本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體地說，涉及茶樹咖啡堿合成酶基因啟動子TCSP及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

咖啡堿(1,3,7-三甲基黃嘌呤)是一種含氮化合物，茶樹中的生物堿以嘌呤堿為主體，而咖啡堿又是構(gòu)成嘌呤堿的主體，因此咖啡堿在茶樹次生代謝中起到舉足輕重的作用?？Х葔A不僅在植物體內(nèi)能夠保護(hù)植物免受自然環(huán)境的傷害，促進(jìn)植物的生長，同時也是一種普遍，有一定藥用價值的物質(zhì)。適量的攝入咖啡堿可以健胃消食、利尿、降低高血壓、提高記憶力、抗癌、降低II型糖尿病風(fēng)險等；但過量的攝入會引起失眠、焦慮、骨質(zhì)疏松和胎兒畸形等。因此，如何調(diào)控茶樹中咖啡堿的合成對于茶樹資源的高效利用有著重大意義。

啟動子是RNA聚合酶特異性識別和結(jié)合的DNA序列，是基因的一個組成部分，控制基因表達(dá)(轉(zhuǎn)錄)的起始時間和表達(dá)的程度。啟動子就像“開關(guān)”，絕大多數(shù)基因在調(diào)控表達(dá)上與其調(diào)控元件相關(guān)，而且呈現(xiàn)出空間性和時間性的特點。目前，植物基因工程研究的主要內(nèi)容是基因的表達(dá)和調(diào)控，但外源基因表達(dá)量不足是不能理想獲得轉(zhuǎn)基因植物的重要原因。啟動子在決定基因表達(dá)方面起著關(guān)鍵作用，因此研究植物啟動子是增強(qiáng)外源基因表達(dá)的首要問題。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供茶樹咖啡堿合成酶基因啟動子TCSP及其應(yīng)用。

為了實現(xiàn)本發(fā)明目的，本發(fā)明根據(jù)GenBank中收錄的茶樹咖啡堿合成酶基因序列(AB031280.1)，設(shè)計引物，采用Genome Walking方法克隆出茶樹咖啡堿合成酶基因啟動子序列，擴(kuò)增片段長度為1357bp，并命名為TCSP。本發(fā)明的茶樹咖啡堿合成酶基因啟動子TCSP，其核苷酸序列為：

i)SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列；或

ii)SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列經(jīng)取代、缺失和/或增加一個或多個核苷酸且具有相同功能的核苷酸序列；或

iii)在嚴(yán)格條件下與SEQ ID NO:1所示序列雜交且具有相同功能的核苷酸序列，所述嚴(yán)格條件為在含0.1％SDS的0.1×SSPE或含0.1％SDS的0.1×SSC溶液中，在65℃下雜交，并用該溶液洗膜；或

iv)與i)、ii)或iii)的核苷酸序列具有90％以上同源性且具有相同功能的核苷酸序列。

利用PlantCARE啟動子在線分析其功能元件，分析結(jié)果見表1。

表1茶樹咖啡堿合成酶基因啟動子順式作用元件的生物功能學(xué)分析

本發(fā)明還提供含有茶樹咖啡堿合成酶基因啟動子TCSP的表達(dá)盒。

本發(fā)明還提供含有茶樹咖啡堿合成酶基因啟動子TCSP的載體。

本發(fā)明還提供含有上述表達(dá)盒或載體的工程菌、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系。

本發(fā)明還提供茶樹咖啡堿合成酶基因啟動子TCSP在調(diào)控下游基因表達(dá)中的應(yīng)用。

其中，所述下游基因包括GUS等。

本發(fā)明還提供茶樹咖啡堿合成酶基因啟動子TCSP在制備轉(zhuǎn)基因植物中的應(yīng)用。

其中，所述植物為雙子葉植物或單子葉植物。優(yōu)選地，所述植物包括煙草等。

前述應(yīng)用是利用Gateway技術(shù)將啟動子TCSP依次構(gòu)建到入門載體和目的載體上，然后通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化法制備轉(zhuǎn)基因植物。

