本發(fā)明屬于農(nóng)作物病害診斷和分子生物學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，特別是涉及一種反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)的體系及其應(yīng)用，該體系可用于同步檢測4種侵染辣椒的RNA病毒，達(dá)到準(zhǔn)確、快速、高效檢測的目的。

背景技術(shù)：

辣椒(Capsicum spp.)是茄科辣椒屬植物，因其果實風(fēng)味獨特和營養(yǎng)豐富而成為人們喜愛的蔬菜和調(diào)味品，還用于食品色素、醫(yī)藥及工業(yè)組分的提取，因此在美洲、歐洲、亞洲、非洲和大洋洲等地區(qū)廣為種植，隨著辣椒需求量和貿(mào)易量的加大，有進(jìn)一步擴大的趨勢。我國辣椒種植面積133萬hm²，經(jīng)濟總產(chǎn)值700億元，均居世界首位，辣椒還是貴州、云南、四川、重慶等省份貧困山區(qū)農(nóng)民的主要經(jīng)濟來源。病毒病是辣椒上一類重要病害，自上世紀(jì)70年代以來，隨著種植面積的不斷擴大、種植區(qū)氣候和耕作制度的變化，病毒病的發(fā)生呈現(xiàn)逐年上升趨勢，侵染后常常造成落花、落葉、落果，減產(chǎn)可達(dá)30％-70％，甚至絕收，已成為影響辣椒產(chǎn)量和品質(zhì)的重要限制因素之一。

目前，在世界范圍內(nèi)可侵染辣椒的病毒病原有49種之多，其中約15個大類的20種病毒能引起嚴(yán)重癥狀,在我國約有23種能引起病害癥狀的辣椒病毒病原。常見有黃瓜花葉病毒(Cucumber mosaic virus,CMV)、煙草花葉病毒(Tobacco mosaic virus,TMV)、辣椒脈斑駁病毒(Chilli veinal mottle virus，ChiVMV)、辣椒輕斑駁病毒(Pepper mild mottle virus,PMMoV)、番茄花葉病毒(Tomato mosaic virus,ToMV)、馬鈴薯Y病毒(Potato virus Y,PVY)、蠶豆萎蔫病毒2號(Broad bean wilt virus 2,BBWV2)、煙草脆裂病毒(Tobacco rattle virus,TRV)、辣椒內(nèi)源RNA病毒(Bell pepper endornavirus，BPEV)等。辣椒植株受病毒侵染后表現(xiàn)不同的癥狀，常見的有花葉、黃化、斑駁、皺縮、畸形、壞死、植株矮化等。但在自然界，同一辣椒植株同時遭受兩種或兩種以上病毒侵染(復(fù)合侵染)的情況非常普遍，復(fù)合侵染不僅能削弱寄主的抗性，加重病害癥狀，還使得病害的癥狀更加復(fù)雜，給病害識別帶來很大的困難，直接影響病害的及時防治。2016年貴州省貴陽市自然發(fā)生的辣椒病毒病為害嚴(yán)重，且病害癥狀復(fù)雜，經(jīng)小RNA深度測序和PCR鑒定發(fā)現(xiàn)是BBWV-2CMV、PVY、ChiVMV和CMV四種病毒侵染所致，因此生產(chǎn)上急需準(zhǔn)確、快速、簡便、易操作的方法同時鑒別多種病毒病害。

