗試劑實(shí)驗試劑與步驟三相同。1.3實(shí)驗儀器北京愛生斑馬魚養(yǎng)殖系統(tǒng)；Micro-CT來自于vivaCT40，瑞士SCANCO公司。2.實(shí)驗方法用4％PFA(多聚甲醛)固定Mtz處理后恢復(fù)0天(R0D)與Mtz處理后恢復(fù)40天(R40D)的對照組與處理組的斑馬魚樣本，首先掃描整魚脊柱(分辨率為17μm)，然后在體式顯微鏡下分離出整魚的尾椎作為局部精度掃描部分(分辨率為10μm)。設(shè)置掃描電壓為70KV，電流為500mA。3.實(shí)驗結(jié)果如圖10的矩形框中所示：Mtz處理后恢復(fù)0天(R0D)，對照組幼魚中椎骨整齊的呈節(jié)段性排列，然而處理組幼魚的椎骨緊密相連，椎骨間距明顯被椎間區(qū)異常礦化的骨組織覆蓋。Mtz(甲硝唑)處理后恢復(fù)40天(R40D)，對照組幼魚的椎骨礦化明顯增強(qiáng)，然而處理組幼魚的椎骨連接更加緊密，椎間區(qū)域的礦化明顯加強(qiáng)導(dǎo)致椎骨間隙完全消失，椎骨的生物礦化異常導(dǎo)致單節(jié)椎骨的形態(tài)異常，單節(jié)椎骨的長度明顯變短是導(dǎo)致整魚脊柱的長度變短的主要原因。由此可見，通過本發(fā)明的構(gòu)建方法中的轉(zhuǎn)基因系Tg(twhh:Dendra2-NTR)詳細(xì)闡明了斑馬魚椎間盤與椎骨的發(fā)育過程，并且顯示出twhh基因啟動子能夠驅(qū)動綠色熒光蛋白的表達(dá)，清晰記錄了斑馬魚從脊索細(xì)胞開始發(fā)育向椎間盤細(xì)胞發(fā)育成熟逐漸轉(zhuǎn)變的過程。基于Mtz/NTR系統(tǒng)構(gòu)建特異性椎間盤損傷模型，主要是通過前期成功構(gòu)建的重組轉(zhuǎn)基因系，使細(xì)胞特異性表達(dá)硝基還原酶(NTR)。斑馬魚椎間盤損傷的基本原理是：通過硝基還原酶(NTR)與甲硝唑(Mtz)結(jié)合，使表達(dá)硝基還原酶的椎間盤細(xì)胞死亡。目前的研究認(rèn)為：椎間盤退變是導(dǎo)致下腰痛最主要的一個病理過程，并且成為了椎間盤突出癥的一個先決條件。雖然機(jī)械壓力是導(dǎo)致椎間盤退變的一個非常重要的調(diào)控因素，但是對于椎間盤退變的潛在分子機(jī)制仍然是未知的。結(jié)合斑馬魚在水中生活的優(yōu)勢，我們可以排除外界重力的長期機(jī)械壓力對于斑馬魚椎間盤刺激的影響。相比于小鼠椎間盤退變模型主要是通過外科手術(shù)的方式來定點(diǎn)損傷小鼠腰椎局部幾個椎間盤，本發(fā)明的利用甲硝噠唑藥物浸泡斑馬魚轉(zhuǎn)基因系Tg(twhh:Dendra2-NTR)的方式來特異性的損傷斑馬魚體內(nèi)所有的椎間盤，借助斑馬魚體內(nèi)所有椎間盤重度受損來構(gòu)建斑馬魚體內(nèi)所有椎間盤退變的新型動物模型。實(shí)驗中以10mMMtz(甲硝唑)溶液作為處理組、0.2％DMSO為對照組，在避光條件下處理72小時，對照組的轉(zhuǎn)基因系Tg(twhh:Dendra2-NTR)的椎間盤綠色熒光無明顯變化，然而處理組幼魚全身椎間盤的綠色熒光明顯消失。這說明處理組中的Mtz(甲硝唑)能夠誘導(dǎo)NTR(硝基還原酶)致死蛋白的產(chǎn)生，Mtz/NTR(甲硝唑/硝基還原酶)系統(tǒng)能夠特異性導(dǎo)致表達(dá)NTR(硝基還原酶)的細(xì)胞死亡，然而對照組中的DMSO對椎間盤發(fā)育沒有影響。由此證明，我們構(gòu)建的Tg(twhh:Dendra2-NTR)轉(zhuǎn)基因斑馬魚椎間盤損傷模型的構(gòu)建方法是成功的。當(dāng)我們用甲硝唑MTZ藥物浸泡幼魚的時候，椎間盤中纖維環(huán)上的綠色熒光細(xì)胞才會發(fā)揮相應(yīng)的細(xì)胞毒性，我們通過10mML工作濃度的甲硝唑MTZ藥物浸泡的時間來區(qū)分椎間盤損傷的程度，通過避光浸泡，連續(xù)72小時的處理，從而出現(xiàn)纖維環(huán)上大量細(xì)胞凋亡的現(xiàn)象，同時甲硝唑MTZ并不會損傷周圍的其它組織。