本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥研究領(lǐng)域，具體涉及一種制備心臟祖細(xì)胞的方法。

背景技術(shù)：

心血管疾病是我國重要的公共衛(wèi)生問題，其高發(fā)病率、發(fā)病年輕化、高致殘率趨勢日益嚴(yán)峻。盡管有實(shí)驗(yàn)表明人的心臟細(xì)胞具有一定的再生能力，但這種自身再生能力不足以修復(fù)缺血等病理因素導(dǎo)致的大量心臟細(xì)胞丟失。因此，受損心臟組織的再生和修復(fù)是心血管轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)研究中亟待解決的難題。

心臟祖細(xì)胞(Cardiac Progenitor Cells,CPCs)是心臟發(fā)育起源細(xì)胞，能自我更新以及定向分化為心肌細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞，是實(shí)現(xiàn)心臟再生的潛在種子細(xì)胞來源，但體內(nèi)固有干細(xì)胞的數(shù)量極少，體外分離培養(yǎng)、擴(kuò)增CPCs非常繁瑣耗時，限制了臨床大規(guī)模應(yīng)用。重編程技術(shù)的出現(xiàn)與迅猛發(fā)展，推進(jìn)了外源性心臟細(xì)胞的獲取。

近十年來，科學(xué)家們做了許多努力。當(dāng)前，多能性重編程、直接重編程技術(shù)主要包括外源性遺傳物質(zhì)導(dǎo)入法、小分子誘導(dǎo)和蛋白質(zhì)誘導(dǎo)。即使基因?qū)敕v經(jīng)了從整合型病毒(逆轉(zhuǎn)錄病毒、慢病毒)到非整合型病毒(轉(zhuǎn)座子技術(shù))、無病毒轉(zhuǎn)染，仍然不能完全排除外源性遺傳物質(zhì)殘存所致的一系列安全隱患，加上非整合型病毒載體操作復(fù)雜，耗時長，效率較低，還不能突破臨床應(yīng)用的瓶頸。小分子化合物誘導(dǎo)法雖然擺脫了重編程對外源基因的過分依賴，但由于小分子依賴于信號通路刺激細(xì)胞轉(zhuǎn)變，其細(xì)胞狀態(tài)、細(xì)胞微環(huán)境直接決定了小分子誘導(dǎo)的效率。重編程的關(guān)鍵在于進(jìn)行核內(nèi)重編程，擦除體細(xì)胞的記憶，激活干細(xì)胞基因的表達(dá)。對于基因?qū)敕ê托》肿佣?，僅有少部分基因、小部分化合物到達(dá)核內(nèi)發(fā)揮作用。

相比之下，蛋白質(zhì)是基因功能的執(zhí)行體，機(jī)體生命活動的基礎(chǔ)。這意味著藥物樣蛋白質(zhì)在重編程中具有巨大的潛力。蛋白質(zhì)誘導(dǎo)法不借助病毒、外源性基因，更為安全，適用于未來臨床轉(zhuǎn)化。蛋白質(zhì)誘導(dǎo)的最大挑戰(zhàn)在于大分子量、結(jié)構(gòu)復(fù)雜的重編程蛋白如何跨越細(xì)胞膜這道“防火墻”進(jìn)入細(xì)胞核發(fā)揮作用。

經(jīng)過人們的不懈努力，借助優(yōu)良的新型納米試劑，精準(zhǔn)遞送蛋白質(zhì)已經(jīng)變得輕而易舉。相對而言，高效重編程因子的選擇一直困擾著全世界。

因此，獲得一種針對細(xì)胞種類創(chuàng)新地提供了“個性化”、安全、高效的蛋白誘導(dǎo)生成心臟祖細(xì)胞的方法，非常重要。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

為了克服現(xiàn)有技術(shù)中所存在的問題，本發(fā)明的目的在于提供一種制備心臟祖細(xì)胞的方法。

為了實(shí)現(xiàn)上述目的以及其他相關(guān)目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：

本發(fā)明的第一方面提供一種制備心臟祖細(xì)胞的方法，包括步驟：將重編程因子轉(zhuǎn)導(dǎo)至起始重編程對象細(xì)胞內(nèi)，所述重編程因子選自心臟轉(zhuǎn)錄因子、表觀遺傳調(diào)控因子。

優(yōu)選地，所述方法還包括步驟：將重編程因子轉(zhuǎn)導(dǎo)至起始重編程對象細(xì)胞內(nèi)后在合適的條件下培養(yǎng)或擴(kuò)增轉(zhuǎn)導(dǎo)后的起始重編程對象細(xì)胞。

優(yōu)選地，所述重編程因子選自Gata4、Tbx5、Nkx2.5、AF9、Hand2、Mef2C、Mesp1、Baf60c、UTX中任一種或多種的組合。

Gata4在NCBI的ID:NP_001295022.1。

Tbx5在NCBI的ID:NP_852259.1。

Nkx2.5在NCBI的ID:NP_004378.1。

AF9在NCBI的ID:NP_001180279.1。

Hand2在NCBI的ID:NP_068808.1。

Mef2C在NCBI的ID:NP_001180279.1。

Mesp1在NCBI的ID:NP_061140.1。

Baf60c在NCBI的ID:NP_001003802.1。

UTX在NCBI的ID:NP_001278344.1.。

本領(lǐng)域技術(shù)人員在獲知了Gata4、Tbx5、Nkx2.5、AF9、Hand2、Mef2C、Mesp1、Baf60c、UTX各自的氨基酸序列后，能夠根據(jù)現(xiàn)有技術(shù)制備獲得這些重編程因子?？刹捎玫闹苽浞椒ú⒉幌拗朴趯?shí)施例中所例舉的制備方法，只要能夠成功獲得這些重編程因子即可。