隨著分子生物學(xué)技術(shù)的長足發(fā)展，基于核酸操作的多項技術(shù)在病毒病害的檢測中發(fā)揮了巨大的作用，如多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)、實時熒光定量PCR、基因芯片、核酸等溫擴增等技術(shù)可同時檢測多個靶標(biāo)病原物，具有快速、準(zhǔn)確、樣品消耗少等特點。多重PCR(multiplex PCR)技術(shù)因其快速、靈敏、準(zhǔn)確等優(yōu)點已被廣泛應(yīng)用于病毒、細(xì)菌、真菌等病原物的檢測和鑒定，為病害的早期診斷發(fā)揮了巨大的作用。多重PCR是指在同一個PCR反應(yīng)體系中同時加入兩種或兩種以上的靶標(biāo)病原物的核苷酸模板和特異性引物對，通過一次反應(yīng)擴增片段大小不同的兩種或兩種以上的目的基因，從而同時區(qū)別兩種或兩種以上靶標(biāo)病原物?；诖嗽?，本發(fā)明建立了隸屬于雀麥花葉病毒科(Bromoviridae)黃瓜花葉病毒屬(Cucumovirus)的典型成員黃瓜花葉病毒(CMV)、馬鈴薯Y病毒科(Potyviridae)馬鈴薯Y病毒屬(Potyvirus)的辣椒脈斑駁病毒(ChiVMV)和馬鈴薯Y病毒(PVY)以及豇豆花葉病毒科(Comoviridae)蠶豆病毒屬(Fabavirus)的典型種蠶豆萎蔫病毒2號(BBWV2)等四種辣椒病毒的多重PCR檢測體系，該體系可以準(zhǔn)確、高效、快速的鑒定田間自然發(fā)病的辣椒標(biāo)樣，為辣椒病害的早期診斷和鑒定提供手段。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種用于同步檢測侵染辣椒的四種病毒的方法。該方法能夠準(zhǔn)確、高效、靈敏的同時檢測多種植物病毒病標(biāo)樣。

一種同步檢測BBWV2、PVY、ChiVMV和CMV四種辣椒病毒的多重RT-PCR方法，在同一PCR體系中，包含有如下特異性引物對：

擴增BBWV2的特異性引物的核苷酸序列為：

SEQ ID NO.1：5′-GCGTCCTGAGTTTGTTGTAGCG-3′，

SEQ ID NO.2：5′-CCTCCATCAAGCCTTGACCATATC-3′；

擴增PVY的特異性引物的核苷酸序列為：

SEQ ID NO.3：5′-CGGTTCGTTTGAATGCAAGC-3′，

SEQ ID NO.4：5′-CTTGCTGCTTCTCCCCTATGG-3′；

擴增ChiVMV的特異性引物的核苷酸序列為：

SEQ ID NO.5：5′‐TGGCTGTGCAAGTTACCTTC‐3′，

SEQ ID NO.6：5′‐ACCTGTGTGATGACGTGGGT‐3′；

擴增CMV的特異性引物的核苷酸序列為：

SEQ ID NO.7：5′-AAANCTTGTTTCGCGCATTCA-3′；

SEQ ID NO.8：5′-GAGGGAGGGTTCTGGGAACA-3′。

所述PCR體系中BBWV2、PVY、ChiVMV和CMV引物的摩爾比分別為2.5：1：2.5：1。

所述的PCR體系總體積25μL，其中含有cDNA 2μL、10mM dNTPs 3μL、rTaq 1.5U、25mM的MgCl₂ 1.5μL以及10μmol/L的BBWV2、PVY、ChiVMV及CMV上下游引物分別為0.5μL、0.2μL、0.5μL、0.2μL。

所述PCR擴增反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性3分鐘；94℃變性30秒、57℃退火45秒和72℃延伸90秒，共40個循環(huán)；最后72℃延伸10分鐘。

上述方法在同步檢測農(nóng)作物中四種辣椒病毒病原BBWV2、PVY、ChiVMV和CMV中的應(yīng)用。

所述農(nóng)作物為辣椒。

一種檢測試劑盒，含有上述四對引物。

本發(fā)明提供的BBWV2、PVY、ChiVMV和CMV四種病毒的特異性引物對，通過RT-PCR分別可以獲得1406bp,1202bp,600bp和376bp的單一的特異性條帶。通過對PCR反應(yīng)體系和反應(yīng)條件的優(yōu)化，建立了同步檢測上述4種病毒的多重RT-PCR方法，突破了同步檢測侵染辣椒的BBWV2、PVY、ChiVMV和CMV四種病毒的技術(shù)瓶頸，也可以為其他病毒病原的鑒定提供借鑒。具體發(fā)明內(nèi)容涉及到：1)病毒RNA的提??；2)特異性引物對的設(shè)計和特異性分析；3)四種病毒的PCR鑒定體系；4)基于單重PCR技術(shù)的多重PCR檢測方法的建立與優(yōu)化；5)多重PCR檢測方法靈敏度的測定。本發(fā)明的多重PCR反應(yīng)的最佳體系和條件經(jīng)優(yōu)化確定為：10mM dNTPs 3μL、rTaq 1.5U、25mM MgCl₂ 1.5μL，以及57℃的退火溫度。多重PCR擴增的最佳反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性3分鐘；94℃變性30秒、57℃退火45秒、72℃延伸90秒，共40個循環(huán)；最后72℃延伸10分鐘。