椎間盤退變的小鼠模型常被用來探究退變中機(jī)械壓力的作用。通過24小時的機(jī)械過載來誘導(dǎo)纖維環(huán)細(xì)胞凋亡并且導(dǎo)致小鼠某幾個椎間盤退變。通過免疫染色來揭示：細(xì)胞色素C釋放，但并沒有凋亡相關(guān)因子配體生成。Rannou等通過收集人類樣本，小鼠模型的分析，結(jié)合纖維環(huán)培養(yǎng)實(shí)驗證明：機(jī)械過載誘導(dǎo)椎間盤退變是通過在椎間盤細(xì)胞中的線粒體凋亡途徑來調(diào)控的。然而我們的研究發(fā)現(xiàn)Mtz/NTR系統(tǒng)特異性重度損傷椎間盤細(xì)胞，引起椎骨發(fā)生退行性病變，這樣便于我們進(jìn)一步去探索斑馬魚椎間盤退變與椎骨退變之間是否存在某種相關(guān)的聯(lián)系，為何椎間盤退變會導(dǎo)致椎骨的生物礦化進(jìn)程被擾亂，由此推測椎骨礦化受阻是否因為某種重要的信號通路的調(diào)控導(dǎo)致椎骨體內(nèi)的成骨細(xì)胞與破骨細(xì)胞的動態(tài)平衡被破壞而引起，這些疑問都需要我們進(jìn)行更深入的研究去深入探索其中的奧秘。轉(zhuǎn)基因系Tg(twhh:Dendra2-NTR)椎間盤重度受損引起椎體退變，通過綠色熒光蛋白特異性標(biāo)記椎間盤，茜素紅染色特異性標(biāo)記礦化的椎骨，在我們標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗條件下，重度損傷的椎間盤不能自我恢復(fù)，并且導(dǎo)致椎骨發(fā)育礦化的嚴(yán)重缺陷。聯(lián)系Inohaya等構(gòu)建Tg(twist:EGFP)和Tg(osteocalcin:GFP)這兩個轉(zhuǎn)基因魚系分別標(biāo)記出椎骨體的前體成骨細(xì)胞和成熟成骨細(xì)胞，通過運(yùn)用雙轉(zhuǎn)基因魚系通過激光共聚焦顯微鏡掃描證實(shí)了椎間區(qū)的綠色熒光的前體成骨細(xì)胞分化為椎骨體的紅色熒光的成熟成骨細(xì)胞。此研究認(rèn)為：脊柱椎間區(qū)生骨節(jié)來源的前體成骨細(xì)胞分化為椎骨體的成熟成骨細(xì)胞，椎間區(qū)域在椎骨體的生長發(fā)育過程中扮演著一個生長中心的作用。綜合以上的研究結(jié)果，我們初步推測斑馬魚椎間盤對于椎骨的生長發(fā)育具有重要的作用。我們通過以上的實(shí)驗技術(shù)手段證明了斑馬魚椎間盤重度損傷模型是可以用于椎間盤退變模型的研究，其次斑馬魚椎間盤退變后引起椎骨發(fā)生退行性病變，說明我們構(gòu)建的動物模型可用于椎間盤退變與椎骨退變的相關(guān)分子調(diào)控機(jī)制的探索。初步推測作用機(jī)制是重度損傷的椎間盤自身無法恢復(fù)發(fā)生退行性病變，影響了脊柱椎間區(qū)的微環(huán)境，導(dǎo)致椎骨穩(wěn)態(tài)平衡的失調(diào)進(jìn)而出現(xiàn)椎骨退變的病理表型。試驗一：不用引物對重組質(zhì)粒構(gòu)建的影響試驗方法：與實(shí)施例中的步驟一操作方法一致，不同之處在于：DNA聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)設(shè)置了四組不同引物序列如表10所示：表10正向引物FW反向引物RW泳道1cgtccatgtgtaactccgtaacgtccttgcaccatttgtctgtc泳道2cgtccatgtgtaactccgtaacgacgtttgaattatctcttctggtc泳道4gtactgtatctgtgctgattcacgtccttgcaccatttgtctgtc泳道5gtactgtatctgtgctgattcacgacgtttgaattatctcttctggtc測試結(jié)果如圖11所示：由此可見：泳道3為1kbDNAmarker。