優(yōu)選地，將重編程因子轉(zhuǎn)導(dǎo)至起始重編程對象細(xì)胞的細(xì)胞核內(nèi)。

優(yōu)選地，所述起始重編程對象為成體干細(xì)胞。

進(jìn)一步優(yōu)選地，所述起始重編程對象選自骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞或臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞。所述起始重編程對象可以是人類骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞或人類臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞。

進(jìn)一步地，所述方法為在體外制備心臟祖細(xì)胞的方法。

優(yōu)選地，所述方法包括步驟：將重編程因子與起始重編程對象細(xì)胞混合，進(jìn)而將重編程因子轉(zhuǎn)導(dǎo)至起始重編程對象細(xì)胞內(nèi)。

優(yōu)選地，所述重編程因子為下之任一：(1)重編程因子GMT由Gata4、Mef2C、Tbx5組成；(2)重編程因子GMTB由Gata4、Mef2C、Tbx5、Baf60c組成；(3)重編程因子GHMT由Gata4、Hand2、Mef2C、Tbx5組成；(4)重編程因子GNT由Gata4、Nkx2.5、Tbx5組成；(5)重編程因子GNTB由Gata4、Nkx2.5、Tbx5、Baf60c組成；(6)重編程因子GNMT由Gata4、Nkx2.5、Mef2C、Tbx5組成；(7)重編程因子GM1T由Gata4、Mef2C、Mesp1、Tbx5組成；(8)重編程因子GNM1T由Gata4、Nkx2.5、Mef2C、Mesp1、Tbx5組成；(9)重編程因子GMM1T由Gata4、Mef2C、Mef2C、Mesp1、Tbx5組成；(10)重編程因子GTB由Gata4、Tbx5、Baf60c組成；(11)重編程因子GM1TB由Gata4、Mef2C、Mesp1、Tbx5、Baf60c組成；(12)重編程因子GNTA由Gata4、Nkx2.5、Tbx5、AF9組成；(13)重編程因子GNTU由Gata4、Tbx5、Nkx2.5、UTX組成；(14)重編程因子GNTAU由Gata4、Nkx2.5、Tbx5、AF9、UTX組成。

優(yōu)選地，將重編程因子與起始重編程對象細(xì)胞混合后，Gata4的終濃度是0.2～0.4μg/ml，Tbx5的終濃度是0.2～0.4μg/ml，Nkx2.5的終濃度是0.1～0.2μg/ml，Hand2的終濃度是0.1～0.2μg/ml，Mef2C的終濃度是0.2～0.4μg/ml，Mesp1的終濃度是0.3～0.6μg/m，Baf60c的終濃度是0.4～0.8μg/ml，UTX的終濃度是0.5～1.0μg/ml，AF9的終濃度是0.5～1.0μg/ml。

優(yōu)選地，所述方法進(jìn)一步包括步驟：將重編程因子先與轉(zhuǎn)導(dǎo)載體復(fù)合后形成重編程因子-轉(zhuǎn)導(dǎo)載體復(fù)合物，然后將所述重編程因子-轉(zhuǎn)導(dǎo)載體復(fù)合物與起始重編程對象細(xì)胞混合，進(jìn)而通過轉(zhuǎn)導(dǎo)載體將重編程因子轉(zhuǎn)導(dǎo)至起始重編程對象細(xì)胞內(nèi)。優(yōu)選地，將重編程因子轉(zhuǎn)導(dǎo)至起始重編程對象細(xì)胞的細(xì)胞核內(nèi)。

本發(fā)明的一些實(shí)施方式中列舉了采用殼聚糖或殼聚糖衍生物作為轉(zhuǎn)導(dǎo)載體，但是并不限于此。所述轉(zhuǎn)導(dǎo)載體可以是本領(lǐng)域任意能夠?qū)⒅鼐幊桃蜃佑行мD(zhuǎn)導(dǎo)至起始重編程對象細(xì)胞內(nèi)(優(yōu)選轉(zhuǎn)導(dǎo)至細(xì)胞核內(nèi))的轉(zhuǎn)導(dǎo)載體。一般情況下，所述轉(zhuǎn)導(dǎo)載體的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率在90％以上即可。

本發(fā)明的第二方面，提供一種用于制備心臟祖細(xì)胞的重編程因子，所述重編程因子選自Gata4、Tbx5、Nkx2.5、AF9、Hand2、Mef2C、Mesp1、Baf60c、UTX中任一種或多種的組合。

優(yōu)選地，所述重編程因子為下之任一：(1)重編程因子GMT由Gata4、Mef2C、Tbx5組成；(2)重編程因子GMTB由Gata4、Mef2C、Tbx5、Baf60c組成；(3)重編程因子GHMT由Gata4、Hand2、Mef2C、Tbx5組成；(4)重編程因子GNT由Gata4、Nkx2.5、Tbx5組成；(5)重編程因子GNTB由Gata4、Nkx2.5、Tbx5、Baf60c組成；(6)重編程因子GNMT由Gata4、Nkx2.5、Mef2C、Tbx5組成；(7)重編程因子GM1T由Gata4、Mef2C、Mesp1、Tbx5組成；(8)重編程因子GNM1T由Gata4、Nkx2.5、Mef2C、Mesp1、Tbx5組成；(9)重編程因子GMM1T由Gata4、Mef2C、Mef2C、Mesp1、Tbx5組成；(10)重編程因子GTB由Gata4、Tbx5、Baf60c組成；(11)重編程因子GM1TB由Gata4、Mef2C、Mesp1、Tbx5、Baf60c組成；(12)重編程因子GNTA由Gata4、Nkx2.5、Tbx5、AF9組成；(13)重編程因子GNTU由Gata4、Tbx5、Nkx2.5、UTX組成；(14)重編程因子GNTAU由Gata4、Nkx2.5、Tbx5、AF9、UTX組成。