優(yōu)選地，所述入門載體和目的載體分別為pDONR221和pKGWFS7。

本發(fā)明進(jìn)一步提供用于擴(kuò)增茶樹咖啡堿合成酶基因啟動子TCSP的特異性PCR引物對，包括GTP1:5′-GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTATCAAAAACATAATCAAAACCAAAAC-3′和GTP2:5′-GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTTGAGATACAAATCAAACAAACACAAA-3′。

本發(fā)明首次從茶樹中克隆得到一種特異性咖啡堿合成酶基因啟動子，并將其構(gòu)建到植物表達(dá)載體中，在轉(zhuǎn)基因植物中驗證了該啟動子的活性，對于揭示茶樹咖啡堿合成的機(jī)理，生物調(diào)控茶樹咖啡堿的含量具有重要意義。

附圖說明

圖1為本發(fā)明實施例1中茶樹基因組DNA檢測結(jié)果；其中，M：DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)，1-2：茶樹基因組DNA。

圖2為本發(fā)明實施例1中茶樹咖啡堿合成酶啟動子GTP1和GTP2特異性引物PCR檢測結(jié)果；其中，M：DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)，1-2：PCR產(chǎn)物。

圖3為本發(fā)明實施例2中攜帶有重組載體pKGWFS7-TCSP的農(nóng)桿菌PCR鑒定結(jié)果；其中，M：DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)，1-3：帶有重組載體pKGWFS7-TCSP的農(nóng)桿菌(假陽性克隆)，4-10：帶有重組載體pKGWFS7-TCSP的農(nóng)桿菌(陽性克隆)。

圖4為本發(fā)明入門載體pDONR221的質(zhì)粒圖譜。

圖5為本發(fā)明目的載體pKGWFS7的質(zhì)粒圖譜。

圖6為本發(fā)明實施例2中轉(zhuǎn)基因煙草葉片茶樹咖啡堿合成酶基因啟動子調(diào)控GUS基因表達(dá)的結(jié)果；其中，A：陰性對照(野生型煙草)；B：陽性對照(pKGWFS7空載體)；C：重組載體pKGWFS7-TCSP。

具體實施方式

以下實施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。若未特別指明，實施例均按照常規(guī)實驗條件，如Sambrook等分子克隆實驗手冊(Sambrook J&Russell DW,Molecular Cloning:a Laboratory Manual,2001)，或按照制造廠商說明書建議的條件。

實施例1茶樹中咖啡堿合成酶基因啟動子TCSP的克隆

1.1提取基因組總DNA(Biomiga試劑盒)

(1)稱取約0.2g舒茶早茶樹嫩葉于預(yù)冷的研缽中，加適量的液氮研磨至粉末狀。

(2)將粉末轉(zhuǎn)移至2ml的離心管中，立即加入900μl Buffer P1和10μlβ-巰基乙醇，瞬時渦旋后置于65℃水浴鍋中，水浴10min，期間顛倒混勻3-4次。(在水浴前加入5μl RNaseA)

(3)加入140μl Buffer P2，旋渦震蕩混勻。在13000rpm下離心10min。

(4)小心吸取上清移至新的2ml離心管中，避免吸起沉淀，加入0.5倍體積的P3混勻后，加入混合液0.5倍體積的無水乙醇，充分顛倒混勻。

(5)將一個DNA吸附柱插入2ml收集管，將樣品液加入吸附柱中，12000rpm離心30s，倒掉廢液，將吸附柱重新插入收集管中。

(6)加入650μlDNA Wash Buffer(已加入乙醇)，12000rpm離心30s，倒掉廢液，將吸附柱重新插入收集管中。

(7)加入450μl DNA Wash Buffer漂洗，離心后倒掉廢液將吸附柱重新插入收集管中。

(8)13000rpm開蓋離心1min。

(9)將DNA吸附柱插入1.5ml離心管中，向吸附柱中加入100-150μl Elution Buffer(65℃預(yù)熱)。室溫靜置2min，13000rpm離心1min。重復(fù)掛柱。

(10)電泳檢測DNA的完整性：取1-2μl樣品DNA點樣，用1％的瓊脂糖凝膠快速電泳30-40min，檢測DNA完整性。使用核算定量儀檢測樣品DNA是否有污染，濃度404ng/μl，D260/280(1.8-2.0)，D260/230(1.8-2.0)。將樣品放入-20℃保存。茶樹基因組DNA檢測結(jié)果見圖1。