泳道5有特異性的5.8kbtwhh片段，而且亮度較強(qiáng)，說明濃度較高，可用于pGEMT-twhh重組質(zhì)粒的構(gòu)建。泳道1、2、4有特異性的5.8kbtwhh片段，而且亮度一般，非特異性條帶的拖帶太多，不可用于pGEMT-twhh重組質(zhì)粒的構(gòu)建。試驗二：退火溫度對重組質(zhì)粒構(gòu)建的影響試驗方法：與實(shí)施例的步驟一操作方法一致，不同之處在于：DNA聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)設(shè)置了兩組不同退火溫度如表11所示：表11不同試劑的PCR反應(yīng)體系與反應(yīng)過程泳道1退火溫度為58度泳道3退火溫度為52度測試結(jié)果如圖12所示：由此可見：泳道2為1kbDNAmarker。泳道1有特異性的5.8kbtwhh片段，并且出現(xiàn)一些非特異性條帶，但是5.8kbtwhh片段亮度很強(qiáng)，說明濃度較高，利于pGEMT-twhh重組質(zhì)粒的構(gòu)建。泳道3沒有出現(xiàn)特異性的5.8kbtwhh片段，不可用于pGEMT-twhh重組質(zhì)粒的構(gòu)建。對于本領(lǐng)域的技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明技術(shù)方案的前提下，還可以作出若干變形和改進(jìn)，這些也應(yīng)該視為本發(fā)明的保護(hù)范圍，這些都不會影響本發(fā)明實(shí)施的效果和專利的實(shí)用性。<110>重慶醫(yī)科大學(xué)附屬口腔醫(yī)院<120>斑馬魚椎間盤損傷模型的構(gòu)建方法<160>10<210>1<211>29<212>RNA<213>人工序列<220><221>prim_bind<400>1GTCGACGTACTGTATCTGTGCTGATTCAC<210>2<211>24<212>RNA<213>人工序列<220><221>prim_bind<400>2GACCAGAAGAGATAATTCAAACGT<210>3<211>22<212>RNA<213>人工序列<220><221>prim_bind<400>3cgtccatgtgtaactccgtaac<210>4<211>22<212>RNA<213>人工序列<220><221>prim_bind<400>4gtccttgcaccatttgtctgtc<210>5<211>22<212>RNA<213>人工序列<220><221>prim_bind<400>5cgtccatgtgtaactccgtaac<210>6<211>25<212>RNA<213>人工序列<220><221>prim_bind<400>6gacgtttgaattatctcttctggtc<210>7<211>23<212>RNA<213>人工序列<220><221>prim_bind<400>7gtactgtatctgtgctgattcac<210>8<211>22<212>RNA<213>人工序列<220><221>prim_bind<400>8gtccttgcaccatttgtctgtc<210>9<211>23<212>RNA<213>人工序列<220><221>prim_bind<400>9gtactgtatctgtgctgattcac<210>10<211>25<212>RNA<213>人工序列<220><221>prim_bind<400>10gacgtttgaattatctcttctggtc當(dāng)前第1頁1 2 3