本發(fā)明的第三方面，提供一種用于制備心臟祖細(xì)胞的藥物組合物，包括上述重編程因子以及轉(zhuǎn)導(dǎo)載體，所述轉(zhuǎn)導(dǎo)載體將重編程因子轉(zhuǎn)導(dǎo)至起始重編程對象細(xì)胞內(nèi)。

優(yōu)選地，所述轉(zhuǎn)導(dǎo)載體將重編程因子轉(zhuǎn)導(dǎo)至起始重編程對象細(xì)胞的細(xì)胞核內(nèi)。

本發(fā)明的一些實(shí)施方式中列舉了采用殼聚糖或殼聚糖衍生物作為轉(zhuǎn)導(dǎo)載體，但是并不限于此。所述轉(zhuǎn)導(dǎo)載體可以是本領(lǐng)域任意能夠?qū)⒅鼐幊桃蜃佑行мD(zhuǎn)導(dǎo)至起始重編程對象細(xì)胞內(nèi)(優(yōu)選轉(zhuǎn)導(dǎo)至細(xì)胞核內(nèi))的轉(zhuǎn)導(dǎo)載體。一般情況下，所述轉(zhuǎn)導(dǎo)載體的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率在90％以上即可。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下有益效果：

采用本發(fā)明的方法制備心臟祖細(xì)胞，在8～10天左右即可成功獲得心臟祖細(xì)胞，且獲得的心臟祖細(xì)胞均是isl+/Tbx5+雙陽性細(xì)胞，陽性率高且免疫原性低。

附圖說明

圖1：重編程因子Nkx2.5修飾前后轉(zhuǎn)導(dǎo)12h后，人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的免疫熒光圖形，顯示Nkx2.5核定位轉(zhuǎn)導(dǎo)效率，其中，第一行unmodified為未修飾組，第二行modified為轉(zhuǎn)導(dǎo)載體修飾組，熒光顏色如下：DAPI(藍(lán)色)、Nkx2.5(綠色)，兩種顏色混合見于“Merge(合并)”圖中。

圖2是BM-MSCs運(yùn)用不同重編程因子重編程,qPCR分析d8心臟祖細(xì)胞基因mRNA表達(dá)水平。

圖3：BM-MSCs向piCPCs重編程過程中“玫瑰花環(huán)”集落形成圖。

圖4：BM-MSCs經(jīng)GNTA重編程后d8心臟祖細(xì)胞基因mRNA水平。

圖5：是piCPCs免疫熒光圖像。

圖6是piCPCs流式分析結(jié)果。

圖7是piCPCs心臟譜系分化潛能鑒定圖。

圖8是UC-MSCs運(yùn)用不同重編程因子重編程,qPCR分析d8心臟祖細(xì)胞基因mRNA表達(dá)水平。

圖9是UC-MSCs經(jīng)重編程因子GMM1T誘導(dǎo)后的免疫熒光圖像。

具體實(shí)施方式

在進(jìn)一步描述本發(fā)明具體實(shí)施方式之前，應(yīng)理解，本發(fā)明的保護(hù)范圍不局限于下述特定的具體實(shí)施方案；還應(yīng)當(dāng)理解，本發(fā)明實(shí)施例中使用的術(shù)語是為了描述特定的具體實(shí)施方案，而不是為了限制本發(fā)明的保護(hù)范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的試驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件，或者按照各制造商所建議的條件。

當(dāng)實(shí)施例給出數(shù)值范圍時，應(yīng)理解，除非本發(fā)明另有說明，每個數(shù)值范圍的兩個端點(diǎn)以及兩個端點(diǎn)之間任何一個數(shù)值均可選用。除非另外定義，本發(fā)明中使用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語與本技術(shù)領(lǐng)域技術(shù)人員通常理解的意義相同。除實(shí)施例中使用的具體方法、設(shè)備、材料外，根據(jù)本技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員對現(xiàn)有技術(shù)的掌握及本發(fā)明的記載，還可以使用與本發(fā)明實(shí)施例中所述的方法、設(shè)備、材料相似或等同的現(xiàn)有技術(shù)的任何方法、設(shè)備和材料來實(shí)現(xiàn)本發(fā)明。

除非另外說明，本發(fā)明中所公開的實(shí)驗(yàn)方法、檢測方法、制備方法均采用本技術(shù)領(lǐng)域常規(guī)的分子生物學(xué)、生物化學(xué)、染色質(zhì)結(jié)構(gòu)和分析、分析化學(xué)、細(xì)胞培養(yǎng)、重組DNA技術(shù)及相關(guān)領(lǐng)域的常規(guī)技術(shù)。這些技術(shù)在現(xiàn)有文獻(xiàn)中已有完善說明，具體可參見Sambrook等MOLECULAR CLONING：A LABORATORY MANUAL，Second edition，Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989and Third edition，2001；Ausubel等，CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY，John Wiley&Sons，New York，1987and periodic updates；the series METHODS IN ENZYMOLOGY，Academic Press，San Diego；Wolffe，CHROMATIN STRUCTURE AND FUNCTION，Third edition，Academic Press，San Diego，1998；METHODS IN ENZYMOLOGY，Vol.304，Chromatin(P.M.Wassarman and A.P.Wolffe，eds.)，Academic Press，San Diego，1999；和METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY，Vol.119，Chromatin Protocols(P.B.Becker，ed.)Humana Press，Totowa，1999等。