1.2基因組DNA酶切及純化

(1)基因組DNA酶切

選用Stu I,Pvu II,EcoR V,Dra I四種限制性內(nèi)切酶，分別對茶樹基因組DNA進(jìn)行酶切，酶切反應(yīng)體系為：

上下輕輕顛倒均勻，37℃水浴2h后，慢速渦旋5-10s，37℃酶切過夜。

酶切結(jié)束后，每個反應(yīng)體系中取5μl在1％瓊脂糖凝膠電泳檢測酶切效果，若電泳呈均勻的涂抹狀表示酶切完全。

(2)酶切產(chǎn)物的純化

1)在每個反應(yīng)體系中加入等體積酚，慢速渦旋5-10s后，短暫離心使水相和有機(jī)相分離。

2)用移液器將上層水相轉(zhuǎn)移至一新1.5ml的離心管中，棄有機(jī)相。

3)然后在每個離心管中加入等體積的氯仿，慢速渦旋5-10s后，短暫離心使水相和有機(jī)相分離。

4)用移液器將上層水相轉(zhuǎn)移至一新的1.5ml離心管中，棄有機(jī)相。

5)在每個離心管中加入2倍體積預(yù)冷的95％乙醇，1/10體積的3M乙酸鈉(pH4.5)，20g糖原，慢速渦旋5-10s后，15000rpm，離心10min.

6)將上層液體慢慢倒出，加入預(yù)冷的80％乙醇100μl洗滌沉淀。

7)15000rpm，離心5min，緩慢倒出上清后，室溫干燥沉淀。

8)用20μl TE(10mM Tris，0.1mM EDTA，pH7.5)溶解沉淀。

9)慢速渦旋5-10s后，各取1μl在1％的瓊脂糖凝膠上樣檢測純化后的DNA質(zhì)量。

1.3接頭與酶切產(chǎn)物的連接

反應(yīng)體系需要建立4個連接反應(yīng)，即茶樹基因組DNA酶切產(chǎn)物分別與試劑盒所提供的接頭相連接。具體操作步驟如下：

(1)從每個離心管中，各取4μl經(jīng)過限制性內(nèi)切酶Stu I，Pvu II，EcoR V，Dra I酶切和純化的DNA分別到新的0.5ml的離心管中，然后依次加入：

BD Genomewalker Adaptor(25μM) 1.9μl

10×Ligation Buffer 1.6μl

T₄DNA Ligase(6Units/μl) 0.5μl

(2)16℃，連接過夜。

(3)70℃，5min，以終止反應(yīng)。

(4)在每個管中，加入72μl TE(10mM Tris，1mM EDTA，pH7.5)，慢速旋渦10-15s后,短暫離心后，分別得到DNA library-Stu I,DNA library-Pvu II,DNA library-EcoR V,DNA library-Dra I，置于-20℃冰箱待用。

1.4特異性引物GSP1與GSP2的設(shè)計與合成

在進(jìn)行PCR擴(kuò)增之前，要對咖啡堿合成酶(TCS)基因的已知cDNA序列進(jìn)行分析和引物設(shè)計。在引物設(shè)計過程中，要保證特異性引物GSP1與巢式引物GSP2不能重疊，且所設(shè)計的特異性引物應(yīng)盡可能的接近已知序列的5′端。同時，所設(shè)計的基因特異性引物應(yīng)當(dāng)有25-30個核苷酸長度，GC含量在40-60％之間，推薦的退火溫度為67℃，并且基因特異性引物GSP1、GSP2分別與試劑盒(BD Genomewalker Universal Kit,Clontech,USA)提供的接頭引物AP1、AP2配對良好。

在保證以上原則的基礎(chǔ)上，使用DNAStar和Primer Premier 5軟件對Genbank上已經(jīng)登錄的茶樹咖啡堿合成酶cDNA序列(AB031280.1)設(shè)計基因特異性引物GSP1和GSP2，并交由上海生工合成。引物序列分別為：