所述四種病毒的特異性引物對可作為組合同步檢測辣椒上的BBWV2、PVY、ChiVMV、CMV四種病毒，PCR檢測均能獲得單一的特異性條帶，可以用于鑒定4種辣椒病毒病。

所述四種病毒復(fù)合侵染的辣椒標(biāo)樣為田間自然發(fā)病植株，采集自貴州省農(nóng)業(yè)科學(xué)院試驗田，經(jīng)小RNA深度測序和PCR鑒定確認(rèn)攜帶BBWV2、PVY、ChiVMV及CMV四種辣椒病毒。

該檢測方法可制作成試劑盒用于檢測四種病毒。

相比于現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明具有以下優(yōu)點：

1.本發(fā)明首次提出在辣椒上同步檢測BBWV2、PVY、ChiVMV和CMV四種病毒；

2.本發(fā)明設(shè)計的檢測引物對具有特異性和兼容性，可以擴增同一標(biāo)樣中的四種病毒；

3.本發(fā)明優(yōu)化了PCR擴增的反應(yīng)體系和條件，在保證檢測結(jié)果可靠的前提下，極大地縮短了檢測時間，提高了檢測效率；本發(fā)明反應(yīng)體系靈敏性好，該多重PCR體系的檢測底線是10^-1cDNA。

4.本發(fā)明的檢測是在同一個PCR體系中經(jīng)過一次擴增反應(yīng)完成，既節(jié)約了病毒RNA和PCR擴增體系種的各種試劑，尤其是反轉(zhuǎn)錄酶、rTaq的使用量，最大程度的降低了檢測成本，也節(jié)約了人力。

附圖說明

圖1.四種病毒特異性引物的特異性示意圖.1-a為引物對BBWV2-F(SEQ ID NO.1)/BBWV2-R(SEQ ID NO.2)的Primer-Blast檢索結(jié)果；1-b為引物對PVY-F(SEQ ID NO.3)/PVY-R(SEQ ID NO.4)的Primer-Blast檢索結(jié)果；1-c為引物對ChiVMV-F(SEQ ID NO.5)/ChiVMV-R(SEQ ID NO.6)的Primer-Blast檢索結(jié)果；1-d為引物對CMV-F(SEQ ID NO.7)/CMV-R(SEQ ID NO.8)的Primer-Blast檢索結(jié)果

圖2.四種病毒特異性引物的PCR擴增結(jié)果

泳道M代表核酸標(biāo)準(zhǔn)分子量(DL2000DNA Marker),從上到下分別為2000bp、1000bp、750bp、500bp和 250bp；泳道1～4分別為辣椒標(biāo)樣中BBWV2、PVY、ChiVMV和CMV的特異性條帶；泳道5為健康植株的擴增結(jié)果(陰性對照)，未擴增到特異性條帶。

圖3.四種病毒特異性引物的兼容性PCR擴增結(jié)果

泳道M代表核酸標(biāo)準(zhǔn)分子量(DL2000DNA Marker),從上到下分別為2000bp、1000bp、750bp、500bp和250bp；泳道1為以四種病毒復(fù)合侵染的辣椒標(biāo)樣的總RNA為模板，用四種病毒的特異性引物同時擴增的結(jié)果；泳道2為健康植株；泳道3～6分別為BBWV2、PVY、ChiVMV、CMV四種病毒特異性引物的擴增結(jié)果。

圖4.多重PCR體系的優(yōu)化

A:退火溫度的優(yōu)化,泳道1～5分別為53、55、57、59和61℃；B:dNTPs用量的優(yōu)化,泳道1～5分別為1、2、3、4和5μL；C:rTaq用量的優(yōu)化,泳道1～5分別為0.5、1.0、1.5、2.0和2.5U；圖中M代表核酸標(biāo)準(zhǔn)分子量(DL2000DNA Marker),從上到下分別為2000bp、1000bp、750bp、500bp和250bp。