實(shí)施例1本發(fā)明所需溶液的制備

(1)Ni柱洗滌緩沖液：20mM Tris-HCl，0.15M NaCl，20mM咪唑，pH8.0；

(2)Ni柱洗脫緩沖液：20mM Tris-HCl，0.15M NaCl，200mM咪唑，pH8.0；

(3)重組蛋白質(zhì)溶解緩沖液：50mM Tris，150mM NaCl，10％甘油(v/v)，pH8.0；

(4)間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)基：45ml MSC基礎(chǔ)培養(yǎng)基(Cyagen)，5ml FBS，添加終濃度為0.1mM非必需氨基酸，2mM L-谷氨酰胺，50nMβ-巰基乙醇；可用于人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞或人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的培養(yǎng)；

(5)心臟祖細(xì)胞重編程培養(yǎng)基(CRM培養(yǎng)基)：在5％(v/v)胎牛血清的人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)基基礎(chǔ)上，主要添加有終濃度為10ng/ml bFGF、3ng/ml Activin A、6nM Chir99021、0.5％(g/L)BSA；

(6)心臟祖細(xì)胞維持培養(yǎng)基(CMM培養(yǎng)基)：在DMEM基礎(chǔ)培養(yǎng)基中(Invitrogen)，主要添加10％(v/v)胎牛血清的KSR血清(HyClone)、終濃度為0.1mM非必需氨基酸、2mM L-谷氨酰胺、50nMβ-巰基乙醇、5ng/ml bFGF、3nM Chir99021、ITS(Insulin-Transferin-Serium,Invitrogen)、5ng/ml VEGF等；

(7)含2％(w/v)BSA的PBST：稱量1g BSA粉末，用PBS溶解并定容至50ml，再添加100ul 100％的吐溫20，即含有0.2％(v/v)的吐溫20；

(8)心肌細(xì)胞分化培養(yǎng)基：在DMEM基礎(chǔ)培養(yǎng)基中(Invitrogen)，主要添加10％(v/v)胎牛血清KSR血清(Hyclone)，5nM IWR-1,5ng/ml bFGF等。

(9)內(nèi)皮細(xì)胞分化培養(yǎng)基：在2％(v/v)胎牛血清EGM-2培養(yǎng)基中(Lonza)，主要添加10ng/ml EGF。

(10)血管平滑肌細(xì)胞分化培養(yǎng)基：在10％(v/v)胎牛血清DMEM基礎(chǔ)培養(yǎng)基中(Invitrogen)，主要添加10ng/ml VEGF、3ng/mlTGFβ1。

實(shí)施例2各重編程因子的原核表達(dá)

本實(shí)施例的主要目的在于獲得以下各個重編程因子：Gata4、Tbx5、Nkx2.5、AF9、Hand2、Mef2C、Mesp1、Baf60c、UTX。

各重編程因子的原核表達(dá)方法包括步驟：

(1)將各重編程因子的編碼基因序列插入到表達(dá)載體pSmart-I(天地人和公司，中國)中，獲得重組表達(dá)載體；

具體地，Gata4的編碼基因的核苷酸序列同NCBI的Gene ID 2626所示；

Tbx5的編碼基因的核苷酸序列同NCBI的Gene ID 6910所示；

Nkx2.5的編碼基因的核苷酸序列同NCBI的Gene ID 1482所示；

AF9的編碼基因的核苷酸序列同NCBI的Gene ID 4300所示；

Hand2的編碼基因的核苷酸序列同NCBI的Gene ID 9464所示；

Mef2C的編碼基因的核苷酸序列同NCBI的Gene ID 4208所示；

Mesp1的編碼基因的核苷酸序列同NCBI的Gene ID 55897所示；

Baf60c的編碼基因的核苷酸序列同NCBI的Gene ID 6604所示；

UTX的編碼基因的核苷酸序列同NCBI的Gene ID 7403所示；

(2)將步驟(1)所獲得的重組載體分別轉(zhuǎn)化到DH5α克隆菌和BL21(DE3)表達(dá)菌中，利用IPTG誘導(dǎo)表達(dá)目的蛋白。然后通過Akta蛋白純化儀Ni柱親和純化層析、咪唑洗脫，經(jīng)鑒定各目的蛋白的大小與預(yù)期相符，且各目的蛋白的純度均在95％以上。

將洗脫下來的目的蛋白經(jīng)N/C末端序列分析，結(jié)果表明所表達(dá)的重組蛋白樣品均讀框無誤，與理論N/C末端氨基酸序列一致。

具體地，所得Gata4的氨基酸序列同在NCBI的ID:NP_001295022.1所示；

Tbx5的氨基酸序列同在NCBI的ID:NP_852259.1所示；

Nkx2.5的氨基酸序列同在NCBI的ID:NP_004378.1所示；

AF9的氨基酸序列同NCBI的ID:NP_001180279.1所示；

Hand2的氨基酸序列同NCBI的ID:NP_068808.1所示；

Mef2C的氨基酸序列同NCBI的ID:NP_001180279.1所示；

Mesp1的氨基酸序列同NCBI的ID:NP_061140.1所示；

Baf60c的氨基酸序列同在NCBI的ID:NP_001003802.1所示；

UTX的氨基酸序列同NCBI的ID:NP_001278344.1.所示；

將洗脫下來的目的蛋白加入透析袋透析，真空冷凍干燥，分別獲得各重編程因子的凍干粉末。

實(shí)施例3各重編程因子的轉(zhuǎn)導(dǎo)及轉(zhuǎn)導(dǎo)效率監(jiān)測

本實(shí)施例的主要目的在于將實(shí)施例2獲得的各重編程因子轉(zhuǎn)導(dǎo)至靶細(xì)胞(起始重編程對象)內(nèi)。

本實(shí)施例中例舉使用低分子殼聚糖及各低分子殼聚糖衍生物組合作為轉(zhuǎn)導(dǎo)載體，具體地，所述低分子殼聚糖為分子量為5000的殼聚糖，所述低分子殼聚糖衍生物為N-羧基丁基殼聚糖，前者與后者的質(zhì)量比為1:1。使用時，可將所述轉(zhuǎn)導(dǎo)載體配置成pH7.4的轉(zhuǎn)導(dǎo)載體水溶液。