GSP1:5′-CACAACCCAAGTCCGCTGCGTTAAGA-3′

GSP2:5′-AACAACACTTCGTTCACCTTCCCCGC-3′

AP1:5′-GTAATACGACTCACTATAGGGC-3′

AP2:5′-ACTATAGGGCACGCGTGGT-3′

1.5巢式PCR進(jìn)行一次擴(kuò)增

(1)標(biāo)記四個PCR管，依據(jù)下面的加樣量混合樣品：

渦旋混勻，并短暫離心后，再加入模板，即各取2μl的DNA library-Stu I,DNA library-Pvu II,DNA library-EcoR V,DNA library-Dra I于上述PCR管中，短暫離心，使溶液集于管底。

(2)將四個混合體系置于PCR熱循環(huán)儀中，使用下面的兩步法進(jìn)行PCR擴(kuò)增。98℃預(yù)變性3min，按94℃30s，67℃30s，72℃95s，循環(huán)30次，再72℃15min，使用1.2％的瓊脂糖凝膠上樣檢測PCR產(chǎn)物。

1.6巢式PCR進(jìn)行二次擴(kuò)增

(1)取四個0.5ml離心管，分別取1μl上述PCR產(chǎn)物與49μl ddH₂O于離心管中混勻并短暫離心，分別得到四個經(jīng)稀釋的PCR產(chǎn)物作為巢式PCR模板。

(2)標(biāo)記四個PCR管，依據(jù)下面的加樣量混合樣品：

混合后，渦旋混勻，并短暫離心后，各取48μl混合液于四個PCR管中，再分別加入2μl上述經(jīng)稀釋的巢式PCR模板于上述PCR管中，短暫離心，使溶液集于管底。

(3)將四個混合體系置于PCR熱循環(huán)儀中，使用下面的兩步法進(jìn)行PCR擴(kuò)增。98℃預(yù)變性3min；94℃30s，67℃30s，72℃95s，循環(huán)30次；72℃15min，使用1.2％的瓊脂糖凝膠上樣檢測PCR產(chǎn)物。

(4)將電泳結(jié)束后的特異性條帶切膠，回收并進(jìn)行連接，轉(zhuǎn)化后送樣至上海生工進(jìn)行測序。

1.7目的基因的連接轉(zhuǎn)化

取PCR純化產(chǎn)物6.5μl，PMD18-T 0.5μl，SolutionⅠ混合均勻，放入16℃水浴過夜后放在冰上；將混合液加入25μl感受態(tài)中中，混勻，冰浴30min，每隔10min輕彈一次；42℃熱激45s，立刻置于冰上3min。加入500μl LB液體培養(yǎng)基，200rmp 37℃，1h。取50-100μl均勻涂于含有AMP的固體LB上，放入37℃，過夜培養(yǎng)。

1.8菌落PCR與陽性檢測

挑菌劃線，培養(yǎng)5-6h，再挑菌進(jìn)行菌落PCR。菌落PCR體系：rTaq mix 25μl，上下游引物各1μl，用牙簽挑單菌落加入PCR管中混勻，加入ddH₂O至50μl，離心混勻，混合液等量分裝于四個PCR管中，短暫離心，使溶液集于管底。PCR程序：95℃3min預(yù)變性；98℃10s，67℃30s，72℃95s，循環(huán)30次；72℃15min。對PCR產(chǎn)物進(jìn)行電泳檢測并送到上海生工進(jìn)行測序，選擇搭接序列正確的單克隆。將含有目的基因的陽性菌落保菌并提質(zhì)粒。將樣品放入-20℃保存。

1.9茶樹咖啡堿合成酶基因啟動子TCSP的擴(kuò)增

根據(jù)克隆得到的啟動子序列設(shè)計特異性引物GTP1和GTP2，驗證空載體的引物為EGFP-C和EGFP-N：

GTP1:5′-GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTATCAAAAACATAATCAAAACCAAAAC-3′,

GTP2:5′-GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTTGAGATACAAATCAAACAAACACAAA-3′

