本發(fā)明屬于植物保護(hù)和生物技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種弱酸抑制稻瘟菌效應(yīng)蛋白基因過表達(dá)菌株侵染水稻PCD途徑相關(guān)基因上調(diào)的方法。

背景技術(shù)：

為了成功侵入寄主，侵染過程中，灰葡萄孢菌(Botrytis cinerea)在寄主的不同組織分泌不同的蛋白。盡管一些“真正的”毒性因子能成功抑制寄主防御響應(yīng)，但需要不同的胞外分泌蛋白協(xié)同起作用?；移咸焰呔甑姆置诮M研究表明，在pH4和pH6條件下，灰葡萄孢菌株培養(yǎng)液呈現(xiàn)黑色的原因是菌絲在生長(zhǎng)過程中產(chǎn)生的有色次生代謝產(chǎn)物所致。Louis等人研究發(fā)現(xiàn)，新月旋腔孢菌培養(yǎng)過程中的培養(yǎng)液出現(xiàn)淡黃色和乳白色，以及菌絲的黑化，是由于其除了分泌包括有色次生代謝產(chǎn)物外，還伴有候選效應(yīng)蛋白的分泌。研究還表明，黑色素水平較高的新月旋腔孢菌株比黑色素水平較低的菌株具有更強(qiáng)的毒性，黑色素和相關(guān)次生代謝產(chǎn)物是新月旋腔孢菌株的毒性因子。對(duì)定殖于寄主組織上的新月旋腔孢菌菌絲進(jìn)行觀察發(fā)現(xiàn)，棕黑色的色素可能是新月旋腔孢菌在高溫條件下維持其毒性必需的適應(yīng)性特性。有研究發(fā)現(xiàn)色素合成和熱激響應(yīng)相關(guān)蛋白在新月旋腔孢菌定殖寄主過程中表達(dá)上調(diào)。pH是影響真菌分泌不同效應(yīng)蛋白以促進(jìn)其在寄主組織內(nèi)定殖的重要環(huán)境因素。而pH是如何影響病原菌與寄主互作過程中寄主對(duì)不同pH環(huán)境響應(yīng)的抗病機(jī)制(例如SA途徑、JA途徑及PCD途徑的響應(yīng))？目前尚未有這方面的研究報(bào)道。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的就在于為了解決上述問題而提供一種抑制侵染水稻PCD途徑相關(guān)基因上調(diào)的方法。

本發(fā)明通過以下技術(shù)方案來實(shí)現(xiàn)上述目的：

本發(fā)明包括以下步驟：

(1)采用弱酸pH4.6,pH5.0,pH5.2,pH5.5處理稻瘟菌效應(yīng)蛋白基因過表達(dá)菌株孢子；

(2)用懸浮液噴霧接種水稻葉片；

(3)于0h,24h,48h,72h和96h五個(gè)時(shí)間點(diǎn)取樣，提取水稻樣品總RNA；

(4)反轉(zhuǎn)錄成cDNA，real-time RT-PCR檢測(cè)cDNA；

(5)分析PCD途徑相關(guān)的主要基因PR1a和PR5在不同時(shí)間點(diǎn)的表達(dá)。

本發(fā)明的有益效果在于：

本發(fā)明是一種抑制侵染水稻PCD途徑相關(guān)基因上調(diào)的方法，與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明弱酸處理病原菌孢子后噴霧接種水稻葉片對(duì)水稻PCD途徑主要相關(guān)基因表達(dá)的影響。它克服了研究非生物環(huán)境pH影響寄主-病原互作機(jī)制中，常借助溫室設(shè)計(jì)各種弱酸處理以觀察寄主表型變化、以及篩選大量水稻防御相關(guān)基因表達(dá)等周期長(zhǎng)和效率低的弊端，提供了一種更為簡(jiǎn)便、有效、準(zhǔn)確地弱酸處理病原菌孢子、定量檢測(cè)水稻PCD途徑主要相關(guān)基因表達(dá)的方法，為更快速準(zhǔn)確地進(jìn)行弱酸對(duì)水稻與稻瘟病菌互作機(jī)制的研究提供重要的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

具體實(shí)施方式

下面對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說明：

本發(fā)明包括以下步驟：

(1)采用弱酸pH4.6,pH5.0,pH5.2,pH5.5處理稻瘟菌效應(yīng)蛋白基因過表達(dá)菌株孢子；

(2)用懸浮液噴霧接種水稻葉片；

(3)于0h,24h,48h,72h和96h五個(gè)時(shí)間點(diǎn)取樣，提取水稻樣品總RNA；

(4)反轉(zhuǎn)錄成cDNA，real-time RT-PCR檢測(cè)cDNA；

(5)分析PCD途徑相關(guān)的主要基因PR1a和PR5在不同時(shí)間點(diǎn)的表達(dá)。

本發(fā)明中弱酸處理稻瘟菌孢子、稻瘟病菌孢子噴霧接種、水稻育苗、水稻總RNA提取、real-time RT-PCR及數(shù)據(jù)分析等方法均與常規(guī)相同。