將實(shí)施例2獲得的各重編程因子的凍干粉末溶解于緩沖液(50mM Tris，150mM NaCl，10％v/v甘油，PH8.0)中，獲得各重編程因子緩沖液。

使用時，將各重編程因子緩沖液分別與轉(zhuǎn)導(dǎo)載體水溶液混合，超聲分散，在冷室中混合過夜，使得各重編程因子分別與轉(zhuǎn)導(dǎo)載體以合理的摩爾比例混合，獲得穩(wěn)定的重組編程因子-轉(zhuǎn)導(dǎo)載體復(fù)合物。

先以重編程因子Nkx2.5為例，重編程因子Nkx2.5與所述轉(zhuǎn)導(dǎo)載體1:1的摩爾比例混合，超聲共振5s，4℃翻轉(zhuǎn)混勻過夜，獲得Nkx2.5-轉(zhuǎn)導(dǎo)載體復(fù)合物。

將未與轉(zhuǎn)導(dǎo)載體復(fù)合的Nkx2.5緩沖液作為未修飾的未修飾的Nkx2.5蛋白質(zhì)溶液，將Nkx2.5-轉(zhuǎn)導(dǎo)載體復(fù)合物作為修飾的Nkx2.5蛋白質(zhì)溶液。然后將未修飾的Nkx2.5蛋白質(zhì)溶液、修飾的Nkx2.5蛋白質(zhì)溶液分別與是實(shí)例1中的人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)基(Cyagen)混合，使得Nkx2.5的終濃度為0.2μg/ml。以未修飾組為對照，分別與人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞孵育12小時。12小時后，洗凈培養(yǎng)基，利用anti-nkx2.5抗體(abcam)進(jìn)行的免疫熒光觀察細(xì)胞核內(nèi)熒光信號。結(jié)果如圖1所示，所述轉(zhuǎn)導(dǎo)載體對Nkx2.5的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率約為96％。同樣地，經(jīng)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，所述轉(zhuǎn)導(dǎo)載體對重編程因子Gata4、Tbx5、AF9、Hand2、Mef2C、Mesp1、Baf60c、UTX的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率也分別均在96％以上。

實(shí)施例4心臟祖細(xì)胞的制備程序

本實(shí)施例的目的在于以成體干細(xì)胞作為起始重編程對象，采用重編程因子(Gata4、Tbx5、Nkx2.5、AF9、Hand2、Mef2C、Mesp1、Baf60c、UTX中任一種或多種的組合)對成體干細(xì)胞進(jìn)行重編程，獲得心臟祖細(xì)胞。首先，將成體干細(xì)胞傳代至6孔板，每孔約8～10×10⁴個細(xì)胞。

(一)以人類骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞為起始重編程對象為例，采用不同重編程因子GMT/GMTB/GHMT/GNT/GNTB/GNMT/GM1T/GBM1T/GMM1T/GTB/GM1TB/GNTA/GNTU/GNTAU進(jìn)行重編程，制備心臟祖細(xì)胞

重編程因子GMT由Gata4、Mef2C、Tbx5組成。

重編程因子GMTB由Gata4、Mef2C、Tbx5、Baf60c組成。

重編程因子GHMT由Gata4、Hand2、Mef2C、Tbx5組成。

重編程因子GNT由Gata4、Nkx2.5、Tbx5組成。

重編程因子GNTB由Gata4、Nkx2.5、Tbx5、Baf60c組成。

重編程因子GNMT由Gata4、Nkx2.5、Mef2C、Tbx5組成。

重編程因子GM1T由Gata4、Mef2C、Mesp1、Tbx5組成。

重編程因子GNM1T由Gata4、Nkx2.5、Mef2C、Mesp1、Tbx5組成。

重編程因子GMM1T由Gata4、Mef2C、Mef2C、Mesp1、Tbx5組成。

重編程因子GTB由Gata4、Tbx5、Baf60c組成。

重編程因子GM1TB由Gata4、Mef2C、Mesp1、Tbx5、Baf60c組成。

重編程因子GNTA由Gata4、Nkx2.5、Tbx5、AF9組成。

重編程因子GNTU由Gata4、Tbx5、Nkx2.5、UTX組成。

重編程因子GNTAU由Gata4、Nkx2.5、Tbx5、AF9、UTX組成。

重編程全程大致分為3個階段：

(1)第一階段為預(yù)重編程階段：將上述不同重編程因子

GMT/GMTB/GHMT/GNT/GNTB/GNMT/GM1T/GNM1T/GMM1T/GTB/GM1TB/GNTA/GNTU/GNTAU分別與實(shí)施例3中的轉(zhuǎn)導(dǎo)載體混合，分別獲得

GMT/GMTB/GHMT/GNT/GNTB/GNMT/GM1T/GBM1T/GMM1T/GTB/GM1TB/GNTA/GNTU/GNTAU-轉(zhuǎn)導(dǎo)載體復(fù)合物，然后將所述復(fù)合物分別與實(shí)施例1中的間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)基(Cyagen)混合，混合后Gata4的終濃度是0.2～0.4μg/ml，Tbx5的終濃度是0.2～0.4μg/ml，Nkx2.5的終濃度是0.1～0.2μg/ml，Hand2的終濃度是0.1～0.2μg/ml，Mef2C的終濃度是0.2～0.4μg/ml，Mesp1的終濃度是0.3～0.6μg/m，Baf60c的終濃度是0.4～0.8μg/ml，UTX的終濃度是0.5～1.0μg/ml，AF9的終濃度是0.5～1.0μg/ml；將人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞與含有重編程因子的培養(yǎng)基孵育12小時后，更換到常規(guī)不含有重編程因子的培養(yǎng)基培養(yǎng)，隔天后，再次更換為含有重編程因子的培養(yǎng)基培養(yǎng)，大約2～3個到循環(huán)后，細(xì)胞逐漸聚集，然后進(jìn)去第二階段；