EGFP-C:5′-CATGGTCCTGCTGGAGTTCGTG-3′

EGFP-N:5′-CGTCGCCGTCCAGCTCGACCAG-3′

PCR擴(kuò)增

(1)標(biāo)記一個PCR管，依據(jù)下面的加樣量混合樣品：

渦旋混勻，并短暫離心后，混合液等量分裝于四個PCR管中短暫離心，使溶液集于管底。

(2)將四個混合體系置于PCR熱循環(huán)儀中，按照以下程序進(jìn)行PCR擴(kuò)增。98℃預(yù)變性3min；94℃30s，73.5℃30s，72℃95s，循環(huán)30次；72℃15min，使用1.2％的瓊脂糖凝膠上樣檢測PCR產(chǎn)物。檢測結(jié)果見圖2。

PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的長度為1357bp，將其命名為茶樹咖啡堿合成酶基因啟動子TCSP，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。用PlantCARE啟動子在線分析其功能元件，分析結(jié)果見表1。

實施例2煙草轉(zhuǎn)基因植株的構(gòu)建及啟動子活性的驗證

使用Gateway技術(shù)將啟動子序列導(dǎo)入植物表達(dá)載體(pKGWFS7)中，構(gòu)建重組植物表達(dá)載體，命名為pKGWFS7-TCSP，并采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的煙草遺傳轉(zhuǎn)化法，通過表達(dá)GUS基因的方式進(jìn)行啟動子活性的功能驗證。

2.1載體構(gòu)建及鑒定

(1)BP反應(yīng)

體系置于25℃下溫育過夜，反應(yīng)后，加2μl 2μg/μl的Proteinase K在37℃下處理10min，再將BP反應(yīng)產(chǎn)物(入門載體)轉(zhuǎn)入50μl大腸桿菌Trans1-T1中，在含Kan的LB板上篩選，檢測獲得陽性單菌落后提取質(zhì)粒并放入-20℃保存。

(2)LR反應(yīng)

體系置于25℃下溫育過夜，反應(yīng)后，加2μl 2μg/μl的Proteinase K在37℃下處理10min，再將反應(yīng)產(chǎn)物轉(zhuǎn)入50μl大腸桿菌Trans1-T1中在含Spec的LB板上篩選，檢測獲得陽性單菌落后提取質(zhì)粒并放入-20℃保存。將構(gòu)建得到的重組植物表達(dá)載體命名為pKGWFS7-TCSP。

2.2將載體pKGWFS7-TCSP用電擊法導(dǎo)入農(nóng)桿菌

取5μl的重組載體和空載(pKGWFS7)質(zhì)粒加入50μl的EHA105農(nóng)桿菌感受態(tài)中，混勻后冰浴30min，使用移液槍將混合液移至電擊杯中，用電轉(zhuǎn)儀在A9r模式下電擊兩次后，轉(zhuǎn)移到1.5ml的離心管中，加入1ml LB，放入28℃搖床中200rpm，3h。2000rpm離心后，將900μl上清小心吸出，留100μl將離心管底部菌體充分打勻后，均勻涂在含有rif和Spec的LB平板上，28℃培育2-3天。挑單克隆菌劃線，培養(yǎng)1-2天，再挑菌進(jìn)行菌落PCR。將陽性單菌落進(jìn)行搖菌并保存于-80℃。

攜帶有載體pKGWFS7-TCSP的農(nóng)桿菌PCR鑒定結(jié)果見圖3。載體pDONR221和pKGWFS7的質(zhì)粒圖譜分別見圖4和圖5。

2.3農(nóng)桿菌注射滲透法轉(zhuǎn)化煙草，煙草葉片GUS基因瞬時表達(dá)

(1)帶有轉(zhuǎn)化載體質(zhì)粒的農(nóng)桿菌和帶有空載體的對照菌株在含50mg/L的LB平板上劃線復(fù)蘇，挑取單菌落在含相同抗生素的LB液體培養(yǎng)基中搖菌過夜，菌液濃度達(dá)到OD₆₀₀值為0.8-1.2。

(2)菌液分別經(jīng)6000rpm離心10min棄去LB培養(yǎng)基，菌體懸浮于1/2MS中，并添加乙酰丁香酮(As)至終濃度200μmol/L，懸浮液的濃度調(diào)整到OD₆₀₀值為0.6-0.8左右，室溫靜置活化2h。

(3)用一次性注射器分別吸取菌液，在煙草葉片上將注射器壓在葉片上部，以手指抵住葉片下部，輕輕用力將注射器內(nèi)菌液壓送并滲透到葉片組織中，將整個葉片注射菌液。