本發(fā)明的有益效果是直接準(zhǔn)確地檢測(cè)經(jīng)弱酸處理的稻瘟菌效應(yīng)蛋白基因過表達(dá)菌株孢子懸浮液噴霧接種于水稻葉片上，于不同時(shí)間點(diǎn)取樣，提取水稻葉片總RNA，real-time RT-PCR分析受侵染水稻PCD途徑相關(guān)基因PR1a的表達(dá)?？朔艘延醒芯坎【c寄主互作時(shí)對(duì)非生物因子響應(yīng)機(jī)制時(shí)借助溫室設(shè)計(jì)各種弱酸處理以觀察寄主表型變化、以及篩選大量水稻防御相關(guān)基因表達(dá)等周期長(zhǎng)和效率低的弊端，最終達(dá)到為今后有目的地直接深入開展病原菌與寄主互作時(shí)對(duì)非生物因子之一(弱酸)響應(yīng)機(jī)制的研究提供重要的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。具體方法是采用弱酸處理稻瘟菌效應(yīng)蛋白基因過表達(dá)菌株孢子，將處理后的孢子懸浮液噴霧接種于水稻葉片上，于不同時(shí)間點(diǎn)(0h,24h,48h,72h和96h)取樣，提取樣品總RNA，real-time RT-PCR分析PCD途徑相關(guān)的基因(PR1a和PR5)的表達(dá)量。通過分析弱酸(pH4.6,pH5.0,pH5.2,pH5.5)處理病原菌基因過表達(dá)菌株侵染水稻后對(duì)水稻PCD途徑相關(guān)基因表達(dá)的影響，可準(zhǔn)確快速地了弱酸處理稻瘟病菌后對(duì)其侵染水稻PCD途徑相關(guān)基因的表達(dá)變化，為有目的地直接深入開展病原菌與寄主互作時(shí)對(duì)非生物因子之一(弱酸)響應(yīng)機(jī)制的研究提供重要的實(shí)驗(yàn)依據(jù)?？朔艘延醒芯坎【c寄主互作時(shí)對(duì)非生物因子響應(yīng)機(jī)制時(shí)借助溫室設(shè)計(jì)各種弱酸處理以觀察寄主表型變化、以及篩選大量水稻防御相關(guān)基因表達(dá)等周期長(zhǎng)和效率低的弊端。

實(shí)施例一：

采用弱酸pH4.6處理稻瘟病菌孢子懸浮液，將孢子懸浮液接種于三葉一心期的水稻葉片上，28℃黑暗保濕24h后，置于溫室中進(jìn)行保溫保濕。于接種0h、24h、48h和96h取樣，TrizolRNA提取試劑盒提取樣品總RNA，利用real-time RT-PCR檢測(cè)PCD途徑相關(guān)的基因(PR1a和PR5)表達(dá)量(表1)。

表1PAL和EDS1在pH4.6處理稻瘟菌過表達(dá)菌株侵染水稻不同時(shí)間點(diǎn)表達(dá)量

實(shí)施例二：

采用弱酸pH5.0處理稻瘟病菌孢子懸浮液，將孢子懸浮液接種于三葉一心期的水稻葉片上，28℃黑暗保濕24h后，置于溫室中進(jìn)行保溫保濕。于接種0h、24h、48h和96h取樣，TrizolRNA提取試劑盒提取樣品總RNA，利用real-time RT-PCR檢測(cè)PCD途徑相關(guān)的基因(PR1a和PR5)表達(dá)量(表2)。

表2PAL和EDS1在pH5.0處理稻瘟菌過表達(dá)菌株侵染水稻不同時(shí)間點(diǎn)表達(dá)量

實(shí)施例三：

采用弱酸pH5.2處理稻瘟病菌孢子懸浮液，將孢子懸浮液接種于三葉一心期的水稻葉片上，28℃黑暗保濕24h后，置于溫室中進(jìn)行保溫保濕。于接種0h、24h、48h和96h取樣，TrizolRNA提取試劑盒提取樣品總RNA，利用real-time RT-PCR檢測(cè)PCD途徑相關(guān)的基因(PR1a和PR5)表達(dá)量(表3)。

表3PAL和EDS1在pH5.2處理稻瘟菌過表達(dá)菌株侵染水稻不同時(shí)間點(diǎn)表達(dá)量

實(shí)施例四：

采用弱酸pH5.5處理稻瘟病菌孢子懸浮液，將孢子懸浮液接種于三葉一心期的水稻葉片上，28℃黑暗保濕24h后，置于溫室中進(jìn)行保溫保濕。于接種0h、24h、48h和96h取樣，TrizolRNA提取試劑盒提取樣品總RNA，利用real-time RT-PCR檢測(cè)PCD途徑相關(guān)的基因(PR1a和PR5)表達(dá)量(表4)。

表4PAL和EDS1在pH5.5處理稻瘟菌過表達(dá)菌株侵染水稻不同時(shí)間點(diǎn)表達(dá)量

以上顯示和描述了本發(fā)明的基本原理和主要特征及本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)。本行業(yè)的技術(shù)人員應(yīng)該了解，本發(fā)明不受上述實(shí)施例的限制，上述實(shí)施例和說明書中描述的只是說明本發(fā)明的原理，在不脫離本發(fā)明精神和范圍的前提下，本發(fā)明還會(huì)有各種變化和改進(jìn)，這些變化和改進(jìn)都落入要求保護(hù)的本發(fā)明范圍內(nèi)。本發(fā)明要求保護(hù)范圍由所附的權(quán)利要求書及其等效物界定。