圖5.多重PCR體系的靈敏度測定。

泳道M代表核酸標(biāo)準(zhǔn)分子量(DL2000DNA Marker),從上到下分別為2000bp、1000bp、750bp、500bp和250bp；泳道1～4的cDNA濃度分別為10⁰～10^-3。

具體實施方式

下面結(jié)合具體實施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明，這些實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。

實施例1.辣椒葉組織總RNA的提取

采用美國Invitrogen公司的TRIzol reagent提取健康及被BBWV2、PVY、ChiVMV和CMV四種病毒復(fù)合侵染的辣椒植株的總RNA。操作步驟如下：1)取新鮮或冰凍的辣椒葉片加液氮充分研磨后，迅速轉(zhuǎn)移100mg干粉組織至經(jīng)液氮冷凍過的1.5ml經(jīng)DEPC處理的無菌離心管中；2)加入1mL TRIzol reagent，充分混勻，室溫靜置5分鐘；3)加入0.2mL氯仿，劇烈手搖15秒，室溫靜置2-3分鐘；12000g/4℃離心15分鐘；4)取上清，加入等體積的異丙醇，混勻，置冰上10分鐘；12000g/4℃離心15分鐘，去上清；5)沉淀中加入1mL預(yù)冷的75％乙醇(無菌DEPC水配制)洗滌，7500g/4℃離心5分鐘，重復(fù)洗滌沉淀3次；6)干燥沉淀，加DEPC處理的水50μL溶解，此即為辣椒總RNA。7)取1μL RNA溶液，用NanoDrop-2000紫外分光光度計測定RNA樣品的純度和濃度值。合格的樣品置于-70℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

實施例2.四種病毒特異性引物對的設(shè)計

根據(jù)NCBI公布的BBWV2、PVY、ChiVMV和CMV等四種病毒的核苷酸序列，采用Vector NTI軟件分別設(shè)計每種病毒的特異性引物對，每對引物退火溫度相似，具有一定的保守性，擴增產(chǎn)物不形成二級機構(gòu)，GC含量在40％-60％之間，四種引物之間堿基不互補，引物由上海生物工程有限公司合成(4種引物情況見表1)。

表1.BBWV2、PVY、ChiVMV和CMV四種病毒的多重PCR檢測體系中的特異性引物

實施例3.四對引物的特異性檢測

實施例2種所設(shè)計的四對引物分別可以檢測BBWV2、PVY、ChiVMV和CMV四種病毒。BBWV2所屬的蠶豆病毒屬(Fabavirus)共包括5種病毒，除BBWV2侵染辣椒外，其它四種病毒分別是蠶豆萎蔫病毒1號(Broad bean wilt virus 1，BBWV-1)、野芝麻輕型花葉病毒(Lamium mild mosaic virus，LMMV)、南瓜花葉病毒(Cucurbit mild mosaic virus，CMMV)和龍膽草花葉病毒(Gentian mosaic virus，GMV)，它們均不侵染辣椒。同樣，與CMV同屬于黃瓜花葉病毒屬(Cucumovirus)的另外三種--花生矮化病毒(Peanut stunt virus，PSV)、番茄不孕病毒(Tomato aspermy virus，TAV)和蛇鞭菊屬輕斑駁病毒(Gayfeather mild mottle virus，GMMV)，也均不侵染辣椒。而PVY和ChiVMV同屬于馬鈴薯Y病毒屬(Potyvirus)，采用二者的引物并未擴增出對方的條帶，說明二者的引物具有唯一性。