(2)第二階段為重編程階段：

分別將

GMT/GMTB/GHMT/GNT/GNTB/GNMT/GM1T/GNM1T/GMM1T/GTB/GM1TB/GNTA/GNTU/GNTAU-轉(zhuǎn)導(dǎo)載體復(fù)合物與實(shí)施例1中的心臟祖細(xì)胞重編程培養(yǎng)基混合，使得各重編程因子的終濃度較之于第一階段減半，獲得含有重編程因子的心臟祖細(xì)胞重編程培養(yǎng)基，每個循環(huán)包括將聚集后的細(xì)胞(重編程對象)與所述含有重編程因子的心臟祖細(xì)胞重編程培養(yǎng)基孵育24小時后更換為不含編程因子的心臟祖細(xì)胞重編程培養(yǎng)基培養(yǎng)24小時，如此2～3循環(huán)后，即整個重編程的第8～10天，觀察到編程對象的形態(tài)學(xué)發(fā)生明顯的變化，有“玫瑰花環(huán)樣”集落出現(xiàn)；

(3)第三階段：為維持階段，在鋪有Matrigel的培養(yǎng)皿下，使用實(shí)施例1中的心臟祖細(xì)胞維持培養(yǎng)基維持、擴(kuò)增心臟祖細(xì)胞。

通過接下來研究獲得的心臟祖細(xì)胞的特征：重編程細(xì)胞熒光定量qPCR分析，蛋白重編第8天，根據(jù)制造商的說明書，使用細(xì)胞總RNA提取試劑盒(TianGen)，從起始重編程對象人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞BM-MSCs和重編程后獲得的心臟祖細(xì)胞piCPCs中分別分離總RNA。使用cDNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(Takara)，將250ng RNA逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。使用SYBR Mix(Takara)進(jìn)行PCR反應(yīng)，使用管家基因β-tubllin作為內(nèi)參標(biāo)準(zhǔn)化。如圖2所示結(jié)果，顯示了BM-MSCs經(jīng)誘導(dǎo)后心臟祖細(xì)胞標(biāo)志物基因Isl1、Flk1、Nkx2.5、Gata4mRNA表達(dá)水平(n＝3)。說明運(yùn)用上述不同重編程因子對人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞進(jìn)行重編程，均能夠成功獲得心臟祖細(xì)胞，然而不同組合的重編程效率有差異，其中GHMT組合獲得的ISL1或GATA4陽性的細(xì)胞數(shù)最多，而GNT組合獲得的Nkx2.5陽性細(xì)胞數(shù)最多。

表1.用于人心臟祖細(xì)胞研究的引物

細(xì)胞免疫熒光測定：將piCPCs和BM-MSCs分別種植到鋪有Matrigel的8孔培養(yǎng)室中，用4％多聚甲醛固定，隨后用PBS清洗3次。用0.2％triton X-100通透15min，接著用具有2％BSA的PBST封閉2小時。然后將細(xì)胞與一抗在4℃孵育過夜：ISL1(abcam,鼠單抗，1:300)、Nkx2.5(CST,鼠單抗，1:100)、Gata4(abcam，兔單抗，1:500)、Tbx5(abcam，兔多抗，1:500)。在1％BSA/PBS中洗滌3～5次，共15～25min。使用熒光二抗(在2％BSA/PBS中1:500)室溫孵育2h：Alexa Fluro 488驢抗鼠IgG(Invitrogen)、Alexa Fluro 555羊抗兔IgG(Invitrogen)。使用含有DAPI的Vector作為封片劑。封片后，使用尼康熒光顯微鏡拍照獲得熒光圖像。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，運(yùn)用上述不同重編程因子對人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞進(jìn)行重編程獲得的心臟祖細(xì)胞均能夠強(qiáng)表達(dá)心臟中胚層祖細(xì)胞標(biāo)志物蛋白Isl1、Gata4、Tbx5、Nkx2.5。

接下來分析流式細(xì)胞術(shù)分析重編程效率：用胰酶將匯合形成的piCPCs集落消化成單個細(xì)胞，用PBS清洗并將細(xì)胞分成每份5×10⁶個細(xì)胞。隨后用破膜液(eBioscience)將細(xì)胞膜、核膜破裂,用IC buffer(eBioscience)清洗干凈。用100ul PBS重懸細(xì)胞，加入10ul血清封閉5min。隨后按照說明書比例孵育ISL1(abcam,鼠單抗，1:200)和Tbx5(abcam，兔多抗，1:200)室溫孵育20min,然后用PBS洗滌，1000rpm離心5min，棄去上清。然后，加入anti-mouse-FITC(1:500)、anti-rabbit-PE(1:500)流式二抗室溫孵育15min。用PBS洗滌2遍，1000rpm離心5min，棄去上清，加入200ul PBS重懸并通過BD流式細(xì)胞儀進(jìn)行測定。

結(jié)果發(fā)現(xiàn)，運(yùn)用上述不同重編程因子對人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞進(jìn)行重編程獲得的心臟祖細(xì)胞心臟相關(guān)基因熒光強(qiáng)度具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，其中GHMT組合ISL1或GATA4熒光強(qiáng)度最強(qiáng)，而GNT組合Nkx2.5熒光強(qiáng)度最強(qiáng)。每個組合的isl+/Tbx5+雙陽性細(xì)胞比例代表了其重編程效率，分別是GMT(45％)，GMTB(40％)，GHMT(80％)，GNT(27％)，GNTB(28％)，GNMT(69％)，GM1T(52％)，GNM1T(33％)，GMM1T(45％)，GTB(21％)，GM1TB(69％)，GNTA(87％)，GNTU(41％)和GNTAU(18％)。