(4)經(jīng)注射的煙草植株在25℃，暗處理下培養(yǎng)2-3d。

(5)剪取注射葉片進(jìn)行GUS組織化學(xué)染色檢測，葉片材料使用直徑為15mm的打孔器進(jìn)行打孔，并置于GUS染色液中，染色16h。

(6)分別用70％、80％、90％無水乙醇脫色至葉綠素完全除去，觀察對比有無GUS表達(dá)染色現(xiàn)象，記錄并拍照，結(jié)果見圖6。

從圖6可以看出，(A)陰性對照(野生型煙草)葉片上并沒有呈現(xiàn)藍(lán)色或藍(lán)色斑點，而(B)陽性對照(含有pKGWFS7空載體)葉片上的圓圈部分以及實驗組(C，含重組載體)整個葉片上GUS活性的部位或位點呈現(xiàn)藍(lán)色，表明該啟動子基因具有活性。

雖然，上文中已經(jīng)用一般性說明及具體實施方案對本發(fā)明作了詳盡的描述，但在本發(fā)明基礎(chǔ)上，可以對之作一些修改或改進(jìn)，這對本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是顯而易見的。因此，在不偏離本發(fā)明精神的基礎(chǔ)上所做的這些修改或改進(jìn)，均屬于本發(fā)明要求保護(hù)的范圍。

序列表

<110> 安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)

<120> 茶樹咖啡堿合成酶基因啟動子TCSP及其應(yīng)用

<130> PI201710390

<160> 9

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 1357

<212> DNA

<213> 茶樹 (Camellia sinensis)

<400> 1

atcaaaaaca taatcaaaac caaaacaaat tatcaaaatc aaatatgtct aacaaaatac 60

ataagaatac gaaaagtgta ctgaattttt gtattttttg tatttatatt tttggtaatt 120

agtaaatttt ttaaagattt tttttacaaa tattatactt tttaagtata tttatgttag 180

gtgtatctaa aaattttaaa aaattgctta gaatattaaa aaaaatttag tgaaaacaaa 240

aaaaaaaatg aaaaaaaaaa attcaatttt ctaaaaagtg aatcctgaaa attcaaacca 300

aacaaactaa atttgtcgtt agagtattaa ataatttctc tataagtgtt tgtcaatttt 360

agtacttctt ttaaagtctt aagattgata tttaaactca ttaaattgga tcagaattat 420

tttttaaagt ttttcgtaga tgggtcggat ttggaaatgt ttcttcctgc tcgccctagc 480

atgattatta atatatatta tgtacatgta aaattttact ataaatactt cttattgtat 540

gtattcttaa cttatattat acttttaagt tacacaaatt ttttttttca gttataatta 600

attttttttt gtagttgcga tcttatttta gttatgactc ataatatctc atgtattatt 660

tggttgactt tttttttgct tttttgtttt gactttaaag tatgaaatta tgtcattttt 720

tttttagtta taaggtgcat acgatacata ccctttaaat ttttcttgta tatacatatg 780

tacatattaa tatctgtata tatataattt acaaaatttt acttagaata aaaagatata 840

cttaaaatga aaaatgtatt tatttaagtt aatatttaag atgtaatgac taaatattaa 900

ggtgtaattt taattagctc gattttgatt ttaaattttt aactttgtct caatttggtc 960

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ttgtttatat gagtttgttg ggcaagttcg agattgtact agcaagattt taacgctagc 1320

ttgggaggga ttttgtgttt gtttgatttg tatctca 1357

<210> 2

<211> 55

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

ggggacaagt ttgtacaaaa aagcaggcta tcaaaaacat aatcaaaacc aaaac 55

<210> 3

<211> 55

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

ggggaccact ttgtacaaga aagctgggtt gagatacaaa tcaaacaaac acaaa 55

<210> 4

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

cacaacccaa gtccgctgcg ttaaga 26

<210> 5

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

aacaacactt cgttcacctt ccccgc 26

<210> 6

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

gtaatacgac tcactatagg gc 22

<210> 7

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

actatagggc acgcgtggt 19

<210> 8

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

catggtcctg ctggagttcg tg 22

<210> 9

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

cgtcgccgtc cagctcgacc ag 22