為了確保本發(fā)明所設(shè)計引物的特異性，采用NCBI的在線比對軟件Primer-BLAST(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/)對實施例2中所設(shè)計引物的特異性進(jìn)行了檢索。檢索設(shè)置擴增長度為100～2000bp，最大擴增產(chǎn)物長度為2000bp，檢索NR(All non-redundant GenBank CDS translations+RefSeq Proteins+PDB+SwissProt+PIR+PRF)數(shù)據(jù)庫的所有物種。結(jié)果顯示：以BBWV2-F(SEQ ID NO.1)/BBWV2-R(SEQ ID NO.2)為引物對的檢索結(jié)果共獲得6條長度為1406bp的可能的擴增產(chǎn)物，均屬于BBWV2，未檢索到其它物種(如圖1中1-a)；以PVY-F(SEQ ID NO.3)/PVY-R(SEQ ID NO.4)為引物對進(jìn)行檢索，共獲得長度為287條長度為1202bp、1條長度為1205bp的可能擴增產(chǎn)物，均屬于PVY(如圖1中1-b)，未查到其它物種；以ChiVMV-F(SEQ ID NO.5)/ChiVMV-R(SEQ ID NO.6)為引物對進(jìn)行檢索，共獲得2條長度為600bp的可能擴增結(jié)果(如圖1中1-c)，同屬于ChiVMV，均未查到其它物種；以CMV-F(SEQ ID NO.7)/CMV-R(SEQ ID NO.8)為引物對進(jìn)行檢索，共獲得280條長度為355～383bp的可能擴增結(jié)果(如圖1中1-d)，也均屬于CMV，且無其他物種基因擴出可能性。因此，說明本發(fā)明所設(shè)計引物具有特異性。

實施例4.四種辣椒病毒的RT-PCR體系

cDNA的合成：反應(yīng)總體積為20μL，其中辣椒總RNA(1μg/μL)1μL,下游引物(10μmol/L)2μL,DEPC處理的ddH₂O 8μL，混勻后90℃變性1min，立刻置冰上2min；再依次加入dNTPs(10mM)2μL,5×MMLV Buffer 4μL，M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶(Promega,USA)1μL以及RRI(Takara,China)0.5μL。混勻后，37℃孵育1hr,70℃10min。

PCR反應(yīng)體系：反應(yīng)總體積為25μL，其中cDNA 2μL,10×PCR Buffer(15mM Mg²⁺)2.5μL,dNTPs(10mM)2μL,上下游引物各0.3μL,rTaq(Takara,China)1U，加ddH₂O補齊25μL。擴增條件為94℃預(yù)變性3min，94℃30s、57℃45s和72℃90s共40個循環(huán)，最后72℃延伸10min。PCR擴增產(chǎn)物在1％瓊脂糖凝膠上電泳，電壓每厘米2伏，電泳1.5～2小時，紫外下觀察照像。電泳結(jié)果顯示：用BBWV2、PVY、ChiVMV和CMV各自的特異性引物分別擴增獲得了1406bp、1202bp、600bp和376bp的單一條帶(圖2泳道1～4)。

將電泳條帶回收、純化、連接到pEASY-T5載體(北京全式金生物技術(shù)有限公司)，采用凍融法轉(zhuǎn)化Trans-T1的感受態(tài)細(xì)胞(北京全式金生物技術(shù)有限公司)，選取3個PCR陽性單克隆，經(jīng)北京六合華大基因科技有限公司測序，采用Vector NTI軟件比對，結(jié)果表明獲得的BBWV2、PVY、ChiVMV和CMV四種病毒序列與原參考序列的一致性分別為98.3％、99.1％、99.2％、98.7％，均在98％以上，證明了擴增結(jié)果的正確性。

實施例5.四種病毒的多重RT-PCR體系的建立

多重PCR反應(yīng)是在一個PCR反應(yīng)體系中同時檢測多種病毒，因此多重PCR反應(yīng)體系中的RNA和引物均為多種病毒RNA和特異性引物對的混合物，其他設(shè)計如反轉(zhuǎn)錄酶、RNA聚合酶、dNTPs等的濃度相同。本發(fā)明中所用核苷酸模板為BBWV2、PVY、ChiVMV和CMV四種病毒同時侵染的辣椒植株的總RNA；引物為四種病毒特異性引物對的混合物，引物對的最佳比例為BBWV2：PVY：ChiVMV：CMV＝2.5：1：2.5：1，結(jié)果表明4對引物分別擴增到1406bp、1202bp、600bp和376bp的單一條帶，具有良好的兼容性(圖3，泳道1)。

PCR反應(yīng)體系的優(yōu)化：本發(fā)明對不同的退火溫度、dNTPs和rTaq濃度等做了優(yōu)化。退火溫度設(shè)置有53、55、57、59和61℃5個梯度；在25μL的總反應(yīng)體積中，dNTPs用量設(shè)置有1、2、3、4和5μL的5個梯度，rTaq用量設(shè)置有0.5、1.0、1.5、2.0和2.5U的5個梯度，優(yōu)化結(jié)果表明：最佳退火溫度為57℃，10mM的dNTPs 3μL和rTaq 1.5U(如圖4)。