此外，還發(fā)現(xiàn)：piCPCs體外向心臟三個譜系分化：將運(yùn)用上述不同重編程因子對人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞進(jìn)行重編程獲得的心血管祖細(xì)胞分別使用實(shí)施例1中的心肌細(xì)胞特定分化培養(yǎng)基、內(nèi)皮細(xì)胞分化培養(yǎng)基、血管平滑肌分化培養(yǎng)基分化。隔天換夜。待觀察到出現(xiàn)三角狀或棍棒狀的心肌細(xì)胞、鋪路石樣內(nèi)皮細(xì)胞以及平滑肌樣細(xì)胞形態(tài)，通過免疫熒光和流式細(xì)胞鑒定分析，表明所得piCPCs均具有向心肌細(xì)胞、血管平滑肌細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞分化的潛能。

此外，對于重編程因子GNTA，在編程的第一階段，GNTA-轉(zhuǎn)導(dǎo)載體復(fù)合物與實(shí)施例1中的10％人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)基(Cyagen)混合后，還采用如下終濃度：Gata4的終濃度為0.4μg/ml，Tbx5的終濃度是0.4μg/ml，Nkx2.5的終濃度是0.2μg/ml，AF9的終濃度是1μg/ml；將人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞與含有重編程因子的培養(yǎng)基孵育12小時后，更換到常規(guī)不含有重編程因子的培養(yǎng)基培養(yǎng)，隔天后，再次更換為含有重編程因子的培養(yǎng)基培養(yǎng)，大約2～3個到循環(huán)后，細(xì)胞逐漸聚集，然后進(jìn)去第二階段；第二階段為重編程階段：將GNTA-轉(zhuǎn)導(dǎo)載體復(fù)合物與實(shí)施例1中的心臟祖細(xì)胞重編程培養(yǎng)基混合，使得Gata4、Tbx5、Nkx2.5、AF9的終濃度較之于第一階段減半；每獲得含有重編程因子的心臟祖細(xì)胞重編程培養(yǎng)基，每個循環(huán)包括將聚集后的細(xì)胞(重編程對象)與所述含有重編程因子的心臟祖細(xì)胞重編程培養(yǎng)基孵育24小時后更換為不含編程因子的心臟祖細(xì)胞重編程培養(yǎng)基培養(yǎng)24小時，如此2～3循環(huán)后，即整個重編程的第8～10天，觀察到形態(tài)學(xué)發(fā)生明顯的變化，有“玫瑰花環(huán)樣”集落出現(xiàn)(如圖3所示)；第三階段為維持階段，在鋪有Matrigel的培養(yǎng)皿下，使用實(shí)施例1中的心臟祖細(xì)胞維持培養(yǎng)基維持、擴(kuò)增心臟祖細(xì)胞。

接下來按照前述方法研究獲得的心臟祖細(xì)胞的特征，如圖4的結(jié)果顯示了起始重編程對象人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞經(jīng)重編程因子GNTA重編程誘導(dǎo)后心臟祖細(xì)胞標(biāo)志物基因Isl1、Gata4、Tbx5、Nkx2.5、MYH6mRNA表達(dá)情況(n＝3)，與圖2中所示結(jié)果一致。說明，重組編程因子Gata4的終濃度是0.2～0.4μg/ml、Tbx5的終濃度是0.2～0.4μg/ml、Nkx2.5的終濃度是0.1～0.2μg/ml、AF9的終濃度是0.5～1μg/ml時，均能夠成功重編程獲得心臟祖細(xì)胞。

接下來按照前述方法進(jìn)行細(xì)胞免疫熒光測定：圖5可見了重編程后的piCPCs表達(dá)心臟中胚層祖細(xì)胞標(biāo)志物蛋白Isl1、Gata4、Tbx5、Nkx2.5強(qiáng)表達(dá)。

接下來按照前述分析流式細(xì)胞術(shù)分析重編程效率：圖6顯示了本方法獲得的心臟祖細(xì)胞是isl+/Tbx5+雙陽性細(xì)胞，陽性率為87％左右。

此外，還發(fā)現(xiàn)：piCPCs體外向心臟三個譜系分化：將誘導(dǎo)獲得的心血管祖細(xì)胞分別使用實(shí)施例1中的心肌細(xì)胞特定分化培養(yǎng)基、內(nèi)皮細(xì)胞分化培養(yǎng)基、血管平滑肌分化培養(yǎng)基分化。隔天換夜。待觀察到出現(xiàn)三角狀或棍棒狀的心肌細(xì)胞、鋪路石樣內(nèi)皮細(xì)胞以及平滑肌樣細(xì)胞形態(tài)，通過免疫熒光和流式細(xì)胞鑒定分析，圖7顯示了piCPCs能有效地表達(dá)心臟收縮蛋白(MHC和肌鈣蛋白I)、血管平滑肌細(xì)胞收縮蛋白SMMHC、以及CD31，表明piCPCs具有向心肌細(xì)胞、血管平滑肌細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞分化的潛能。

綜上所述，在對人間充質(zhì)骨髓干細(xì)胞進(jìn)行編程時，重組編程因子Gata4的終濃度是0.2～0.4μg/ml、Tbx5的終濃度是0.2～0.4μg/ml、Nkx2.5的終濃度是0.1～0.2μg/ml、AF9的終濃度是0.5～1μg/ml時，均能夠使獲得的心臟祖細(xì)胞是isl+/Tbx5+雙陽性細(xì)胞，陽性率為87％左右；且所獲得的心臟祖細(xì)胞具有向心肌細(xì)胞、血管平滑肌細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞分化的潛能。

