1.一種同步檢測(cè)BBWV2、PVY、ChiVMV和CMV四種辣椒病毒的多重RT-PCR方法,在同一PCR體系中,包含有如下特異性引物:
擴(kuò)增BBWV2的特異性引物的核苷酸序列為:
SEQ ID NO.1:5′-GCGTCCTGAGTTTGTTGTAGCG-3′,
SEQ ID NO.2:5′-CCTCCATCAAGCCTTGACCATATC-3′;
擴(kuò)增PVY的特異性引物的核苷酸序列為:
SEQ ID NO.3:5′-CGGTTCGTTTGAATGCAAGC-3′,
SEQ ID NO.4:5′-CTTGCTGCTTCTCCCCTATGG-3′;
擴(kuò)增ChiVMV的特異性引物的核苷酸序列為:
SEQ ID NO.5:5′‐TGGCTGTGCAAGTTACCTTC‐3′,
SEQ ID NO.6:5′‐ACCTGTGTGATGACGTGGGT‐3′;
擴(kuò)增CMV的特異性引物的核苷酸序列為:
SEQ ID NO.7:5′-AAANCTTGTTTCGCGCATTCA-3′;
SEQ ID NO.8:5′-GAGGGAGGGTTCTGGGAACA-3′。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法,所述PCR體系中BBWV2、PVY、ChiVMV和CMV引物的摩爾比分別為2.5:1:2.5:1。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法,所述的PCR體系總體積25μL,其中含有cDNA 2μL、10mM dNTPs 3μL、rTaq 1.5U、25mM的MgCl2 1.5μL以及10μmol/L的BBWV2、PVY、ChiVMV及CMV上下游引物分別為0.5μL、0.2μL、0.5μL、0.2μL。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法,所述PCR擴(kuò)增反應(yīng)條件為:94℃預(yù)變性3分鐘;94℃變性30秒、57℃退火45秒和72℃延伸90秒,共40個(gè)循環(huán);最后72℃延伸10分鐘。
5.根據(jù)權(quán)利要求1-4任一所述的方法在同步檢測(cè)農(nóng)作物中四種辣椒病毒病原BBWV2、PVY、ChiVMV和CMV中的應(yīng)用。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的應(yīng)用,所述農(nóng)作物為辣椒。
7.一種檢測(cè)試劑盒,含有檢測(cè)BBWV2、PVY、ChiVMV和CMV四種辣椒病毒的引物物,其分別為:
擴(kuò)增BBWV2的特異性引物的核苷酸序列為:
SEQ ID NO.1:5′-GCGTCCTGAGTTTGTTGTAGCG-3′,
SEQ ID NO.2:5′-CCTCCATCAAGCCTTGACCATATC-3′;
擴(kuò)增PVY的特異性引物的核苷酸序列為:
SEQ ID NO.3:5′-CGGTTCGTTTGAATGCAAGC-3′,
SEQ ID NO.4:5′-CTTGCTGCTTCTCCCCTATGG-3′;
擴(kuò)增ChiVMV的特異性引物的核苷酸序列為:
SEQ ID NO.5:5′‐TGGCTGTGCAAGTTACCTTC‐3′,
SEQ ID NO.6:5′‐ACCTGTGTGATGACGTGGGT‐3′;
擴(kuò)增CMV的特異性引物的核苷酸序列為:
SEQ ID NO.7:5′-AAANCTTGTTTCGCGCATTCA-3′;
SEQ ID NO.8:5′-GAGGGAGGGTTCTGGGAACA-3′。