最佳的多重RT-PCR體系為：cDNA合成反應(yīng)總體積為20μL，其中辣椒總RNA(1μg/μL)1μL,下游引物(10μmol/L)2μL,DEPC處理的ddH₂O 8μL，混勻后90℃變性1min，立刻置冰上2min；再依次加入dNTPs(10mM)2μL,5×MMLV Buffer 4μL，M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶(Promega,USA)1μL以及RRI(Takara,China)0.5μL?；靹蚝螅?7℃孵育1hr,70℃10min。取上述合成體系中的cDNA 2μL,10×PCR Buffer(15mM Mg²⁺)2.5μL,dNTPs(10mM)3μL,rTaq(Takara,China)1.5U，及BBWV2、PVY、ChiVMV、CMV上下游引物各0.5、0.2、0.5、0.2μL，加ddH₂O補齊25μL。

最佳反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性3分鐘；94℃變性30秒、57℃退火45秒、72℃延伸90秒，共40個循環(huán)；最后72℃延伸10分鐘。

PCR反應(yīng)產(chǎn)物在1％瓊脂糖凝膠上電泳，電壓每厘米2伏，電泳1.5～2小時，紫外下觀察照像。電泳結(jié)果顯示：用BBWV2、PVY、ChiVMV和CMV各自的特異性引物分別擴增獲得了1406bp、1202bp、600bp和376bp的單一條帶(圖3泳道3～6)。

實施例6.多重PCR體系的靈敏度測定

將按照實施例4獲得的cDNA濃度分別稀釋1，10，100和1000倍(即10⁰-10^-3)，其他PCR擴增條件不變，結(jié)果表明當(dāng)cDNA稀釋1倍和10倍時均能很好的檢測出BBWV2、PVY、ChiVMV和CMV四種病毒；當(dāng)稀釋100倍時，BBWV2條帶比較模糊，PVY、ChiVMV和CMV三種病毒能檢測到；但當(dāng)稀釋到1000倍時，已經(jīng)檢測不到BBWV2和PVY，ChiVMV和CMV在這四個濃度梯度下皆能檢測得到(如圖5)，因此，該多重PCR體系的檢測底線是10^-1cDNA。

實施例7多重RT-PCR體系的應(yīng)用

我們應(yīng)用建立的多重PCR體系對2016年采集自貴州省貴陽市的4株表現(xiàn)病毒病癥狀的辣椒標(biāo)樣進(jìn)行了檢測，結(jié)果顯示：樣品1和3中擴增到到BBWV、ChiVMV和CMV三種病毒，在樣品2和4中則擴增到BBWV、ChiVMV、CMV和PVY四種病毒。單克隆測序結(jié)果與參考序列的一致性均在98％以上，說明本發(fā)明建立的多重RT-PCR檢測體系可用于田間標(biāo)樣的檢測，且結(jié)果可靠。

SEQUENCE LISTING

<110> 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所

<120> 一種同步檢測4種辣椒病毒的多重PCR方法

<130> PP17009-ZWB

<160> 8

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 22

<212> DNA

<213> 擴增BBWV2的特異性引物

<400> 1

gcgtcctgag tttgttgtag cg 22

<210> 2

<211> 24

<212> DNA

<213> 擴增BBWV2的特異性引物2

<400> 2

cctccatcaa gccttgacca tatc 24

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 擴增PVY的特異性引物1

<400> 3

cggttcgttt gaatgcaagc 20

<210> 4

<211> 21

<212> DNA

<213> 擴增PVY的特異性引物2

<400> 4

cttgctgctt ctcccctatg g 21

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 擴增ChiVMV的特異性引物1

<400> 5

tggctgtgca agttaccttc 20

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> 擴增ChiVMV的特異性引物2

<400> 6

acctgtgtga tgacgtgggt 20

<210> 7

<211> 21

<212> DNA

<213> 擴增CMV的特異性引物1

<220>

<221> misc_feature

<222> (4)..(4)

<223> n is a, c, g, or t

<400> 7

aaancttgtt tcgcgcattc a 21

<210> 8

<211> 20

<212> DNA

<213> 擴增CMV的特異性引物2

<400> 8

gagggagggt tctgggaaca 20