(二)以人類臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞UC-MSCs為起始重編程對象為例，采用不同重編程因子GMT/GMTB/GHMT/GNT/GNTB/GNMT/GM1T/GNM1T/GMM1T/GTB/GM1TB/GNTA/GNTU/GNTAU進(jìn)行重編程，制備心臟祖細(xì)胞

參照(一)中所述重編程方法，按照BM-MSCs誘導(dǎo)piCPCs的方案，采用與其相同的重編程因子，對人類臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞進(jìn)行重編程，待觀察到UC-MSCs聚集形成piCPCs克隆團(tuán)，經(jīng)誘導(dǎo)8天后根據(jù)試制造商說明書通過反轉(zhuǎn)錄和熒光定量qPCR測定，圖8顯示了UC-MSCs經(jīng)不同重編程因子重編程后心臟祖細(xì)胞標(biāo)志物基因Isl1、Flk1、Nkx2.5、Gata4轉(zhuǎn)錄水平。說明采用不同重編程因子

GMT/GMTB/GHMT/GNT/GNTB/GNMT/GM1T/GNM1T/GMM1T/GTB/GM1TB/GNTA/GNTU/GNTAU對UC-MSCs進(jìn)行重編程，均能夠誘導(dǎo)獲得心臟祖細(xì)胞。然而不同組合的重編程效率有差異，其中GMM1T組合獲得的ISL陽性的細(xì)胞數(shù)最多，GNT組合獲得的Nkx2.5陽性細(xì)胞數(shù)最多,而GHMT組合獲得陽性的細(xì)胞數(shù)最多。每個組合的isl+/Tbx5+雙陽性細(xì)胞比例代表了其重編程效率，分別是GMT(14％)，GMTB(26％)，GHMT(27％)，GNT(15％)，GNTB(29％)，GNMT(57％)，GM1T(17％)，GNM1T(38％)，GMM1T(85％)，GTB(41％)，GM1TB(73％)，GNTA(34％)，GNTU(29％)和GNTAU(30％)。

先以GMM1T誘導(dǎo)UC-MSCs為示例，待UC-MSCs形成piCPCs后，用免疫熒光測定，具體染色如下：Flk1(CST,兔單抗，1:500)ISL1(abcam,鼠單抗，1:300)、Nkx2.5(abcam,兔單抗，1:200)、MHC(abcam,鼠單抗，1:300)、SMMHC(abcam,兔單抗，1:500)、CD31(abcam,鼠單抗，1:400)為一抗，以Alexa Fluro 488驢抗兔IgG(Invitrogen)、Alexa Fluro 555羊抗鼠IgG(Invitrogen)為熒光二抗，用Hoechst3342(1:2000)染細(xì)胞核，圖9顯示GMM1T有效地將UC-MSCs轉(zhuǎn)變?yōu)榫哂袠?biāo)志物Flk1、Isl1、Nkx2.5的心臟祖細(xì)胞，而且分化后心臟譜系細(xì)胞基因MHC、SMMHC、CD31強(qiáng)表達(dá)。采用同樣的實(shí)驗(yàn)方法，發(fā)現(xiàn)其他的13組編程因子也能夠有效地將UC-MSCs轉(zhuǎn)變?yōu)榫哂袠?biāo)志物Flk1、Isl1、Nkx2.5的心臟祖細(xì)胞，而且分化后心臟譜系細(xì)胞基因MHC、SMMHC、CD31強(qiáng)表達(dá)。

以上所述，僅為本發(fā)明的較佳實(shí)施例，并非對本發(fā)明任何形式上和實(shí)質(zhì)上的限制，應(yīng)當(dāng)指出，對于本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員，在不脫離本發(fā)明方法的前提下，還將可以做出若干改進(jìn)和補(bǔ)充，這些改進(jìn)和補(bǔ)充也應(yīng)視為本發(fā)明的保護(hù)范圍。凡熟悉本專業(yè)的技術(shù)人員，在不脫離本發(fā)明的精神和范圍的情況下，當(dāng)可利用以上所揭示的技術(shù)內(nèi)容而做出的些許更動、修飾與演變的等同變化，均為本發(fā)明的等效實(shí)施例；同時，凡依據(jù)本發(fā)明的實(shí)質(zhì)技術(shù)對上述實(shí)施例所作的任何等同變化的更動、修飾與演變，均仍屬于本發(fā)明的技術(shù)方案的范圍內(nèi)。

SEQUENCE LISTING

<110> 余, 細(xì)勇

李, 曉紅

吳, 岳恒

楊, 翔宇

<120> 一種制備心臟祖細(xì)胞的方法

<130> 171002

<160> 9

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Islet-1 Forward primer

<400> 1

ggatttggaa tggcatgcgg 20

<210> 2

<211> 22

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Islet-1 Reverse primer

<400> 2

catttgatcc cgtacaacct ga 22

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Nkx2.5 Forward primer

<400> 3

caagtgtgcg tctgcctttc 20

<210> 4

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Nkx2.5 Reverse primer

<400> 4

cgcacagctc tttcttttcg g 21

<210> 5

<211> 23

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Gata4 Forward primer

<400> 5

cgacacccca atctcgatat gtt 23

<210> 6

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Tbx5 Forward primer

<400> 6

aaagtcttca cctgagccct g 21

<210> 7

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Tbx5 Reverse primer

<400> 7

gcaaggttct gctctccaac t 21

<210> 8

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> MYH6 Forward primer

<400> 8

cggcccagat tcttcaggat t 21

<210> 9

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> MYH6 Reverse primer

<400> 9

acgctccttc tctgacttgc 20